Summary
Steady state nivået av spesifikke mRNA bestemmes av graden av syntese og nedbrytning av mRNA. Genom mRNA nedbrytningshastigheter eller forfallet priser av spesifikke mRNA kan måles ved å bestemme mRNA halveringstider. Denne protokollen fokuserer på måling av mRNA dempefaktorer i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state nivåer varierer avhengig av miljøforhold. Regulering av steady state opphopning nivåer av et mRNA sikrer at den riktige mengden av protein blir syntetisert for cellens spesifikke vekstbetingelser. En fremgangsmåte for måling av mRNA-dempefaktorer er å inhibere transkripsjon og deretter overvåke forsvinningen av den allerede foreliggende mRNA. Hastigheten av mRNA-nedbrytning kan deretter kvantifiseres, og en nøyaktig halveringstid kan bestemmes anvendelse av flere teknikker. I S. cerevisiae, protokoller som måler mRNA halveringstider er utviklet og inkluderer hemme transkripsjon av mRNA ved hjelp av stammer som havn en temperaturfølsom allel av RNA polymerase II, rpb1-1. Andre teknikker for måling av mRNA-halveringstider inkluderer inhibering transkripsjon med transkripsjonelle inhibitorer så som thiolutin eller 1,10-fenantrolin, eller alternativt ved anvendelse av mRNA som er under kontroll av en regulerbar promotorslik som galaktose induserbar promoter og den TET-off-system. Her beskriver vi måling av S. cerevisiae mRNA dempefaktorer ved hjelp av temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II. Denne teknikken kan brukes til å måle mRNA forfallet priser av individuelle mRNA eller genom-wide.
Introduction
Transkripsjon og nedbrytning av spesifikke mRNA er avgjørende faktorer som bestemmer genuttrykk. Hastigheten for syntese og nedbrytning av spesifikke mRNA bestemmer steady-state nivå av den aktuelle mRNA. De stabile nivåer av mRNA styrer overflod av mRNA og bestemme hvor mye av hver mRNA er tilgjengelig for proteinsyntese. Målinger av mRNA halveringstider er i utstrakt bruk for å bestemme forfallet rate av mRNA. Spesifikk mRNA nedbrytning med forskjellige hastigheter som er relatert til funksjonene i mRNA, funksjonen av proteinet kodet for av mRNA og miljøforhold. Avhengig av teknikken benyttes til å avgjøre mRNA dempefaktorer, kan forfallet måling bestemmes enten globalt eller for enkelt transkripsjoner. I gjær S. cerevisiae, de teknikkene som er mest brukt til å måle global mRNA decay priser inkluderer benytte en gjærstamme husing temperaturen sensitive allelet av RNA polymerase II og kjemisk Transcriptional inhibitorer så som thiolutin og 1,10-fenantrolin 1-5. Disse fremgangsmåter kan også benyttes for å måle individuelle mRNA dempefaktorer 4. Andre metoder kan også benyttes til å måle mRNA dempefaktorer. Disse metodene inkluderer tilnærming til stabil tilstand merking eller utnyttelse av mRNA molekyler som er uttrykt fra en regulert promoter som blir uttrykt bare i utvalgte betingelser. Hver av disse teknikkene har visse fordeler og begrensninger. Teknikken som beskrives her utnytter temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II. Denne metoden bruker S. cerevisiae som modell, men kan blitt modifisert og brukt i andre systemer ved hjelp av spesifikke transkripsjons hemming teknikker 6.
