Summary
Steady state-niveau af specifikke mRNA'er er bestemt af hastigheden af syntese og nedbrydning af mRNA. Genom-dækkende mRNA nedbrydning satser eller henfaldet specifikke mRNA'er kan måles ved at bestemme mRNA halveringstider. Denne protokol fokuserer på måling af mRNA henfald satser i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state-niveauerne varierer afhængigt af miljømæssige forhold. Regulering af steady state akkumulerende niveauer af et mRNA sikrer, at den korrekte mængde af protein syntetiseret til cellens specifikke vækstbetingelser. En metode til måling af mRNA henfaldskurverne er hæmmende transkription og efterfølgende overvåge forsvinden allerede er til stede mRNA. Hastigheden af mRNA henfald kan derefter kvantificeres, og en nøjagtig halveringstid kan bestemmes udnytte adskillige teknikker. I S. cerevisiae, protokoller, der måler mRNA halveringstider er blevet udviklet og indbefatter inhibering transkription af mRNA under anvendelse af stammer, der huser en temperaturfølsom allel af RNA-polymerase II, rpb1-1. Andre teknikker til måling af mRNA halveringstider omfatter hæmning transskription med transkriptionelle inhibitorer som thiolutin eller 1,10-phenanthrolin, eller alternativt ved at udnytte mRNA'er, der er under kontrol af en regulerbar promotorsåsom galactose inducerbare promotor og tet-off system. Her beskriver vi måling af S. cerevisiae mRNA henfaldskurverne hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne teknik kan bruges til at måle mRNA henfaldskurverne enkelte mRNA'er eller hele genomet.
Introduction
Transkription og henfald af specifikke mRNA er afgørende determinanter for genekspression. Satsen for syntese og nedbrydning af specifikke mRNA'er bestemmer steady-state niveau af denne særlige mRNA. Steady state niveauer af mRNA'er regulerer overflod af mRNA'er og bestemme hvor meget af hver mRNA er tilgængelig for proteinsyntese. Målinger af mRNA halveringstider anvendes i udstrakt grad til at bestemme henfaldshastigheden af mRNA'er. Specifikke mRNA'er henfald ved forskellige hastigheder, der er relateret til funktioner af mRNA, funktionen af proteinet kodet af mRNA'en og miljøforhold. Afhængig af teknikken anvendes til at bestemme mRNA henfaldskurverne kan henfaldshastighed målinger bestemmes enten globalt eller for individuelle udskrifter. I gæren S. cerevisiae, de teknikker, der mest almindeligt anvendes til at måle den globale mRNA henfaldskurverne omfatter anvendelse af en gær stamme, der huser den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II og kemisk transcriptional hæmmere såsom thiolutin og 1,10-phenanthrolin 1-5. Disse metoder kan også anvendes til at måle individuelle mRNA henfaldskurverne 4. Andre fremgangsmåder kan også anvendes til at måle mRNA henfaldskurverne. Disse metoder omfatter tilgang til steady state mærkning eller anvendelse af mRNA-molekyler, der er udtrykt fra en reguleret promotor, som kun udtrykkes i udvalgte forhold. Hver af disse teknikker har visse fordele og begrænsninger. Den her beskrevne teknik anvender den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne metode bruger S. cerevisiae som den model, kan men blevet ændret og anvendt i andre systemer ved hjælp af specifikke transkriptionelle hæmning teknikker 6.
mRNA halveringstid målinger ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er flittigt brugt til både genom-dækkende og individuelle målinger af mRNA forfald 4-5. Denne teknik kræver anvendelse af et specific gær stamme, der huser et temperaturfølsomt allel af RNA-polymerase II, rpb1-1 1. Begrundelsen for denne teknik er, at eksponeringen af det temperaturfølsomme gærstamme til den ikke-permissive temperatur inhiberer mRNA-syntese. Efterfølgende henfald af forudeksisterende mRNA overvåges på forskellige tidspunkter efter transkription er blevet hæmmet. Forsvinden af forudeksisterende mRNA overvåges ved ekstraktion af RNA fra gærcellerne ved forskellige tidspunkter efter transkription er blevet slukket. De tidspunkter, hvor gærcellerne høstes er forudbestemt af et pilotforsøg, og afhænger af udskrifter og system, der undersøges. Hurtigere tidspunkter bruges til kortvarige udskrifter, mens længere tidspunkter bruges til længere levede udskrifter. Bagefter henfald af mRNA overvåges af enten Northern blot-analyse, kvantitativ PCR eller RNAseq.
