Abstract
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM), bir yüzeyin bir güç yanıtı araştırmak için bir konsol bağlı bir piramit şeklinde bir uca kullanır. Ucunun çökme görüntü topografisine dönüştürülebilen bir lazer ve bölümlere ayrılmış detektör tarafından ~ 10 pN ölçülebilir. Genlik modülasyonu veya "dokunarak modu" AFM bir görüntü üretmek için rezonans frekansında titreşen ise yüzeyi ile aralıklı temas probu içerir. Bir sıvı hücre ile birlikte kullanılan, dokunarak modu AFM gibi fizyolojik ilgili koşullarda proteinler gibi biyolojik makromoleküllerin görüntüleme sağlar. Dokunulduğunda mod AFM probu ve deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir tarama parametreleri çok sayıda sık ayarlamaları manuel ayar gerektirir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için, bu ayarlamalar çok zaman tüketir.
PeakForce Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM) bir kuvvet yanıtlayanların ölçerek bir görüntü oluştururnumune ile temas her noktada için tek başlarına eğrisi. ScanAsyst yazılım ile, PF-QNM otomatik olabilir. Bu yazılım otomatik olarak belirli bir örnek için ayar noktası, sürücü frekansı, tarama hızı, kazanç, ve diğer önemli tarama parametreleri ayarlar. Sadece bu süreç kırılgan sondaları ve örnekleri hem koruyor, önemli ölçüde yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için gerekli süreyi azaltır. PF-QNM sıvı AFM görüntüleme için uyumludur; Bu nedenle, biyolojik olarak ilgili malzemeleri görüntülenmesi için geniş bir uygulama alanına sahiptir.
Bu çalışmada sunulan yöntem, fotosentez R. gelen bir bakteriyel kırmızı ışık fotoreseptör, RpBphP3 (P3) görüntüler elde PF-QNM uygulanmasını açıklar onun ışık adapte devlet palustris. Bu yöntem kullanılarak, bireysel protein P3 dimerleri ve dimerlerin agrega bir görüntüleme tampon varlığında bir mika yüzeye gözlenmiştir. Uygun yüzey ayarlamalar ve / veya çözelti konsantrasyonu Bu yöntemle,genel olarak diğer ilgili biyolojik makromoleküller ve yumuşak malzemeler için uygulanabilir.
Introduction
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 1986 yılında buluşun (Şekil 1) bu yana yüzeyleri, ince filmlerin ve tek moleküllerin yapısal ve mekanik özelliklerin belirlenmesi için çok önemli bir araç haline gelmiştir. 1-3 sıvı hücreyi kullanarak, bu yöntemin fizyolojik olarak ilgili olan bir ortamda biyolojik makromoleküllerin çalışmaları ve hatta canlı hücrelerde özellikle faydalı olur. AFM geleneksel iletişim modu AFM, çünkü yumuşak bir malzeme veya yüzeyine gevşek bağlı molekülleri görüntülenmesinde kullanılmıştır 4-10 dokunulduğunda mod nedeniyle tipik olarak uygun değildir yanal kuvvetlerin neden zarar dirsek tarafından numune üzerinde uygulanan. 11 dokunulduğunda mod AFM ölçüde ucu aralıklı yüzeyine dokunmayın etmektense sürekli temas ederek bu güçleri azaltır. Bu modda, konsol veya yüzeye normal olarak rezonans frekansına yakın bir döndürülür. Benzer AFM modu başvurma, topografya analxy (uzaklık) bir fonksiyonu olarak z-piezo hareketini taslak haline getirilmesi suretiyle yzed.