mRNA halveringstid målinger ved hjelp av temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II er i utstrakt bruk for både genom-wide og individuelle målinger av mRNA forfall 4-5. Denne teknikk krever bruk av en specific gjærstamme som havner en temperaturfølsom allel av RNA polymerase II, rpb1-1 en. Begrunnelsen for denne teknikken er at eksponeringen av det temperaturfølsomme gjærstamme til nonpermissive temperatur hemmer mRNA-syntese. Deretter blir nedbrytning av den allerede eksisterende mRNA overvåket ved forskjellige tidspunkter etter transkripsjon er blitt inhibert. Forsvinningen av forhåndsdefinert mRNA blir overvåket ved å ekstrahere RNA fra gjærcellene ved ulike tidspunkt etter transkripsjon har blitt slått av. De tidspunkter ved hvilke gjærcellene er høstet er forhåndsbestemt av en pilotforsøk, og er avhengig av transkripsjonene og systemet som undersøkes. Raskere tidspunkter brukes for kortvarige transkripsjoner, mens lengre tids poeng kan brukes til lengre levd transkripsjoner. Etterpå blir nedbrytning av mRNA overvåkes enten ved Northern blot-analyse, kvantitativ PCR eller RNAseq.
Måling av mRNA halveringstider ved hjelp av en temperature følsom allel av RNA-polymerase II har sine fordeler. Først, er enkelt og rett frem denne teknikken. For det andre, når gjærstamme er ervervet eller generert i laboratoriet på mRNA-halverings målinger kan bestemmes på forskjellige vekstbetingelser; muliggjør bestemmelse av miljø innflytelse på mRNA råte. For det tredje kan mRNA dempefaktorer overvåkes genome-wide. Bruk av andre transkripsjon hemming teknikker har også fordeler og begrensninger. For eksempel bruk av en induserbar promoter krever subkloning å generere et mRNA som er under kontroll av den regulerte promoter. Thiolutin er ikke lett tilgjengelig og er dyrt når det er tilgjengelig. I tillegg er thiolutin sin virkningsmekanisme ikke helt forstått, og det har blitt rapportert å påvirke andre cellulære prosesser, inkludert hemme mRNA forfall 7. Alternativt kan 1,10-fenantrolin, er lettere tilgjengelig. Videre er alle de teknikker som anvendes for å inhibere transkripsjon kan pertUrb cellular funksjon og kan påvirke ulike mRNA i forskjellige måter. En etterforsker må bestemme den mest hensiktsmessige metoden å bruke i sine eksperimentelle forhold til å oppnå de mest pålitelige resultater. Å avgjøre hvilken metode som er mest egnet for deres søknad, trenger en forsker å identifisere utskrifter og funksjon av proteiner kodet av transkripsjoner under etterforskning. De mest pålitelige mRNA forfall måling er de som er fastsatt ved bruk av flere ulike teknikker og viser den samme forfallet rate. Ingen enkel teknikk er alltid den beste, og den mest hensiktsmessige teknikken er avhengig av den konkrete situasjonen.
Tallrike studier i S. cerevisiae har målt mRNA dempefaktorer i ulike forhold og genetiske bakgrunn. De forholdene som mRNA dempefaktorer er målt i avhenge av den spesifikke eksperiment under etterforskning. Måle mRNA dempefaktorer i ulike cellulære miljøer avgjør om vilkårene blirundersøkt fortrinnsvis påvirke forfallet priser av spesifikke mRNA. Dempefaktorer mRNA kan også variere avhengig av gjærstammen som brukes. For eksempel kan mRNA forfallet prisene bestemmes i villtype gjærceller og gjærceller med en ikke-fungerende tull-mediert mRNA nedbrytning (NMD) veien. Dette mRNA degradering veien finnes i alle eukaryote organismer som har blitt undersøkt så langt, og det utløser degradering av mRNA som tidlig avslutte oversettelse 8. NMD ble først identifisert som en vei som degraderer mRNAs med tidlig avslutning kodonene eller tull kodon, men er nå anerkjent som en vei som også regulerer uttrykket av non-nonsense inneholder naturlige mRNA. mRNA som er mål for veien blir raskt nedbrutt i gjærceller med en funksjonell NMD sti og stabilisert i gjærceller med en ikke-fungerende NMD sti. Således er halveringstiden av mRNA som er direkte mål av denne reaksjonsveien er kortere i villtype gjær cells sammenlignet med gjærceller med en ikke-fungerende NMD sti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vekst av gjærcellene
- Velg riktige gjærstammer som skal benyttes for de mRNA forfall måling. Å hemme transkripsjon med temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II, bruke gjærstammer med den rpb1-1 mutasjon en. Få denne gjærstamme fra et laboratorium som allerede har en eller generere det i laboratoriet ved hjelp av standardteknikker hvis en spesifikk genetisk bakgrunn er nødvendig 9.
