Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב Published: December 13, 2014 doi: 10.3791/52240
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Baylor University

Summary

רמת המצב היציב של mRNAs הספציפי נקבעת על ידי קצב הסינתזה והריקבון של mRNA. שיעורי השפלה mRNA הגנום או שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי יכולים להימדד על ידי קביעת זמן מחצית חיים mRNA. פרוטוקול זה מתמקד במדידה של שיעורי ריקבון mRNA בSaccharomyces cerevisiae.

Abstract

רמות מצב יציב mRNA משתנות בהתאם לתנאי סביבה. הסדרת רמות הצטברות מצב היציב של mRNA מבטיחה כי הסכום הנכון של חלבון מסונתז עבור תנאי הגידול הספציפיים של התא. גישה אחת למדידת שיעורי ריקבון mRNA היא עיכוב שעתוק ולאחר מכן ניטור היעלמותו של mRNA שכבר קיים. קצב דעיכת mRNA לאחר מכן ניתן לכמת, ומחצית חיים מדויקים ניתן לקבוע תוך שימוש במספר טכניקות. בS. cerevisiae, פרוטוקולים המודדים mRNA מחצית חיים פותחו וכוללים עיכוב שעתוק של mRNA באמצעות זנים כי נמל אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1. טכניקות אחרות למדידת mRNA מחצית חיים כוללים עיכוב שעתוק עם מעכבי תעתיק כגון thiolutin או 1,10-phenanthroline, או לחלופין, על ידי ניצול mRNAs שנמצאות תחת השליטה של ​​אמרגן ויסותכמו-off TET מערכת אמרגן והעין מתנהלת גלקטוז. כאן אנו מתארים מדידה של ס ' שיעורי ריקבון cerevisiae mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד את שיעורי ריקבון mRNA של mRNAs או הגנום האישי.

Introduction

השעתוק והריקבון של mRNA הספציפי הם גורמים מכריעים של ביטוי גנים. שיעור הסינתזה והריקבון של mRNAs הספציפי קובע את הרמה יציבה של mRNA המסוים. רמות המצב היציב של mRNAs לשלוט בשפע של mRNAs ולקבוע כמה כל mRNA זמין עבור סינתזה של חלבונים. מדידות של מחצית חיים mRNA נמצאות בשימוש נרחב על מנת לקבוע את קצב הדעיכה של mRNAs. ריקבון mRNAs ספציפי בשיעורים שונים הקשורות לתכונות של mRNA, הפונקציה של החלבון מקודד על ידי ה- mRNA והתנאים הסביבתיים. בהתאם לטכניקה מנוצלת כדי לקבוע שיעורי ריקבון mRNA, ניתן לקבוע מדידות קצב דעיכה אם באופן גלובלי או לתמלילים בודדים. בשמרים ס cerevisiae, הטכניקות ההנפוצות ביותר המשמשות למדידת שיעורי ריקבון mRNA הגלובלי כולל ניצול זן שמרי מחסה אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II וtransc הכימימעכבי riptional כגון thiolutin ו1,10-phenanthroline 1-5. יכולים גם להיות מנוצלים שיטות אלו למדידת שיעורי ריקבון mRNA פרט 4. יכולים גם להיות מנוצלת שיטות אחרות למדידת שיעורי ריקבון mRNA. שיטות אלה גישה לתיוג מצב יציב או ניצול של מולקולות mRNA שבאות לידי ביטוי מאמרגן בפיקוח המתבטא רק בתנאים בחרו לכלול. לכל אחת מהטכניקות הללו יתרונות ומגבלות מסוימים. הטכניקה המתוארת כאן מנצלת את האלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. שיטה זו משתמשת S. cerevisiae כמודל, אבל יכול שונו ומנוצל במערכות אחרות תוך שימוש בטכניקות עיכוב תעתיק ספציפי 6.