Konsol dinamikleri ya da rezonans yanında oldukça kararsız olabilir; Bu nedenle, bir "kararlı durum" durumun dışına otomatikleştirmek için çok zorlu. Özellikle, bu dinamikleri örnek özellikleri ve tarama çevre hem de bağlıdır. Sert bir (er) yüzeyine adsorbe edilmiş yumuşak bir molekül için, molekül için bir iyi ayarlanmış geri besleme döngüsü yüzeyi geri besleme dalgalanmasına yol açabilir. Fazla akışkan Operasyonu konsolun ayarlama zorlaştırmaktadır. Sıcaklık veya sıvı düzeylerindeki değişiklikler set noktası, kazançlar ve diğer görüntüleme parametrelerin sürekli ayarlaması gerekir. Bu ayarlamalar, çok zaman tüketici ve kullanıcılar için zor olma eğilimindedir.
Tepe Kuvvetleri Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM), mod AFM dokunarak gibi, aralıklı örnek (Şekil 2) başvurarak yanal etkileşimleri önler. 12-15 </ Sup> Ancak, PF-QNM olmayan rezonans modu ve dokunarak modu AFM çok daha düşük frekanslarda çalışır. Bu çekme modu AFM, sıvı varlığında şiddetlenir özellikle de ayarlama zorlukları ortadan kaldırır. PF-QNM ile, görsel temas her noktada bir kuvvet yanıt eğrisi alınarak toplanır. ScanAsyst yazılım ilavesi ile, tarama parametrelerinin 15 ayar otomatik olabilir ve yüksek çözünürlüklü görüntü bile deneyimsiz kullanıcılar tarafından birkaç dakika içinde elde. Kullanıcı AFM daha aşina olduktan sonra, otomatik parametrelerden herhangi veya tüm görüntü kalitesi elle ince ayar yapmak için deneye izin herhangi bir zamanda devre dışı bırakılmış olabilir. Kuruluşundan bu yana, PF-QNM. Altmoleküler düzeyinde bakteriorodopsin, bir membran proteini ve diğer yerli proteinleri Haritayı uygulanmıştır bakteriyorodopsin için 16-18 protein esneklik ve X-ray kristalografik yapıları arasında doğrudan bir ilişki vardır. 12 PF -QNM yüksek çözünürlüklü canlı hücreler araştırmak için kullanılmıştır. Hücre bütünlüğü ve fonksiyonu için kritik olan eritrosit membran içerisindeki yapı ve mekanik arasındaki 19,20 Dahası, PF-QNM veri açıklığa kavuşturmaktadır önemli bağlantılar. 21
Biz 22 bacteriophytochromes (BphPs) denilen kırmızı ışık fotoreseptör yapısını incelemek için AFM, 23 de dahil olmak üzere, tarama prob mikroskobu (SPM) yöntemlerini kullanmışlardır. 24,25 Onlar kovalent bir sinyal-efektör modülüne böyle bağlantılı bir ışık algılama modülü oluşur histidin kinaz (HK) gibi. 26 ışık algılama modülü genellikle yapısal değişikliklere sinyal-efektör modülü ulaşan ve tüm protein küresel bir dönüşüm yol açan bir dizi, bir fotonun emilimi üzerine yapısal dönüşüme uğrar bir bilin kromofor içeren . Bu dönüşüm dayanarak 24,27-29, iki farklı ışık emici ler vardırBphPs, kırmızı ve uzak-kırmızı ışık emici devletin öngörmesi, Pr ve PFR olarak belirtilir. Pr en BphPs için, termal olarak kararlı, karanlığa adapte edilmiş halidir. Pr / Pfr Fotoçevrim moleküler temeli bütünüyle bağlı olarak, bu proteinlerin sınırlı yapısal bilgisine anlaşılamamıştır 28. D. Bir yapının haricinde radiodurans bu proteinlerin 30 bütün yayınlamış X-ışını kristalografik yapısı, karanlığa adapte edilmiş halde ve efektör yoksundur. Daha sonra, dokunulmamış BphPs etkin Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ile araştırılmıştır için çok büyük olan ve X-ışını kristalografisi için (özellikle ışık uyarlanmış halde) da bütün halinde kristalize etmek oldukça zordur. BphPs yakın kızılötesi floresan protein belirteçleri olarak tasarlanmış edilmiştir (IFP) 'ın., Bu proteinlerin 31 Yapısal karakterizasyon etkili IFP tasarım yardım daha fazla olabilir. 32-36
Bu makalenin odak için bir prosedür sunmaktırPF-QNM yoluyla sıvı hücre AFM kullanılarak BphPs görüntüleme. Bir yöntem olup, fotosentetik bakteri R'nin bacteriophytochrome RpBphP3, (P3) ışık adapte devlet çalışmalarla ortaya konmuştur palustris. Burada sunulan AFM prosedür proteinlerin görüntüleme için uygun ve basit bir yaklaşım hem de diğer biyolojik makro moleküller olduğunu. Bu yöntemle, tek tek moleküllerin yapısal detayları bir üst düzey bilim ders laboratuvar oturumu benzer zaman, kısa bir süre içinde tahsil edilebilir. Kesitlerini ölçmek ve daha boyutlu analiz tamamlayarak, deneysel veri yararlı hesaplama modelleri ile mukayese edilebilir. 37-42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bilgisayar ve Mikroskop Kurma
- N 2 silindir vanasını açın ve hava masa yüzen ve seviye sağlamak için kolları ayarlayın.