Måling af mRNA halveringstider ved hjælp af en temperature følsomme allel af RNA-polymerase II har sine fordele. Først denne teknik er nem og ligetil. For det andet, når gærstammen erhverves eller frembringes i laboratoriet mRNA halveringstid målinger kan bestemmes i forskellige vækstbetingelser; muliggør bestemmelse af miljømæssig indflydelse på mRNA forfald. For det tredje kan mRNA henfaldskurverne overvåges genom-dækkende. Anvendelse af andre transskription hæmning teknikker har også fordele og begrænsninger. For eksempel er brugen af en inducerbar promotor kræver subkloning at generere et mRNA, der er under kontrol af den regulerede promotor. Thiolutin er ikke umiddelbart tilgængelig, og er dyrt, når de foreligger. Desuden er thiolutin virkningsmekanisme ikke fuldstændigt forstået, og det er blevet rapporteret at påvirke andre cellulære processer, herunder inhibering mRNA henfald 7. Alternativt 1,10-phenanthrolin, er mere let tilgængelige. Desuden er alle de teknikker, der anvendes til at inhibere transkription kan PertUrb cellulær funktion og kan påvirke forskellige mRNA'er i forskellige måder. En investigator har brug for at bestemme den mest hensigtsmæssige metode til at bruge i deres eksperimentelle betingelser for at opnå de mest pålidelige resultater. At afgøre, hvilken metode der er mest egnet til deres ansøgning, en forsker har brug for at identificere de udskrifter og funktion af proteiner kodet af udskrifter, der undersøges. De mest pålidelige mRNA henfaldshastighed målinger er dem, der bestemmes ved hjælp af flere teknikker og viser samme henfaldshastighed. Ingen enkelt teknik er altid bedst, og den mest hensigtsmæssige teknik afhænger af den specifikke situation.
Talrige undersøgelser i S. cerevisiae har målt mRNA henfald satser under forskellige forhold og genetiske baggrunde. De betingelser, mRNA henfaldet er målt i afhænger af den specifikke eksperiment, der undersøges. Måling mRNA henfald satser i forskellige cellulære miljøer, om forudsætningerne erundersøgte fortrinsvis påvirke henfaldet specifikke mRNA'er. Henfaldet af mRNA'er kan også variere afhængigt af gærstammen, der anvendes. For eksempel kan mRNA henfaldskurverne bestemmes i vildtype-gærceller og gærceller med et nonfunktionelt nonsens-medieret mRNA nedbrydning (NMD) pathway. Dette mRNA nedbrydningsvej findes i alle eukaryote organismer, der hidtil er blevet undersøgt, og det udløser nedbrydning af mRNA, der tidligt afslutter translation 8. NMD blev oprindeligt identificeret som en vej, der nedbryder mRNA med præmature termineringskodoner eller nonsens-kodoner, men er nu anerkendt som en vej, der også regulerer ekspressionen af ikke-nonsense med naturlige mRNA'er. mRNA'er, der er mål for forløbet hurtigt nedbrydes i gærceller med en funktionel NMD vej og stabiliseret i gærceller med en nonfunctional NMD vej. Således halveringstider på mRNA, der er direkte mål for denne vej er kortere i vildtype gær cells sammenlignet med gærceller med et nonfunktionelt NMD pathway.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vækst af gærceller
- Vælg de relevante gærstammer, der skal udnyttes til mRNA henfaldshastighed målinger. At inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II, bruge gærstammer huser rpb1-1 mutation 1. Opnå dette gærstamme fra et laboratorium, der allerede har en, eller generere den i laboratoriet ved hjælp af standard teknikker, hvis en bestemt genetisk baggrund er påkrævet 9.