מדידות זמן מחצית החיים mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II נמצאות בשימוש נרחב עבור שני מדידות הגנום ובודדים של mRNA ריקבון 4-5. טכניקה זו דורשת שימוש בspecifזן שמרי ic שמטפח אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1 1. הרציונל לטכניקה זו הוא שחשיפה של טמפרטורת זן שמרים רגיש לטמפרטורת nonpermissive מעכבת סינתזת mRNA. בהמשך לכך, דעיכה של mRNA preexisting מנוטרת בנקודות זמן שונות לאחר השעתוק כבר עכבות. היעלמותו של mRNA preexisting מנוטרת על ידי חילוץ RNA מתאי השמרים בנקודות זמן שונה לאחר השעתוק בוטל. נקודות הזמן שבו תאי השמרים נקצרים קבועות מראש על ידי ניסוי פיילוט, ותלויות בפרוטוקולים ובמערכת נחקרות. נקודות זמן מהירות יותר משמשות לתמלילים קצרים ימים, ואילו נקודות זמן ארוכות יותר משמשות לתמלילים כבר חיו. לאחר מכן, הריקבון של mRNA מנוטר על ידי שני ניתוח הכתם הצפוני, PCR כמותי או RNAseq.

מדידה של זמן מחצית חיים mRNA באמצעות teאלל רגיש mperature של RNA פולימראז II יש את היתרונות שלה. ראשית, טכניקה זו היא קלה וישר קדימה. שנית, ברגע שזן השמרים נרכש או שנוצר במעבדה ניתן לקבוע מדידות זמן מחצית החיים mRNA בתנאי גידול שונים; מאפשר קביעת ההשפעה סביבתית על ריקבון mRNA. שלישית, ניתן לנטר שיעורי ריקבון mRNA הגנום. שימוש בטכניקות עיכוב שעתוק אחרים יש גם יתרונות ומגבלות. לדוגמא, שימוש במקדם מושרה דורש subcloning לייצר mRNA שנמצא תחת השליטה של ​​האמרגן המוסדר. Thiolutin הוא לא זמין ויקר כאשר זמין. בנוסף, המצב של thiolutin פעולה אינו מובן לחלוטין וזה כבר דווח להשפיע תהליכים תאיים אחרים, כולל עיכוב ריקבון mRNA 7. לחלופין, 1,10-phenanthroline, הוא יותר זמין. יתר על כן, כל הטכניקות המשמשים ללעכב שעתוק יכול חצוףUrb פונקציה סלולרית ויכול להשפיע על mRNAs שונה בדרכים שונות. חוקר צריך לקבוע את השיטה המתאימה ביותר לשימוש בתנאי הניסוי שלהם כדי להשיג את התוצאות הכי אמינות. כדי לקבוע איזו שיטה המתאימה ביותר ליישום שלהם, חוקר צריך לזהות את התמלילים ותפקוד של החלבונים המקודדים על ידי התמלילים נחקרים. מדידות קצב דעיכת mRNA אמינות ביותר הן אלה הנקבעים תוך שימוש בטכניקות מרובות ולהראות את אותו שיעור הריקבון. אין טכניקה אחת היא תמיד הטובה ביותר, ואת הטכניקה המתאימה ביותר תלויה במצב הספציפי.

מחקרים רבים בS. cerevisiae מדד שיעורי ריקבון mRNA בתנאים שונים ורקע גנטי. התנאים ששיעורי ריקבון mRNA נמדדים בתלויים בניסוי הספציפי הנחקר. מדידת שיעורי ריקבון mRNA בסביבות סלולריות שונות קובעת אם התנאים שבדקתי מעדיף להשפיע על שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי. שיעורי הריקבון של mRNAs יכולים גם משתנים בהתאם לזן השמרים בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבוע שיעורי ריקבון mRNA בתאי שמרים wild-type ותאי שמרים עם מסלול nonfunctional השפלה mRNA בתיווך שטויות (NMD). מסלול השפלה mRNA זה נמצא בכל יצורי אוקריוטים שנבדקו עד כה והיא מפעילה את ההשפלה של mRNAs שבטרם עת לסיים תרגום 8. NMD תחילה זוהה כמסלול שמבזה mRNAs עם קודונים סיום מוקדמים או קודונים שטויות, אבל מוכר כיום כמסלול שגם מסדיר את הביטוי של אי-שטויות מכילות mRNAs הטבעי. mRNAs שהם מטרות של המסלול מפורק במהירות בתאי שמרים עם מסלול NMD פונקציונלי והתייצב בתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional. כך, זמן מחצית החיים של mRNAs שהם מטרות ישירות של מסלול זה הם קצרים יותר בשמרים cel wild-typels בהשוואה לתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחה של תאי שמרים