- Bruk steril teknikk, forberede gjær media ved hjelp av standard prosedyrer 10. Hvis ingen valg er nødvendig, utarbeide rike medier som YPD. Alternativt fremstille selektive medier hvis gjærcellene transformert med plasmider og valget er nødvendig. Autoklav media.
- Dyrke gjærcellene ved 28 ° C, som er den tillatelige temperatur for denne gjærstamme. Gjør dette i to trinn:
- For det første O / N, dyrke gjærcellene i 5 ml vekstmedium til metning.
- Still opp den andre O / N ved slutten av den andre dagen. For det andre O / N, inokulere forskjellige mengder av gjærceller fra den første O / N i 100 til 150 ml vekstmedium (som strekker seg fra 100 ul til 1 ml, 2 ml eller mer, avhengig av når gjærcellene trenger å være høstet neste dag). Gjør dette skritt for å sikre at en av de kulturene er på riktig OD 600 neste dag.
2. Harvests gjærcellene
- Forbered deg på å høste gjærceller. Tidspunktet for dette trinnet er kritisk; merke alle de nødvendige rør og samle all nødvendig utstyr og materialer på ett sted. Forvarme et vannbad til 39 ° C og forvarme to 15 ml reagensrør av vekstmediet ved 28 ° C og ved 60 ° C.
MERK: 15 ml vekstmedium volum kan varieres, avhengig av antall tidspoeng cellene skal høstes. - Høste gjærcellene når de når en OD 600 på 0,4 til 0,7. TRANSFer cellene til 4-6 sterile 50 ml skrukork flasker. Sentrifuger ved 7500 x g i en høyhastighets-sentrifuge i 5 min ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 15 ml vekstmedium som var ekvilibrering ved 28 ° C. Pool gjærcellene i en steril 250 ml kolbe, og i likevekt dem for ~ 5 min ved 28 ° C veksttemperatur.
- Etter at gjærcellene er ekvilibrert ved vekst temperatur, umiddelbart tilføre de 15 ml av vekstmediet i likevekt ved 60 ° C for å heve temperaturen til 39 ° C (den nonpermissive temperatur) og umiddelbart plassere kolben i 39 ° C vannbad . Sørg for at kulturmediet forblir i 39 ° C vannbad gjennom de resterende celle høsting skritt for å sikre at transkripsjon er slått av.
- Høste cellene ved forskjellige tidspunkter etter plassering av kolben i 39 ° C vannbad. For det første tidspunkt, høste cellene umiddelbart etter plassering av kolben ved 39 & #176; C. Høste en 3 ml prøve og fordele 3 ml i to, 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pellet cellene for 10 sek i en mini sentrifuge eller picofuge med rask oppbremsing og helle ut supernatanten.
- Umiddelbart fryse pelleten i et tørris / etanol-bad, eller i flytende nitrogen. Utpeke den første tidspunkt blir cellene høstet på et så nulltidspunktet.
- Eksperimentelt bestemme de tidspunkter blir cellene høstet ved deretter ved et pilotforsøk, avhengig av mRNA av interesse. Normalt innhøsting av gjærceller ved de følgende tidspunkter: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 og 35 minutter (figur 2B). Dersom mRNA-halveringstiden ikke kan bestemmes ved hjelp av de ovennevnte tidspunkter, justere disse tidspunkter. For eksempel, for mRNA med forventede korte halveringstider, bruker kortere tid punkter, (dvs., 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 og 18 min) og for mRNA med forventede lange halveringstider, strekker tidspunktene.
- Etter at cellene er hektarrvested, lagre dem i en -80 ° C fryser til RNA ekstraksjon utføres.