- Anvendelse af steril teknik forberede gær medier ved anvendelse af standardprocedurer 10. Hvis der ikke valg er påkrævet, udarbejde rich media såsom YPD. Alternativt forberede selektive medier, hvis gærceller transformeret med plasmider og udvælgelse er påkrævet. Autoklaver medierne.
- Grow gærcellerne ved 28 ° C, hvilket er den permissive temperatur for denne gærstamme. Gør dette i to trin:
- For første O / N, dyrke gærceller i 5 ml vækstmedium til mætning.
- Opsætning af anden O / N ved udgangen af den anden dag. For den anden O / N, pode forskellige mængder af gærcellerne fra første O / N i 100 til 150 ml vækstmedium (fra 100 pi til 1 ml, 2 ml eller mere, afhængigt af hvor gærcellerne skal være høstet den følgende dag). Gør dette skridt for at sikre, at en af de kulturer, er i den rigtige OD 600 den følgende dag.
2. Harvest gærcellerne
- Forbered dig på at høste gærceller. Timingen for dette trin er kritisk; mærke alle de nødvendige rør og samle alle nødvendige udstyr og materialer på ét sted. Forvarm et vandbad til 39 ° C og forvarme to 15 ml reagensglas af vækstmedierne ved 28 ° C og ved 60 ° C.
BEMÆRK: 15 ml vækstmedier volumen kan varieres afhængigt af antallet af tidspunkter cellerne høstes. - Høst gærcellerne, når de når en OD600 på 0,4 til 0.7. TransfER cellerne til 4 - 6 sterile 50 ml skruelåg flasker. Der centrifugeres ved 7.500 xg i en højhastigheds-centrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og resuspender pellets i de 15 ml vækstmedier, der blev ækvilibrering ved 28 ° C. Pool gærcellerne i en steril 250 ml kolbe og tempereres dem for ~ 5 min ved 28 ° C væksttemperatur.
- Efter gærcellerne har ækvilibreret ved væksttemperaturen, straks de 15 ml af vækstmedie ækvilibreret ved 60 ° C for at hæve temperaturen til 39 ° C (den ikke-permissive temperatur) og straks anbringe kolben i 39 ° C vandbad . Kontroller, at dyrkningsmediet forbliver i 39 ° C vandbad i hele de resterende cellehøst skridt til at sikre, at transkription er slukket.
- Høst cellerne ved forskellige tidspunkter efter anbringelse af kolben i 39 ° C vandbad. For det første tidspunkt, høste cellerne umiddelbart efter anbringelse af kolben på 39 & #176; C. Høst en 3 ml prøve og distribuere 3 ml i to, 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pelletere cellerne i 10 sekunder i en mini centrifuge eller picofuge med hurtig deceleration og udøse supernatanten.
- Umiddelbart fryse pellet i et tøris / ethanol-bad eller i flydende nitrogen. At udpege den første tidspunkt cellerne høstet ved som nul-tidspunkt.
- Eksperimentelt bestemme tidspunkter cellerne høstes ved derefter ved et pilotforsøg, afhængigt af mRNA af interesse. Normalt høst gærceller på følgende tidspunkter: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 og 35 min (figur 2B). Hvis mRNA halveringstid ikke kan bestemmes ved hjælp af de ovennævnte tidspunkter, justere disse tidspunkter. For eksempel, for mRNA'er med forventede korte halveringstider, brug kortere gange points, (dvs. 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 og 18 min) og for mRNA'er med forventede lange halveringstider, udvide tidspunkterne.
- Efter cellerne er harvested, gemme dem i en -80 ° C fryser indtil RNA ekstraktion udføres.