- Bu sırayla bilgisayar, kontrolör ve fiber optik ışık açın.
- AFM / LFM moduna tarayıcıyı ayarlayın ve AFM başının üzerinde kamera ortalamak.
- Açık yazılım. Seç deneme kategori "Nanomekanik Özellikleri", deney grubu altında "Niceliksel Nanomekanik Haritalama" ve deney altındaki "Sıvı içinde PeakForce QNM". Yük Deney ve ardından Kur'u tıklatın.
- Sahnenin yüzeyini görmek için Z objektif kullanarak kamerayı odaklanın. / Aşağı kaba kadar kullanılması piezos yaklaşık 1 mm AFM kafası açıklığı yüzeyinin altına sahne taşımak.
Mika Yüzey 2. Hazırlık
- Temiz bir örnek desteği disk (15 mm çapında, 0.8 mm kalınlıkta) bir yüzü üzerine bir yapışkan basın. Mika V-4 itinyapıştırıcı üzerine sınıf disk (25 x 25 x 26 mm) sıkıca bağlı kadar.
- Tamamen hava kabarcıkları ile yapıştırılır sağlanması mika üzerine şeffaf bir bantla bir parça sürün. Eşit bir şekilde tutunmaya bir taraftan mika kapalı bandını çıkarın. Mika düz sigortalamak için gerekirse tekrarlayın.
- Grip, destek diski, dairesel cımbız (Disk tutucular) bir çift ile temiz mika yan, ve tarayıcı üzerine yerleştirin. Mika AFM kafa deliğin seviyesinin altında olması gerekir.
3. Sıvı Hücre Montaj ve Mika Yüzey Görüntüleme
- Sıvı hücre, O-ring, şırınga adaptörü, hortum adaptörü, ve% 100 etanol fırlatma hortumu durulayın. DI suyla akışkan hücre durulayın. Tüm parçaları hava tamamen kurumasını bekleyin.
- Temiz sıvı hücre üzerindeki portuna hortum adaptörü itin. Yavaşça yassı başlı cımbız kullanarak sıvı hücre merkezi girinti içine O-ring basın.
- Prob tutucu klip üzerinde hafifçe yayı basın ve Groov uzak çevirmekBahşiş için e.
- Yassı başlı cımbız ile uzak ucundan uzun sonuna probu kavrayın. Hücrenin merkezine bakan ucu ile oluk içine sonda yerleştirin. Yayı itin ve (Şekil 1B) tespit etmek için sonda üzerinde tutma klibi ayarlayın.
- Tam olarak (Şekil 1C) geri çekilir sağlamak için AFM kelepçeyi edin.
- Sıvısı hücre, O-ring yerleştirin ve mika numune üstüne aşağı bakacak sınayın. Sıvısı hücre AFM Çıtçıt üzerine dinlenmeye bırakın. Sahnede sıvı hücreyi dengelemek için kelepçe indirin. Görsel muayene sıkıca destek disk ve sıvı hücre arasındaki sıkıştırılmış O-ring gösterene kadar mikroskop aşağı düğmesine basın.