3. Ekstrakt RNA fra gjærcellene
- For RNA-ekstraksjon del av protokollen bruker RNase frie teknikker for å forhindre degradering av RNA fra RNasene. Forbered RNase frie løsninger, glass og plast ware som skal brukes i ekstraksjonen av RNA.
- Ekstrahere RNA fra gjærceller i henhold til standardprotokoller. Vanligvis bruker varmt fenol metode 12. Alternativt kan bruke kits som kan bli anvendt for å ekstrahere RNA fra gjærceller.
- Bestemme mengden og renheten av RNA, normalt ved å måle absorbansen ved 260 A og 280 A av 2 pl av RNA ved hjelp av et Nanodrop. Bestemme konsentrasjonen av RNA fra A 260. Basert på konsentrasjonen, fortynnes RNA til 1 pg / pl ved bruk DEPC behandlet vann.
MERK: Forholdet mellom A 260 / A 280 gir informasjon om tHan renhet av RNA. En RNA prøven er ren hvis A 260 / A 280 ratio er 2,0 ± 0,1.
4. Northern Blot Analysis
MERK: Bruk nord blotter å kvantifisere mRNA nivåer og få informasjon om størrelsen på utskrifter. I tillegg bruker northern blots for å detektere mRNA som produserer flere isoformer av det samme mRNA.
- Forberede en 1,0% agarose-formaldehyd gel. Kjør like mengder av prøven RNA på agarose-formaldehyd-gel ved elektroforese i henhold til standard protokoller 12. Kjør en RNA stige langs RNA prøver og bruke den til å bestemme størrelsen på RNA som er oppdaget på den nordlige blot. Før overføring av RNA separert på agarose-formaldehyd-gel til en membran, skjæres banen med RNA stigen fra gelen og visualisere ved hjelp av etidiumbromid.
MERK: Alternativt kan hele gelen farget med etidiumbromid før overføring av RNA. - After RNA prøver har migrert til en passende avstand på gel, overføre RNA til en membran ved hjelp av RNase gratis teknikker. Bruk en av flere protokoller tilgjengelig for å overføre RNA til membraner 12-13. For å overføre RNA til en membran, membranen skåret til omtrent samme størrelse som den gel. Overfør RNA i henhold til standard protokoller 12.
- UV kryss knytte RNA til membranen ved hjelp av en UV kryss kobling følge produsentens instruksjoner. Alternativt bake membranen i en ovn innstilt på 80 ° C i 1 time. Oppbevare membranen ved -20 ° C i en plastpose på ubestemt tid inntil det er hybridisert til spesifikke prober.
MERK: Den tørre membran kan også lagres ved romtemperatur mellom filterpapir.
5. hybridiserer Sonder Komplementær til RNA av interesse til Membran
MERK: En måte å detektere mRNA på membranen er å hybridisere 32 P-merket DNA-prober. FORSIKTIG: Researchers arbeider med 32p må bruke beskyttelses prosedyrer for å hindre forurensning. Følg institusjonelle retningslinjer for bruk av radioaktivt materiale.
- Fremstille DNA-probe ved å merke 25 - 50 ng av DNA som skal hybridiseres til membranen i henhold til standard protokoller 12. Generere DNA-fragment ved hjelp av PCR eller plasmid fordøyelsen. Bestemme den spesifikke aktiviteten til DNA-probe ved å telle 1 pl av den radioaktivt merkede DNA-proben etter at den uinkorporerte nukleotider fjernet 12.
- Forvarm prehybridiserings / hybridiseringsbuffer ved 42 ° C. Bruk ~ 10 ml prehybridiserings / hybridiseringsbuffer per 100 cm 2 av membranen 12.
- Hybridiserer 1-5 x 10 6 cpm radiomerket DNA-probe pr ml hybridiseringsbuffer til membran O / N i en ovn for å detektere hybridisering av mRNA av interesse 12. Sørge for at i løpet av hybridiseringen av hybridiseringen er rotasjonsovnen i en retning sombevirker at hele membranen å bli utsatt for hybridiseringsoppløsningen, for å sikre riktig hybridisering.