3. Uddrag RNA fra gærcellerne
- Til RNA-ekstraktion del af protokollen, brug RNase gratis teknikker til at forhindre nedbrydning af RNA ved RNaser. Forbered RNase fri løsninger, glas og plast ware, der skal anvendes i ekstraktion af RNA.
- Uddrag RNA fra gærcellerne i overensstemmelse med standardprotokoller. Typisk bruge hot phenol metode 12. Alternativt anvender kits, der kan anvendes til at ekstrahere RNA fra gærceller.
- Bestem mængden og renheden af RNA, normalt ved at måle absorbansen ved A260 og A280 af 2 pi RNA ved anvendelse af en NanoDrop. Bestem koncentrationen af RNA fra A 260. Baseret på koncentrationen fortyndes RNA til 1 pg / pl hjælp DEPC behandlet vand.
BEMÆRK: Forholdet mellem A 260 / A 280 indeholder oplysninger om than renhed af RNA. En RNA-prøve er ren, hvis A260 / A280-forholdet er 2,0 ± 0,1.
4. Northern blot-analyse
BEMÆRK: Brug Northern blots at kvantificere mRNA-niveauer og få oplysninger om størrelsen af udskrifter. Derudover bruger Northern blots at detektere mRNA'er, der producerer multiple isoformer af det samme mRNA.
- Der fremstilles en 1,0% agarose-formaldehyd-gel. Kør lige store mængder af prøven RNA på agarose formaldehyd gel ved elektroforese i overensstemmelse med standardprotokoller 12. Kør en RNA stige ved siden af RNA-prøver og bruge det til at bestemme størrelsen af RNA, der er registreret på den nordlige blot. Før overførsel af RNA separeret på agarose formaldehyd gelen til en membran, skæres banen med RNA stigen fra gelen og visualisere ved hjælp ethidiumbromid.
BEMÆRK: Alternativt kan hele gelen farvet med ethidiumbromid før overførsel af RNA. - After den RNA-prøver har migreret til en passende afstand på gelen, overføre RNA til en membran ved hjælp RNase frie teknikker. Brug en af flere protokoller til rådighed til at overføre RNA til membraner 12-13. For at overføre RNA til en membran, skæres membranen til omtrent samme størrelse som gelen. Overfør RNA ifølge standardprotokoller 12.
- UV tværbinde RNA til membranen under anvendelse af en UV-tværbinder efter producentens anvisninger. Alternativt bage membranen i en ovn indstillet til 80 ° C i 1 time. Opbevar membranen ved -20 ° C i en plastikpose på ubestemt tid, indtil det er hybridiseret til specifikke prober.
BEMÆRK: Det tørre membran kan også opbevares ved stuetemperatur mellem filter papirer.
5. Hybridiser Probes Supplerende til RNA af interesse for Membrane
BEMÆRK: En måde at detektere mRNA på membranen er at hybridisere 32P-mærket DNA-prober. ADVARSEL: Researchers arbejder med 32P skal bruge beskyttende procedurer for at forhindre forurening. Følg institutionelle retningslinjer for anvendelsen af radioaktive materialer.
- Forbered DNA-proben ved at mærke 25 - 50 ng af det DNA, der skal hybridiseres til membranen ifølge standardprotokoller 12. Generere DNA-fragmentet ved PCR eller plasmid fordøjelse. Bestem den specifikke aktivitet af DNA-proben ved at tælle 1 pi af den radioaktivt mærkede DNA-probe efter inkorporerede nukleotider fjernes 12.
- Forvarm præhybridisering / hybridiseringspuffer ved 42 ° C. Brug ~ 10 ml af præhybridisering / hybridiseringspuffer pr 100 cm2 af membranen 12.
- Hybridisere 1-5 x 10 6 cpm af radiomærket DNA-probe pr ml hybridiseringspuffer til membranen O / N i en hybridiseringsovn at detektere mRNA af interesse 12. Kontroller, at under hybridisering hybridiseringsovn rotation i en retning,forårsager hele membranen at blive udsat for hybridiseringsopløsningen, for at sikre korrekt hybridisering.