- Monitörü izlerken, ekranın üzerindeki sıvı hücrenin üst görselleştirmek için kaba ayar düğmesini odaklanır.
- X / Y ayar düğmeleri ve Z objektif kullanarak ucu açık bir görüntü kalmayıncaya kadar mikroskop taşıyın. Ucu app olacakbir metalik, altın üçgen gibi kulak. Mikroskop altındaki piezo kolu ile numune yüzeyine yakın ucu hareket ettirin. Ucunun yansıması odaklanın. Onun yansıması ilişki içinde gerçek konsol takip edin. Bu aşamada, yakından uyumlu, ancak tamamen üst üste olmasına izin verilmemelidir.
- 1 ml steril bir şırınga şırınga adaptörü takın. Şırınga adaptör için çıkarma hortumun bir ucunu ve tampon çözeltisi kap içindeki hortumun diğer ucuna yerleştirin. Tamamen şırınga pistonu uzatmak.
- Sıvı hücre üzerinde hortum adaptörü hortumunu takın. Sıvı tamamen merkezi odasını doldurana kadar pistonu hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları vardır sigortalamak için hücreyi kontrol edin. Mikroskop üzerine sıvı hücreden dışarı dökülüp hiçbir sıvı olduğunu görmek için kontrol edin. Yükseltilmiş bir katı destek üzerinde şırınga.
- Ekranda lazeri (dağınık kırmızı nokta) bulmak için kamera beslemesini ve X / Y çeviri düğmeleri kullanın. Lazer cam hareketini kullanarak,ent kontrol düğmeleri, ucuna lazer taşıyın.
- (6 - değeri = 4) mikroskop görüntülenen toplam sinyali en üst düzeye kadar ince lazer ve ayna kontrolleri ayarlayın.
- (± 0.1) mümkün olduğunca sıfıra yakın mikroskop görüntülenen dikey ve yatay deplasmanlar düşürmek için sol arka tarafında düğmeleri ve tarama kafasının sol üst tarafında kullanarak kadranda diyot açısını ayarlayın.
- Yazılımında, satın alma seçenekleri seçin. Asgari seçin yüksekliği (iz ve Muvazzaf), pik kuvveti hata ve deformasyon at. Diğer seçenekler bağımlı kullanıcı ve deneye tarafından istenen belirli bilgilere dayanarak uygun olabilir.
- Her edinim pencerede RT Plane Fit "satırını" seçeneğini seçin. Yüksekliği pencerelerde OT Düzlem Fit "hiçbiri" seçeneğini seçin. Zaten bitmiş değilse X ve Y, sıfıra ofset ve tarama açısı ayarlayın.
- 1 Hz, 256 hat başına numune, ScanAsyst oto kontrol için tarama hızını ayarlamakbirey ve kapalı olarak ScanAsyst otomatik Z sınırı. 500 nm Z sınırı değiştirebilirsiniz. 1 um tarama boyutunu ayarlayın.
- Meşgul tıklayın. Bu noktada, uç yüzeyi yaklaşır. Ucu yaklaşırken, ekranın sol alt köşesinde Z piezo voltaj değişimini gözlemlemek. Ucu aralığının dışına çıkarsa, ucu ve yeniden bir yaklaşım çekilme. Bu başarısız olursa, ucu başarılı bir yaklaşım olması için değiştirilmesi gerekebilir. Ucu devreye girdikten sonra, satırları bir görüntü oluşturacaktır edinim pencerelerin her görünmeye başlayacak.
- 1 x 1 mikron de mika fotoğraf çekmek ve mika yüzey temiz ve düz olmasını sağlamak için yavaş yavaş yakınlaştırın. Göründükleri gibi görüntüleri kaydetmek için sürekli yakalama tıklayın. Büyüt ve istediğiniz gibi yüzeyi etrafında hareket ettirin.