- Vask membranen to ganger ved RT i 15 minutter med 50 ml 2 x SSPE og en gang ved 65 ° C med 50 ml 2 x SSPE / 2% SDS i 15 minutter 12. Pakk membranen i plastfolie for å sikre at den ikke tørker ut eller forurense Fosfor skjermen.
- Ved hjelp av en Geiger-teller, beregne intensiteten av radioaktiviteten på membranen.
MERK: Dette anslaget sikrer at membranen er utsatt for fosfor skjermen for riktig mengde tid. Bruke lengre eksponeringstider for membraner med lave mengder radioaktivitet. - For nord blotter, bruke en lastekontrollen for å bekrefte at like mengder RNA er lastet på hvert sted. For å gjøre dette, strippe membranen og reprobe det med et RNA som ikke er berørt av prosessen som undersøkes. Strippe membranen ved å plassere den i et glass skuff som inneholder 200 ml kokende stripping løsning (0,1% SDS / 0,01 XSSC) i 2 min. Hell ut stripping løsning og gjenta prosedyren fem ganger 12.
MERK:. Et eksempel på en RNA brukes som en lastekontroll er SCR1 SCR1 er en RNA polymerase III transkript som er stabilt og rikelig SCR1 RNA overflod bør ikke endres vesentlig i løpet av korte perioder av RNA-polymerase II-inhibering..
6. Tall RNA som er bundet til membranen
NB: For å kvantifisere mengden av radioaktivitet på membran, utsette membranen for et fosforskjerm. Etter riktig eksponeringstid, skanne Fosfor skjermen ved hjelp av en phosphorimager.
- Skanne Fosfor skjermen ved hjelp av instruksjonene fra produsenten av phosphorimager.
- Kvantifisere mRNA ved hvert tidspunkt. Kvantifisere mRNA nivåer ved hjelp av Imagequant programvare eller tilhørende programvare. Normalisere mRNA ved hvert tidspunkt til lastekontroll. Hvis SCR1 ble anvendt som laste-kontroll, normalisere halveringstid northerns til SCR1.
- Halveringstiden av mRNA blir beregnet ved å dividere mengden av mRNA som er igjen på hvert tidspunkt av mengden av mRNA til stede på tidspunkt 0 (forsøksstart). Tegne den prosent mRNA værende versus tid på en halvlogaritmisk tomten (Figur 2C). Beregn mRNA-halveringstider ved den følgende ligning:
t 1/2 = -0,693 / k (negativ 0,693) - k er hellingen på den best passende linje og t 1/2 er mRNA-halveringstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muligheten av denne protokoll for å måle mRNA dempefaktorer avhenger av inhibering av transkripsjon, innhøsting av gjærceller ved de riktige tidspunkter, og utnyttelse av RNase frie teknikker, samtidig å ekstrahere RNA og northern blotting. Sentret for to kontroll mRNA som er kjent for å være ustabile og stabil, henholdsvis, gir tiltro til at eksperimentet virket. For eksempel kan dette bli oppnådd ved probing med en sonde som påviser både CYH2 pre-mRNA og mRNA. Figur 2B viser forsvinningen av CYH2 pre-mRNA i vill-type, og NMD-mutante gjærstammer ved ulike tidspunkt etter transkripsjon inhibering . Den CYH2 pre-mRNA er brutt ned raskere i gjærceller med en funksjonell NMD pathway (UPF1) i forhold til gjærceller med en ikke-fungerende NMD pathway (upf1).
40fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Metode flytskjema. Måling av mRNA forfall rente flytskjema
Figur 2. mRNA-halveringstiden for CYH2 -Pre-mRNA og mRNA. (A) Skjematisk representasjon av CYH2 pre-mRNA og CYH2 mRNA. CYH2 pre-mRNA spleises blir ineffektivt og transporteres til cytoplasma hvor den blir degradert av Sjøfartsdirektoratet sti. Den CYH2 mRNA er ikke degradert av Sjøfartsdirektoratet veien fordi den mangler intron inneholder prematur termineringskodonet (PTC). (B) Half-life nord blotter av RNA hentet fra villtype (UPF1) og NMD mutante stammer (upf1). Tidspunktene etter transcription hemming står oppført over nord blotter. Blottene ble probet med radioaktivt merket CYH2 DNA. (C) En grafisk fremstilling av% CYH2 pre-mRNA værende versus tid i villtype (UPF1) og NMD-mutant stammer (upf1). Denne grafen viser at CYH2 pre-mRNA er degradert på en raskere hastighet i villtype (UPF1) enn i Sdir mutante gjærstammer (upf1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemming av mRNA-syntese og overvåking mRNA omsetning i fravær av ny syntese er en metode som ofte brukes til å måle mRNA dempefaktorer. I S. cerevisiae, måling av mRNA dempefaktorer ved å hemme transkripsjon ved hjelp av temperaturfølsomme allel av RNA-polymerase II er en av de mest brukte metoder. Denne metoden spesifikt hemmer RNA polymerase II. De mest kritiske trinnene for bestemmelse av mRNA dempefaktorer ved hjelp av denne teknikken er: 1) Før høsting av gjærceller, sikre at transkripsjon er slått av ved å opprettholde kulturen ved 39 ° C; 2) I løpet av RNA ekstraksjon og RNA-gel-elektroforese trinnene i protokollen at RNase frie teknikker er brukt; 3) Bruk en kontroll RNA for normalisering for å sikre at like mengder RNA ble lastet, og at de eksperimentelle behandlinger fungerer som forventet; 4) gjenta mRNA degradering hastighetsmålinger minst tre ganger for å sikre reproduserbarhet end nøyaktigheten av halveringstid målinger.
rpb1-1 gjærstammer blir vanligvis overført til 37 ° C for å hemme transkripsjon. Vi har imidlertid funnet at ved 37 ° C inhibering av transkripsjon oppstår ~ 3 minutter etter temperaturforandringen. Ved 39 ° C transkripsjon inhibering er umiddelbar 4, 11. Imidlertid har bruken av denne teknikken for å bestemme mRNA dempefaktorer noen begrensninger. Den primære begrensning er at en spesiell gjærstamme er nødvendig. Som tidligere nevnt, kan denne gjærstamme enten oppnås fra andre laboratorier eller generert i laboratoriet hvis en bestemt gjær genetisk bakgrunn er nødvendig. Når gjærstamme blir oppnådd, er denne teknikken enkel og rett frem. En annen begrensning er at metoden innebærer å eksponere gjærcellene for å varme sjokk for å hemme transkripsjon. Varmestress kan påvirke cellulære prosesser, inkludert forfallet frekvensen av bestemte mRNA. For eksempel er reduksjonshastigheten av disse mRNA that kode for proteiner som er involvert i stressrespons kan påvirkes. Til slutt kan anvendelsen av en gjærstamme med en mutasjon i RNA-polymerase II resultere i produksjon av alternative transkripter som oppfører seg forskjellig fra de normale transkripter.
Som omtalt i innledningen, er andre teknikker benyttes for å måle mRNA dempefaktorer i S. cerevisiae. Dette inkluderer hemming av transkripsjon bruk kjemikalier som thiolutin og 1-10-fenantrolin. Disse teknikkene er en fordel i at de kan gjøres ved hjelp av en gjærstamme og mRNA dempefaktorer kan også bestemmes genome-wide eller for individuelle endogene transkripsjoner. I tillegg, kan mRNA-forfall hastighetsmålinger gjøres på forskjellige fysiologiske tilstander. Nytten av disse stoffene er begrenset av det faktum at de også kan påvirke cellulære prosesser og påvirke forfallet priser av mRNA forskjellig. I tillegg er thiolutin ikke er lett tilgjengelig, og når det er tilgjengeliger dyrt.
Etter å mestre denne teknikken vil man være i stand til å fastslå mRNA forfallet priser av individuelle mRNA eller genom-wide. I tillegg kan mRNA forfallet prisene måles i ulike fysiologiske forhold til å undersøke hvorvidt ulike forhold påvirker mRNA dempefaktorer forskjellig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background |
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