  1. בחר את זני שמרים המתאימים כדי להיות מנוצלת למדידות קצב דעיכת mRNA. לעכב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, להשתמש זני שמרי מחסה המוטציה rpb1-1 1. להשיג שמרי זן זה ממעבדה שיש אחד כבר, או ליצור אותו במעבדה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית אם נדרש רקע גנטי ספציפי 9.
  2. באמצעות טכניקה סטרילית, להכין שמרי מדיה באמצעות נהלים סטנדרטיים 10. אם לא נדרשת בחירה, להכין מדיה עשירה כגון YPD. לחלופין, להכין תקשורת סלקטיבית אם תאי השמרים הופכים עם פלסמידים ובחירה נדרש. החיטוי התקשורת.
  3. לגדול תאי שמרים על 28 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה מתירנית לזן שמרים זה. לעשות זאת בשני שלבים:
    1. לO הראשון / N, לגדול תאי השמרים ב 5 מיליליטר של תקשורת צמיחה לרוויה.
    2. הגדרת O השני / N בסופו של היום השני. לO השני / N, לחסן כמויות שונות של תאי שמרים מO ​​הראשון / N ל100-150 מיליליטר של תקשורת צמיחה (הנעה בין 100 μl למיליליטר 1, 2 מיליליטר או יותר, תלוי מתי תאי השמרים צריכים להיות שנקטפו ביום שלמחרת). לעשות את הצעד הזה כדי להבטיח שאחד מהתרבויות הוא בOD הנכון 600 היום הבא.

2. קציר תאי השמרים

  1. הכן לקצור את תאי שמרים. העיתוי לצעד זה הוא קריטי; תווית כל הצינורות הנדרשים ולאסוף את כל הציוד וחומרים הדרושים במקום אחד. מחממים אמבט מים ל -39 מעלות צלזיוס ומחמם שתי 15 מיליליטר מבחנות של תקשורת הצמיחה על 28 מעלות צלזיוס ועל 60 מעלות צלזיוס.
    הערה: 15 מיליליטר צמיחת תקשורת הנפח יכול להיות מגוון בהתאם למספר נקודות זמן התאים להיות שנקטפו.
  2. לקצור את תאי שמרים, כאשר הם מגיעים OD 600 של 0.4 ל -0.7. Transfאה התאים - 4 מיליליטר 6 סטרילי 50 בורג בקבוקי כובע. צנטריפוגה ב 7500 XG בצנטריפוגה במהירות גבוהה במשך 5 דקות בRT.
  3. בטל supernatant ו resuspend את כדורים ב -15 מיליליטר תקשורת הצמיחה שequilibrating על 28 מעלות צלזיוס. בריכת תאי שמרים בבקבוק 250 מיליליטר סטרילי אחד ולאזן אותם ל~ 5 דקות בטמפרטורת הגידול של 28 ° C.
  4. לאחר שמרי התאים equilibrated בטמפרטורת הצמיחה, מייד להוסיף 15 מיליליטר של תקשורת צמיחת equilibrated ב 60 ° C כדי להעלות את הטמפרטורה ל -39 מעלות צלזיוס (טמפרטורת nonpermissive) ומקום באופן מיידי את הבקבוק באמבט המים C ° 39 . ודא שמדיום התרבות נשאר באמבט המים C ° 39 בכל שלבי איסוף תאים שנותרו על מנת להבטיח כי השעתוק כבוי.
  5. קציר התאים בזמנים שונים לאחר הצבת הבקבוק באמבט המים C ° 39. לנקודת הזמן הראשונה, לקצור את התאים מייד לאחר הצבת הבקבוק ב 39 & #176; C. קציר aliquot 3 מ"ל ולהפיץ 3 מיליליטר לשני, 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. גלולה התאים במשך 10 שניות בצנטריפוגה מיני או picofuge עם האטה מהירה ולשפוך את supernatant.
  6. מייד להקפיא את גלולה באמבט קרח / אתנול יבש או בחנקן נוזלי. לייעד את נקודת הזמן הראשונה התאים נקצרים כבנקודת זמן אפס.
  7. בניסוי לקבוע את נקודות זמן התאים נקצרים בלאחריו על ידי ניסוי פיילוט, בהתאם לmRNAs של עניין. בדרך כלל, תאי שמרי קציר בנקודות הזמן הבאים: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 ו -35 דק '(איור 2). אם זמן מחצית החיים mRNA לא ניתן לקבוע באמצעות נקודות הזמן שצוינו לעיל, להתאים נקודות הזמן הללו. לדוגמא, לmRNAs עם זמן מחצית חיים קצרים צפוי, להשתמש בנקודתי זמנים קצרות יותר, (כלומר, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ו -18 דקות) ולmRNAs עם זמן מחצית חיים ארוכים צפוי, להאריך נקודות הזמן.
  8. לאחר התאים חהrvested, לאחסן אותם במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד מיצוי RNA מתבצע.