4. Protein Biriktirme ve Görüntüleme için Numune Hazırlama
- Saflaştırılmış protein örneği 38 Edinme ve buz üzerinde tutmak. Bir Dondurucuda ise, üzerinde örnek çözülme5 dakika boyunca buz.
- / Ml buzdolabında kullanarak görüntüleme tampon çözeltisi 0.0010 mg protein sulandırmak. Burada kullanılan görüntü tamponu 15 mM Tris-HCI (pH = 8.0), 150 mM NaCI ve 15 mM MgCI2 olduğunu.
- 4 odacığı (100 x 15 mm) buzdolabında görüntüleme tampon solüsyonu ile Petri doldurun. Solüsyonun en azından her biri 5 mi oda doldurun. Yavaşça mikropipetöre sabit şekilde bağlı olan ucu ile seyreltilmiş protein çözeltisi karıştırılır.
- Hazırlanmamış mika yüzeyine seyreltilmiş protein çözeltisinin 200 ul uygulayın. 30 saniye sonra, dairesel cımbız (Disk tutucular) ile protein / mika yüzey pick up. Bench için örnek paralel tutun.
- Örnek tutarken örnek Petri kabı havza paralel olmasını sağlama hemen petri kabının (adım 4.2) birinci kadran içinde bulunan tampon çözeltisi içinde örnek bırakın. 1 saniye sonra, örnek çıkarın.
- Havzasına örnek paralel tutmaya devamPetri kabı, kalan üç çeyrek daire için adımı 4.5 tekrarlayın.
- Aşırı nem emmek ve mikroskop sahneye diski aktarmak için kuru tozsuz bir bez üzerine diski yerleştirin. Bezle gerçek yüzeyine dokunmayın. Örnek kurumasına izin vermeyin.
- 3.16 - Tekrar 3.6 adımları.
Mika 5. Görüntüleme Proteinler
- Ekranın sol tarafında onay parametreleri kutusuna tıklayın. Bahar boyutu ve uç yarıçapı ucu kullanılan dayalı ayarlanması gerekir.
- Meşgul tıklayın. Benzer şekilde, mika görüntüleme işlemi (aşama 3.17) için, uç yaklaşırken z piezo pencere izleyin.
- Izleyen en az iki geçiş için görüntü Tarayıcıyı aynı alanı izin verin. Toplanan her görüntüyü kurtarmak için sürekli yakalama tıklayın.
- Yeni bir bölgeye tarayıcıyı hareket ve / veya istediğiniz gibi görüntü boyutunu değiştirmek.
- Otomatik yazılım ayarlama bittikten sonratarama parametreleri belirli bir görüntü boyutu için, yazılımı kapatın.
- Elle ince ayar için görüntünün odağını tarama hızı, z sınırı, satır sayısını, ve gerilimini ayarlamak. Görüntü çok odak dışı olursa, özgün başlangıç konumunu geri geri yazılım açın. Bir protein yakınlaştırma sırasında bir görüntünün çözünürlüğünü artırmak için, tarama hızı azaltmak ve orantılı hatlarının sayısını artırmak.
- Deneyden sonra,% 100 etanol ile sıvı haznesini temizlemek DI H2O ile yıkayın Sıvı hücre tamamen kurumasını bekleyin.