- Vask membranen to gange ved stuetemperatur i 15 minutter med 50 ml 2x SSPE og én gang ved 65 ° C med 50 ml 2x SSPE / 2% SDS i 15 min 12. Wrap membranen i plastikfolie at sikre, at det ikke udtørrer eller forurene Phosphor skærmen.
- Ved hjælp af en geigertæller, estimere intensiteten af radioaktiviteten på membranen.
BEMÆRK: Dette skøn sikrer, at membranen er udsat for skærmen Phosphor for den passende mængde tid. Brug længere eksponeringstider for membraner med små mængder radioaktivitet. - For Northern blots, bruge en belastning for at bekræfte, at lige store mængder af RNA er læsset på hver plet. For at gøre dette, strimler membranen og reprobe det med en RNA, som ikke berøres af processen, der undersøges. Strip membranen ved at placere den i et glas bakke indeholdende 200 ml kogende stripning opløsning (0,1% SDS / 0,01 XSSC) i 2 minutter. Hæld stripping løsning, og gentag proceduren fem gange 12.
BEMÆRK:. Et eksempel på et RNA anvendes som en loading kontrol SCR1 SCR1 er en RNA-polymerase III-transkript, som er stabil og rigelig SCR1 RNA overflod bør ikke ændre sig væsentligt i korte perioder af RNA-polymerase II-inhibering..
6. Kvantificere RNA, der er bundet til membranen
BEMÆRK: For at kvantificere mængden af radioaktivitet på membranen, udsætte membranen til en Fosfor skærm. Efter passende eksponeringstid, scanne Fosfor skærmen ved hjælp af en phosphorimager.
- Scan Phosphor skærmen ved hjælp af vejledningen fra producenten af phosphorimager.
- Kvantificer mRNA ved hvert tidspunkt. Kvantificere mRNA niveauer ved hjælp af ImageQuant software eller relateret software. Normalisere mRNA ved hvert tidspunkt til lastning kontrol. Hvis SCR1 blev anvendt som loadingkontrol, normalisere halveringstid northerns til SCR1.
- Halveringstiden af mRNA'et beregnes ved at dividere mængden af mRNA resterende på hvert tidspunkt af mængden af mRNA til stede på tidspunkt 0 (den oprindelige tidspunkt). Tegn procent mRNA resterende versus tid på en semilogaritmisk plot (figur 2C). Beregn mRNA halveringstider ved følgende ligning:
t 1/2 = -0,693 / k (negativ 0,693) - k er hældningen for den bedst tilpassede linje og t 1/2 er mRNA halveringstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen af denne protokol til nøjagtigt at måle mRNA henfaldskurverne afhænger hæmning af transskription, høst af gærceller på passende tidspunkter, og udnyttelse af RNase gratis teknikker, mens udvinding RNA og Northern blotting. Sondering for to kontrol mRNA kendt for at være ustabil og stabil, henholdsvis giver tillid til, at forsøget virkede. For eksempel kan dette opnås ved at probe med en probe, der detekterer både CYH2 præ-mRNA og mRNA. Figur 2B viser forsvinden af CYH2 præ-mRNA i vildtype- og NMD mutante gærstammer på forskellige tidspunkter efter transkription hæmning . CYH2 præ-mRNA nedbrydes hurtigere i gærceller med en funktionel NMD pathway (UPF1) i forhold til gærceller med et nonfunktionelt NMD pathway (upf1).
40fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Metode flowchart. Måling af mRNA henfaldshastighed flowchart
Figur 2. mRNA halveringstid CYH2 Pre-mRNA og mRNA. (A) Skematisk repræsentation af CYH2 præ-mRNA og CYH2 mRNA. CYH2 præ-mRNA er ineffektivt splejset og transporteres til cytoplasmaet, hvor det nedbrydes af NMD pathway. CYH2 mRNA ikke nedbrydes af NMD pathway fordi det mangler intron indeholdende tidlig termineringskodon (PTC). (B) Half-life Northern blots af RNA ekstraheret fra vildtype (UPF1) og NMD mutantstammer (upf1). De tidspunkter efter transcription hæmning er anført ovenfor Northern blots. Blottene blev probet med radioaktivt mærket CYH2 DNA. (C) En graf af% CYH2 præ-mRNA resterende versus tid i vildtype (UPF1) og NMD mutantstammer (upf1). Denne graf viser, at den CYH2 præ-mRNA nedbrydes ved en hurtigere hastighed i vildtype (UPF1) end i NMD mutante gærstammer (upf1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hæmning af mRNA-syntese og overvågning mRNA omsætning i mangel af nye syntese er en metode, der ofte bruges til at måle mRNA henfald satser. I S. cerevisiae, måling af mRNA henfald ved at inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er en af de hyppigst anvendte metoder. Denne metode specifikt inhiberer RNA-polymerase II. De mest kritiske trin til bestemmelse af mRNA henfald ved hjælp af denne teknik er: 1) inden høst gærcellerne sikre, at transskription er blevet slukket ved at opretholde kulturen ved 39 ° C; 2) I de RNA-ekstraktionsmetoder og RNA gelelektroforesesystemer trin i protokollen, at RNase-frit teknikker anvendes; 3) Brug en kontrol-RNA for normalisering at sikre, at lige store mængder af RNA blev lastet, og at de eksperimentelle behandlinger fungerer som forventet; 4) Gentag mRNA henfaldshastighed målinger mindst tre gange for at sikre reproducerbarhed end nøjagtigheden af halveringstider målinger.
rpb1-1 gærstammer normalt overført til 37 ° C for at inhibere transkription. Vi har imidlertid fundet, at ved 37 ° C inhibering af transkription forekommer ~ 3 min efter temperaturskift. Ved 39 ° C transkription inhibering øjeblikkelig 4, 11. Imidlertid er anvendelsen af denne teknik til at bestemme mRNA henfaldskurverne har nogle begrænsninger. Den primære begrænsning er, at en speciel gærstamme er påkrævet. Som tidligere nævnt kan denne gærstamme enten opnås fra andre laboratorier eller frembringes i laboratoriet, hvis en bestemt gær genetisk baggrund er påkrævet. Når gærstammen er opnået, denne teknik er enkel og ligetil. En anden begrænsning er, at fremgangsmåden indebærer udsætte gærcellerne for varmeshock at inhibere transkription. Heat stress kan påvirke cellulære processer, herunder henfald på bestemte mRNA. For eksempel henfaldshastigheden af disse mRNA'er that koder for proteiner, der er involveret i stress respons kan blive påvirket. Endelig kan anvendelsen af en gærstamme med en mutation i RNA-polymerase II resultere i produktion af alternative transskripter, der opfører sig forskelligt fra de normale transkripter.
Som omtalt i indledningen er andre teknikker anvendes til at måle mRNA henfaldskurver i S. cerevisiae. Dette omfatter hæmning af transskription bruge kemikalier såsom thiolutin og 1-10-phenanthrolin. Disse teknikker er fordelagtige, idet de kan gøres ved hjælp af en gærstamme og mRNA henfaldskurverne kan også bestemmes hele genomet eller for individuelle endogene transskripter. Endvidere kan mRNA henfald målinger ske i forskellige fysiologiske betingelser. Anvendeligheden af disse lægemidler er begrænset af det faktum, at de også kan påvirke cellulære processer og påvirke henfaldet af mRNA differentielt. Derudover thiolutin er ikke umiddelbart tilgængelig, og når de er tilgængeligeer dyrt.
Efter mastering denne teknik vil være i stand til at bestemme mRNA henfald satser enkelte mRNA'er eller genom-dækkende. Derudover kan måles, mRNA henfald satser i forskellige fysiologiske forhold for at undersøge, om forskellige forhold påvirker mRNA henfaldskurverne differentielt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background |
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