3. RNA חלץ מתאי השמרים

  1. עבור חלק מיצוי RNA של הפרוטוקול, להשתמש RNase טכניקות חופשיות כדי למנוע השפלה של RNA על ידי RNases. הכן RNase פתרונות חופשיים, כלי זכוכית וכלי פלסטיק לשימוש במיצוי של RNA.
  2. חלץ את RNA מתאי השמרים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בדרך כלל, משתמש בשיטת פנול החמה 12. לחלופין, להשתמש בערכות שיכולים לשמש כדי לחלץ RNA מתאי שמרים.
  3. לקבוע את הכמות וטוהר של RNA, בדרך כלל על ידי מדידת הספיגה ב 260 ושל 280 2 μl של RNA באמצעות Nanodrop. קבע את הריכוז של RNA מ260. בהתבסס על הריכוז, לדלל את RNA עד 1 מיקרוגרם / μl שימוש במים שטופלו DEPC.
    הערה: היחס של 260/280 מספק מידע על tהוא טוהר RNA. מדגם RNA הוא טהור אם היחס 260/280 הוא 2.0 ± 0.1.

4. צפון כתם ניתוח

הערה: השתמש בכתמים הצפוניים לכמת רמות ה- mRNA ולקבל מידע על הגודל של התמלילים. בנוסף, שימוש בכתמים צפוני כדי לזהות mRNAs המייצרים isoforms מרובה של אותו mRNA.

  1. הכן 1.0% ג'ל agarose-פורמלדהיד. הפעל כמויות שווה של RNA המדגם על הג'ל פורמלדהיד agarose ידי אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. הפעל סולם RNA לצד דגימות RNA ולהשתמש בו כדי לקבוע את הגדלים של RNA שאותרו על הכתם הצפוני. לפני העברת RNA מופרד על הג'ל פורמלדהיד agarose לממברנה, לחתוך את הנתיב עם סולם RNA מן הג'ל ולדמיין באמצעות רומיד ethidium.
    הערה: לחלופין, את כל הג'ל ניתן מוכתם ברומיד ethidium לפני העברת RNA.
  2. דגימות חרו RNA היגרו למרחק מתאים על הג'ל, להעביר את RNA לממברנה באמצעות RNase טכניקות חופשיות. השתמש באחת מכמה פרוטוקולים זמינים להעברת RNA לממברנות 12-13. כדי להעביר את RNA לממברנה, לחתוך את הקרום לבערך באותו גודל כמו ג'ל. העבר את RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12.
  3. UV קשר צולב RNA לממברנה באמצעות crosslinker UV הבא הוראות היצרן. לחלופין, לאפות את הקרום בתנור בחום עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. אחסן את הקרום ב -20 ° C בשקית ניילון ללא הגבלת זמן עד שהוא הכלאה לבדיקות ספציפיות.
    הערה: הקרום היבש גם יכול להיות מאוחסן על RT בין ניירות לסנן.