- Ham veri görüntüleri işlemek için veri yazılımını açın. İlk olarak, düzleştirmek ikonuna tıklayarak görüntüyü düzleştirmek. Sipariş inci Zero seçin ve yürütmek tıklayın. Görüntüye bağlı olarak, uygun bir şekilde uygun düzlem düz görüntü elde etmek için gerekli olabilir. Bu durumda, düzlem uyum simgesini seçin ve imleci kullanarak görüntünün düz bir alanda bir uçak çizin. Yürütmek tıklayın. Gerektiği kadar tekrarlayın
- Selvb kesit sekme proteinin boyutların ölçülmesi. Imleç ile bir çizgi analiz edilmesi molekülü veya alan üzerinde hareket çizin. Birden fazla alanlar için tekrarlayın ve yazılım bir bindirme oluşturur. Resmi veya diğer yazılım ve çizim programlarına uyumlu bir formatta resim oluşturmak için kullanılan verileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hafif uyarlanmış halde bir fotoreseptör protein, P3, temsili AFM görsel, Şekil 3 ve 4'te sunulmaktadır. Bir taze kırılmış mika alt-tabaka (Şekil 3A) protein adsorpsiyonu için uygun, düz bir yüzeydir. Bir negatif kontrol olarak, temiz mika bir görüntü toplama çeşitli nedenlerle önemlidir. İlk olarak, sıvı hücre temiz temin edilmiş olup, önceki deneylerden elde edilen herhangi bir kalıntı malzemeler yüzey kirletecektir. İkinci olarak, bu sonda kalitesini test eder. Prob kirli veya deforme olursa, bu çizgiler gibi resimde görünen ya da gürültü olarak kendini sunacak. Son olarak, temiz bir mika görüntü prob uygun gelecek deneyler için ayarlanmış olabilir onaylar.
Tek fotoreseptör proteini dimerleri, yüzey kaplama (Şekil 3B, C), uygun ise, PeakForce QNM kullanılarak gözlemlenebilir. Oklar ayrı sinyal dimerler; Yıldız işareti bir protein agrega gösterir.protein örnek, çökelme süresi, ve görüntüleme tamponunun iyon kuvvetinin konsantrasyonu, yüzey kaplama etkileyebilir. 23 tek moleküllerin yüksek bir dağılımı için, çok kısa bir çökelme zamanları gerekmektedir sahip seyreltik çözeltiler. Örneğin, yerleştirme süresi iki katına daha büyük agrega yüksek bir dağılımı elde edilir. Protein konsantrasyonu 0.100 mg arttırılırsa / ml fotoreseptör ince bir film biriktirme zamanının değiştirilmesi veya iyonik güçte tampon olmadan görülmektedir.
Görüntü (Şekil 4), düzleştirilmiş sonra imaj analiz yazılımı kullanılarak, proteinlerin kesitleri ölçülebilir. Çapraz kesitler ilgili yüksekliği ölçümlerle oksi-veri sağlar. Bu ölçümler, vb yapısal detaylarının, protein / yüzey etkileşimlerini, mekanik mukavemet, XY veri AFM prob tarafından dolaştırılmış edilebilir temin etmek üzere kullanılabilir; ancak, bu etki daha keskin bir prob ile en aza indirilebilir. Aslında, CHOProbun buz konvolüsyon kabul edilebilir bir miktarı ve bir keskin bir prob ile zarar görüntülü malzemenin direnci arasında hassas bir dengedir. Gerekirse İpucu büklüm da uygun bir yazılım kullanarak, görüntüden çıkarılır olabilir.
Bu resimler doğrudan dokunarak modu AFM kullanılarak toplanan önce yayınlanan görüntülere göre olabilir. PeakForce QNM kullanarak mika P3 20 ölçülen boyutları dokunarak-mod AFM ile elde edilen değerlerin% 5 içinde bulunmaktadır.
1. Sıvı Hücre Atomik Kuvvet Mikroskobu Şekil. (A) Lazer, konsol, prob ve yüzey hizalama. Probu ve konsol sıvı hücre içine yapıştırılmıştır. (B) Likit hücresi. Sonda, konsol ve örnek tamamen sıvı içine daldırılmaktadır. (C) Complete montaj. Sıvı hücre, bir mikrometre takılır. Resim, sıvı hücreye ilişki içinde optik kafa ve tarayıcıyı gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. PeakForce Sayısal Nanomekanik Gayrimenkul Haritalama Bu küçük bir tepe kuvveti için bir illüstrasyon (A) Yaklaşım (B) Atlama (C) Tepe Kuvveti (D) Yapışma (E) çekin başvurun.. Şekil çoğaltılamaz ve izni ile uyarlanmıştır. 15
Mika üzerinde P3 Şekil 3. Atomik Kuvvet Mikroskobu. Temiz mika (1 x 1 mikron) (A) Görüntü. (B) Resim (1 mikron x 1 mikron) P3 mika uygulanır. Oklar Tek bir protein dimerlerin örnekleri göstermektedir. Yıldız işareti proteini dimerleri bir agregatı temsil eder. Iki proteini dimerleri (c) Görüntü (170 x 170 nm), tek bir dimerinin üç boyutlu bir ilavesi ile. Şapka içerlek mevcut olan protein dimeri işaret etmektedir. Tüm görüntüler görüntüleme tampon varlığı (çökelme için protein konsantrasyonu = 0,0010 mg / ml) alındı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mika üzerinde P3 Şekil 4. Kesit Analizi. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM fizyolojik ilgili koşullarda proteinler ve diğer biyolojik makromoleküllerin görüntüleme tamamen yetenekli bir tarama prob mikroskop yöntemidir. X-ışını kristalografisi ve NMR ile karşılaştırıldığında, AFM biri sınırlama aynı çözünürlüğü, özellikle yanal çözünürlük elde etmek için onun yeteneksizliği. Herhangi bir yüzey üzerinde bir molekül analiz etmek için kullanıldığında, AFM veriler incelendiğinde, molekülün görüntü yüzeyinin etki ve sonda da göz önüne alınmalıdır. Elde edilen görüntünün üzerine sondanın etkisi açarak, uygun yazılım ile tamamlanabilir. Deneysel sonuçlarla karşılaştırmak için teorik modellerin geliştirilmesi de oldukça yararlı olabilir kanıtlayabilirim.
Bu yazıda, bir bakteriyel kırmızı ışık fotoreseptör, RpBphP3 (P3) AFM görüntüleri (Şekil 3) sunulmuştur. Mikroskop takımı ve yazılım işleminin tanımları kullanılan belli alet modele özel olmakla birlikte, mikave protein numune hazırlama işlemleri genel ve herhangi bir deney AFM tatbik edilebilir.
Bu protokolün bir birkaç kritik adım mika yüzeyi üzerindeki istenen protein kapsama elde edilmesi için izlenmelidir. Bu mika yüzey (adım 4.3) tatbik edilmeden önce ilk olarak, seyreltilmiş protein çözeltisi yavaşça karıştırılmalıdır. P3 nedeniyle yüksek molekül ağırlığına, çözelti, tevdiat oldukça koloidal olduğu; Bu nedenle, P3 çözelti homojen olmayan hale zamanla tüpün altına yerleşir. Nazik heyecan ilaçlar bu sorunu. Protein uygulandıktan sonra ikinci olarak, yüzey herhangi bir gevşek olarak bağlanmış moleküller, (- 4.6 adım 4.5) kaldırmak için durulanmalıdır. Gevşek bağlı P3 yüzeyde kalması durumunda sıvı hücre tampon çözeltisi ile doldurulmuş ve / veya deney sırasında AFM prob tarafından alındığı zaman moleküller ya çözelti içinde serbest bırakılır. Bu olayların her ikisi de başarılı bir görüntüleme deney engellemektedir. EğerSıvı-hücre P3 ile kirlendiği, bu sökülmeli ve iyice temizlenmelidir. AFM prob molekülü alıyorsa, genellikle değiştirilmesi gerekir veya görüntü kalitesi feda edilmektedir. Son olarak, protein örneği durulama yöntemi mükemmel görüntüler elde etmek için önemlidir. Mika P3, seçici olmayan bir yüzey; Bu nedenle, moleküller rasgele yönelimli olduğu bulunmuştur olmalıdır. Protokolde tarif edilen bir yöntem ile çalkalanması adımlarından oluşur tek bir konuma getirilmesi yüzeyinin moleküllerinin yeniden düzenleme önlemek için bir yöntemdir. Anahtarı her zaman ıslak numunenin tutmak ve açı tutma yüzeyi ve tam anlamıyla tamponu ile yüzeye tatbik kaçınmaktır. Örnek bir Petri kabı havzasının paralel tutarak, daldırma ile durulanır ise, tampon solüsyonu kuvveti akımlarıyla yüzeyi üzerinde P3 bozulma en aza indirilmiştir.