5. בדיקות להכליא משלים לRNA של ריבית לממברנה

הערה: דרך אחת לגלות mRNA על הקרום היא להכליא בדיקות DNA שכותרתו 32 P. זהירות: Researchers עבודה עם 32 P צריך להשתמש נהלי הגנה על מנת למנוע זיהום. פעל לפי הנחיות מוסדיות על שימוש בחומר רדיואקטיבי.

  1. הכן את הבדיקה DNA על ידי תיוג 25-50 ng של DNA להיות הכלאה הקרום על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. צור קטע DNA על ידי PCR או עיכול פלסמיד. לקבוע את הפעילות הספציפית של חללית DNA על ידי ספירת 1 μl של חללית DNA radiolabelled לאחר נוקלאוטידים מאוגדים יוסרו 12.
  2. מאגר prehybridization / הכלאה מחממים על 42 מעלות צלזיוס. השתמש ~ 10 מיליליטר של חיץ prehybridization / הכלאה לכל 100 סנטימטר 2 של הקרום 12.
  3. להכליא 1-5 x 10 6 עותקים לדקה של הבדיקה DNA radiolabeled לכל מיליליטר של חיץ הכלאה לO הקרום / N בתנור הכלאה כדי לזהות את ה- mRNA של עניין 12. ודא כי בהכלאת סיבוב תנור ההכלאה הוא בכיוון זהגורם כל הקרום להיחשף לפתרון ההכלאה, על מנת להבטיח הכלאה נכונה.
  4. לשטוף את הממברנה פעמיים ב RT במשך 15 דקות עם 50 מיליליטר של 2x SSPE ופעם אחת על 65 מעלות צלזיוס עם 50 מיליליטר של 2x SSPE / 2% SDS במשך 15 דקות 12. עטוף את הקרום בניילון הנצמד, כדי להבטיח שזה לא יתייבש או לזהם את המסך זרחני.
  5. שימוש במונה גייגר, להעריך את עוצמת הקרינה רדיואקטיבית על הממברנה.
    הערה: הערכה זו מבטיחה כי הקרום חשוף למסך זרחני לכמות המתאימה של זמן. השתמש בזמני חשיפה ארוכים יותר לממברנות עם כמויות נמוכות של רדיואקטיביות.
  6. לכתמים הצפוניים, להשתמש שליטת טעינה כדי לוודא שכמויות שווה של RNA מועמסות על כל נקודה. כדי לעשות זאת, להפשיט את הקרום וreprobe זה עם RNA שאינו מושפע מנבחנים התהליך. להפשיט את הקרום על ידי הצבתו במגש זכוכית המכיל 200 מיליליטר של רותח (0.1% הפשטת פתרון SDS / 0.01 XSSC) למשך 2 דקות. יוצקים את פתרון הפשטה ולחזור על התהליך חמש פעמים 12.
    הערה:. דוגמא של RNA המשמש כביקורת טעינה היא SCR1 SCR1 הוא תעתיקי הרנ"א פולימראז III שהוא יציב ושופע שפע RNA SCR1 לא צריך לשנות באופן משמעותי בתקופות קצרות של RNA פולימראז II עיכוב..

6. לכמת את RNA, כי הוא חייב ממברנה

הערה: כדי לכמת את כמות הרדיואקטיביות על קרום, לחשוף את הקרום למסך זרחני. לאחר זמן החשיפה המתאים, לסרוק את המסך זרחני באמצעות phosphorimager.