Sıvı hücre, prob, tarayıcı ve optik kafa tüm parçaların çok hassas ve dikkatle ele alınması gerekir. SprinTarayıcı ve optik kafa tutmak gs birbirine çok güçlü. Bu montaj veya parça herhangi söküm zaman tarayıcı üzerinde bir eli tutmak zorunludur. Protokolde tarif edildiği gibi orjinal tarama boyutu 1 um (adım 3.16) ise, yazılım ScanAsyst PF-QNM için, bu Z-limit otomatik yazılım kontrolü kapatın ve en az 500 nm bu değeri ayarlamak için esastır . Bu yüzey beklenmedik pürüzlü hale gelmiştir veya kontamine olmuştur eğer tarayıcıyı korur. Tek bir görüntü toplanmıştır ve görüntülü alanı düzgündür olduğu onaylandıktan sonra, Z-sınırı daha yüksek çözünürlükte resimler elde etmek için aşağı doğru el ile ayarlanabilir. Bu tarayıcı yüzeyinin yeni bir bölgeye taşındığında veya uç herhangi bir nedenle geri çekilir ise en az 500 nm geri Z-limitini yeniden ayarlamak için önemlidir.
Bu kağıt, yüksek kaliteli topografik görüntü elde etmek için PF-QNM kullanarak odaklanmış olsa da, bu yöntem kendisi sağlayabilirmekanik mukavemet ve yüzey yapılarının esnekliği hakkında ek bilgi kütüphanesi. Bu özellik, basit bir deney sırasında, uygun kanalların seçilmesi ile ilgili işlevselliği kavrayışlar yol açabilir. 16,18, tevdiat çözeltisi ve / veya yüzey konsantrasyonuna uygun değişiklikler ile, bu yöntem araştırmak için PF-QNM kullanımı için genel olabilir Sıvı hücre AFM ile biyolojik makromoleküller. Yazılım otomatik yardımıyla, AFM ile önceden hiçbir deneyimi ile üst düzey bilim derslerinde öğrencilerin geleneksel çekme modu, AFM ile çok daha hızlı bir şekilde sıvı-hücre AFM deney tamamlayabilirsiniz. Öğrenciler AFM temel deneyim ve tipik bir 3 içinde bu güçlü tekniği ile mümkün disiplinler arası araştırma bir tat alabilirsiniz - 4 saat laboratuar bölümünde zaman kısıtı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NSF-MR program (CHE: 1229103) yeni kontrol elektroniği, yazılım, sıvı hücreleri ve bir çift AFM / STM montajı için gerekli diğer ekipmanların satın finansman için kabul edilmektedir. Biz AFM enstrümantasyon, eğitim ve görüntüleme ile yardım Chicago NSF-MRSEC programının Üniversitesi (DMR-0820054) de ortak tesisler kabul ve enstrüman süre Malzeme Araştırma Olanakları Ağı (DMR-0820054) hazır. Biz özellikle bizim kampüs için gerekli enstrümantasyon getirdi NSF-MR teklifin finansmanı önce öğrencilerimizi ağırlamak için Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller ve Prof Ka Yee Lee teşekkür ederim. Sarf malzemeleri için yaz araştırma öğrenci ve öğretim burslarını yanı sıra destek sağladı Northeastern Illinois Üniversitesi'nde verilir: (P031C110157 ID) Biz Başlık III KÖK hibe fon yny. Son olarak, biz devam enstrümantal destek ve r için izin Bruker-Nano, Inc kabulPeakForce QNM mekanizmasını gösteren bir arsa eproduce ve otomatik yazılım açıklamak için kelime ScanAsyst kullanımı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K.
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B.
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A.
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