  1. סרוק את המסך זרחני באמצעות ההוראות הניתנות על ידי היצרן של phosphorimager.
  2. לכמת את ה- mRNA בכל נקודת זמן. לכמת רמות ה- mRNA באמצעות תוכנת ImageQuant או תוכנה קשורה. לנרמל את ה- mRNA בכל נקודה לטעינה מלאה זמן. אם SCR1 שימש הטעינהשליטה, לנרמל את northerns מחצית החיים לSCR1.
  3. זמן מחצית החיים של mRNA מחושבים על ידי חלוקת הסך של mRNA שנותר בכל נקודה בסך של mRNA זמן הווה בנקודת זמן 0 (נקודת הזמן הראשונית). גרף mRNA האחוזים הנותר לעומת זמן על מגרש semilogarithmic (איור 2 ג). חישוב זמן מחצית חיים mRNA על ידי המשוואה הבאה:
    t 1/2 = -.693 / k (שלילי .693)
  4. k הוא השיפוע של הקו בכושר הטוב ביותר ולא 1/2 הוא זמן מחצית החיים mRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היכולת של פרוטוקול זה כדי למדוד במדויק שיעורי ריקבון mRNA תלוי בעיכוב של שעתוק, הקצירה של תאי שמרים בנקודות הזמן המתאימות, ושימוש בטכניקות חופשיות RNase תוך חילוץ RNA וסופגים צפוני. חיטוט לשני mRNAs השליטה ידוע להיות לא יציב ויציב, בהתאמה, מספק ביטחון כי הניסוי עבד. לדוגמא, זה יכול להיות מושלם על ידי חיטוט עם בדיקה שמזהה שני CYH2 מראש mRNA וmRNA. איור 2 מראה את היעלמותה של CYH2 הרנ"א הראשוני בwild-type וזני שמרי מוטציה NMD בנקודות זמן שונה לאחר עיכוב השעתוק . CYH2 הרנ"א הראשוני נפגע מהר יותר בתאי שמרים עם מסלול NMD (UPF1) ביחס פונקציונלי לתאי שמרים עם מסלול nonfunctional NMD (upf1).

40fig1highres.jpg "/>
איור 1. תרשים זרימה שיטה. מדידה של תרשים זרימה קצב דעיכת mRNA

איור 2
איור 2. mRNA מחצית חיים של CYH2 -pre-mRNA וmRNA. (א) ייצוג סכמטי של CYH2 הרנ"א הראשוני וCYH2 mRNA. CYH2 הרנ"א הראשוני נחתך בחוסר יעיל והועבר לציטופלסמה שבו הוא מושפל על ידי NMD מסלול. CYH2 mRNA לא מושפל על ידי מסלול NMD כי היא חסרה את אינטרון המכיל את קודון הסיום המוקדם (PTC). (ב) כתמים צפוני מחצית החיים של RNA שחולצו מן wild-type (UPF1) וזני NMD מוטציה (upf1). נקודות הזמן לאחר traעיכוב nscription מופיע מעל לכתמים הצפוניים. הכתמים נבדקו עם radiolabelled CYH2 DNA. (C) גרף של CYH2% מראש mRNA שנותר לעומת הזמן בwild-type (UPF1) וזני NMD מוטציה (upf1). גרף זה מראה כי CYH2 מראש mRNA הוא מושפל בקצב מהיר יותר בwild-type (UPF1) מאשר בזני NMD מוטציה שמרים (upf1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עיכוב של סינתזת mRNA וניטור מחזור mRNA בהעדר הסינתזה החדשה הוא שיטה המשמשת לעתים קרובות כדי למדוד שיעורי ריקבון mRNA. בS. cerevisiae, מדידת שיעורי ריקבון mRNA על ידי עיכוב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר בשימוש. שיטה זו במיוחד מעכבת RNA פולימראז II. השלבים הקריטיים ביותר לקביעת שיעורי ריקבון mRNA באמצעות טכניקה זו הם: 1) לפני קצירת תאי שמרים, להבטיח שעתוק שכבר כבה על ידי שמירה על התרבות ב 39 ° C; 2) במהלך שלבי אלקטרופורזה הפקת RNA וג'ל RNA של הפרוטוקול להבטיח כי טכניקות חופשיות RNase משמשות; 3) השתמש RNA שליטה לנורמליזציה כדי להבטיח שכמויות שווה של RNA הועמסו ושהטיפולים הניסיוניים עובדים כצפוי; 4) לחזור על מדידות קצב דעיכת mRNA לפחות שלוש פעמים, כדי להבטיח שחזורדיוק ד של מדידות זמן מחצית החיים.

זני שמרי rpb1-1 בדרך כלל הועברו ל -37 ° C לעכב שעתוק. עם זאת, מצאנו כי ב 37 מעלות עיכוב C של שעתוק מתרחש ~ 3 דקות לאחר שינוי הטמפרטורה. 4, 11. עם זאת, השימוש בטכניקה זו כדי לקבוע שיעורי ריקבון mRNA יש ב 39 עיכוב שעתוק ° C הוא מיידי כמה מגבלות. המגבלה העיקרית היא שנדרש זן שמרים מיוחד. כאמור, יכול גם להיות שהושג שמרי זן זה ממעבדות אחרות או שנוצר במעבדה, אם נדרש רקע גנטי שמרים ספציפיים. ברגע שזן השמרים מתקבל, טכניקה זו היא פשוט ישר קדימה. מגבלה שנייה היא שהשיטה כרוכה בחשיפת תאי שמרים לחום הלם לעכב שעתוק. עומס חום יכול להשפיע על תהליכים תאיים הכוללים קצב הדעיכה של mRNAs המסוים. לדוגמא, קצב הדעיכה של mRNAs אלה thaלקודד t לחלבונים שמעורבים בתגובה ללחץ עשוי להיות מושפע. לבסוף, ניצול זן שמרים עם מוטציה בRNA פולימראז II יכול לגרום לייצור של תמלילים חלופיים שמתנהגים באופן שונה מהתמלילים הרגילים.

כפי שנאמר במבוא, שיטות אחרות מנוצלות כדי למדוד שיעורי ריקבון mRNA בS. cerevisiae. זה כולל עיכוב של שעתוק שימוש בכימיקלים כגון thiolutin ו1-10-phenanthroline. טכניקות אלו הן יתרון בכך שהם יכולים להיעשות באמצעות כל זן שמרים ויכולים להיות גם שנקבעו שיעורי ריקבון mRNA הגנום או לתמלילי אנדוגני בודדים. בנוסף, ניתן לעשות מדידות קצב דעיכת mRNA בתנאים פיסיולוגיים שונים. השירות של תרופות אלה מוגבלים על ידי העובדה שהם גם יכולים להשפיע על תהליכים תאיים ולהשפיע על שיעורי הריקבון של mRNA באופן דיפרנציאלי. בנוסף, thiolutin אינו זמין וכאשר זמיניםהוא יקר.

לאחר השליטה בטכניקה זו אחד לא יוכל לקבוע שיעורי ריקבון mRNA של mRNAs או הגנום האישי. בנוסף, ניתן למדוד שיעורי ריקבון mRNA בתנאים פיסיולוגיים שונים לבחון האם תנאים שונים להשפיע על שיעורי ריקבון mRNA באופן דיפרנציאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High Speed Centrifuge Eppendorf 22628169
Mini Centrifuge Fisher Scientific 05-090-100
Genescreen Plus membrane PerkinElmer 50-905-0169
Hybridization Oven Fisher Scientific 95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-8000
Phosphor screen GE Healthcare Life Sciences 28-9564-78
Typhoon phosphorimager GE Healthcare Life Sciences 29004080
UV cross-linker GE Healthcare Life Sciences 80-6222-31 Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer  Life Technologies AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
  2. Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
  3. Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
  4. Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
  5. Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
  6. Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
  7. Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
  8. Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
  9. Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
  10. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
  11. Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
  12. Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
  13. Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 94, MRNA ריקבון יציבות ה- mRNA ריקבון mRNA בתיווך שטויות mRNA מחצית חיים עיכוב שעתוק
מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peccarelli, M., Kebaara, B. W.… More

Peccarelli, M., Kebaara, B. W. Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains. J. Vis. Exp. (94), e52240, doi:10.3791/52240 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter