Summary
Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.
Abstract
mRNA kararlı durum düzeyleri çevresel koşullara bağlı olarak değişir. Bir mRNA'nın kararlı durum birikimi seviyelerinin düzenlenmesi proteinin doğru miktarı, hücrenin özel büyüme koşulları için sentez edilmesini sağlar. MRNA bozulma oranlarını ölçmek için bir yaklaşım transkripsiyonu inhibe ve daha sonra zaten mevcut mRNA kaybolması izleme olduğunu. mRNA azalma oranını daha sonra tayin edilebilir ve doğru bir yarı ömür çeşitli teknikler kullanılarak tespit edilebilir. S. cerevisiae yarı ömürleri geliştirilmiştir mRNA ölçmek ve RNA polimeraz II, rpb1-1 bir sıcaklığa duyarlı allel liman suşları kullanılarak mRNA'nın transkripsiyonunu inhibe içerir protokolleri. Bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında kodlayan mRNA kullanılarak yarı ömürleri gibi alternatif thiolutin veya 1,10-fenantrolin gibi veya kopyalama önleyicileri ile transkripsiyonu inhibe içerir mRNA ölçmek için diğer teknikler,Bu tür galaktoz ile uyarılabilir promoteri ve TET off sistemi. Burada, biz S. ölçümü tanımlamak RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile cerevisiae mRNA bozunma oranları. Bu teknik, tek tek mRNA ya da genom çapında mRNA bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir.
Introduction
transkripsiyon ve spesifik mRNA bozunma gen ekspresyonunun önemli belirleyicilerdir. sentez ve özel mRNA'ların çürüme oranı o mRNA kararlı durum seviyesini belirler. mRNA'lann kararlı durum düzeyleri mRNA bereket yöneten ve protein sentezi için ne kadar her mRNA belirler. MRNA yarı hayatımızın Ölçümler mRNA çürüme hızını belirlemek için yoğun olarak kullanılmaktadır. MRNA, mRNA ve çevre koşulları ile kodlanan proteinin fonksiyon özellikleri ile ilgili farklı oranlarda özel mRNA'lar bozunma. MRNA bozulma oranlarını belirlemek için kullanılan tekniğe bağlı olarak, çürüme hızı ölçümleri ya küresel ya da bireysel transkript için tespit edilebilir. Maya S. olarak cerevisiae, yaygın genel mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan teknikler, RNA polimeraz II ve kimyasal transkripsivonel sıcaklığa duyarlı allel barındıran bir maya suşu kullanılarak içerirBu tür thiolutin ve 1,10-fenantrolin 1-5 gibi riptional inhibitörleri yer alır. Bu yöntemler ferdi mRNA bozunma hızını 4 ölçmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler, ayrıca, mRNA'nın bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, kararlı durum etiketleme veya yalnızca belirli koşullarda eksprese edilen bir düzenlenmiş arttırıcının eksprese edilen mRNA moleküllerinin kullanımına yolla uygulanabilir. Bu tekniklerin her biri belirli avantajlara ve sınırlamalar vardır. Burada anlatılan teknik, RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel kullanmaktadır. Bu yöntem, S. kullanır cerevisiae modeli olarak, spesifik transkripsiyon inhibisyon teknikleri 6 kullanan diğer sistemlerde değiştirilmiş ve kullanılmıştır ama.
RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile mRNA yarı ömrü ölçümleri kapsamlı mRNA bozulma 4-5 iki genom ve tek tek ölçümler için kullanılmıştır. Bu teknik, bir Belir kullanımını gerektirirRNA polimeraz II, rpb1-1 1 'in bir sıcaklığa duyarlı allel barındırır ic maya suşu. Bu teknik için mantık infeksiyona izin vermeyen sıcaklık sıcaklığa duyarlı maya soyunun maruz mRNA sentezini inhibe olmasıdır. Transkripsiyon inhibe sonra Daha sonra, önceden mevcut olan mRNA çürüme farklı zaman noktalarında izlenir. önceden var olan mRNA kaybolması transkripsiyon kapatıldıktan sonra farklı zaman noktalarında, maya hücrelerinden RNA ekstre ederek izlenir. maya hücreleri hasat olduğu zaman noktaları pilot deney tarafından önceden belirlenmiş ve transkript ve sistem araştırılıyor bağlıdır edilmektedir. Daha uzun bir zaman noktaları uzun yaşayan transkript için kullanılır ise daha hızlı zaman noktalarında, kısa ömürlü transkript için kullanılır. Daha sonra, mRNA'nın çürüme ya da Kuzey benek analizi, kantitatif PCR ya da RNAseq ile izlenir.
Bir te kullanarak mRNA yarı ömürleri ÖlçümüRNA polimeraz II mperature duyarlı allel avantajları vardır. Öncelikle, bu teknik yalındır kolay ve. İkinci olarak, maya cinsi, mRNA, yarı ömrü ölçümleri değişik büyüme koşulları belirlenebilir laboratuarda elde edilen veya oluşturulan bir kez; mRNA çürüme çevre etkisinin belirlenmesi sağlayan. Üçüncü olarak, mRNA, bozunma oranları genom izlenebilir. Diğer transkripsiyon önleme tekniklerinin kullanımı da avantajları ve sınırlamaları vardır. Örneğin, bir uyarılabilir promoterin kullanılması düzenlenmiş bir arttırıcının kontrolü altında olan bir mRNA üretmek üzere subklonlama gerektirir. Thiolutin hazır değil ve zaman pahalı kullanılabilir. Ayrıca, eylem thiolutin en modu tam olarak anlaşılamamış ve mRNA çürüme 7 inhibe dahil olmak üzere diğer hücresel süreçleri etkilediği bildirilmiştir. Seçenek olarak ise, 1,10-fenantrolin, daha kolaylıkla temin edilebilir. Bundan başka, tüm teknikler pert olabilir transkripsiyonunu inhibe etmek için kullanılırHücresel fonksiyonu URB ve farklı şekillerde farklı mRNA'ları etkileyebilir. Bir araştırmacı, en güvenilir sonuçlar elde etmek için deneysel koşullarda kullanmak için en uygun yöntemi belirlemek gerekiyor. Uygulama için en uygun olan yöntem belirlemek için, bir araştırmacı araştırılmaktadır transkript tarafından kodlanan proteinlerin transkript ve işlevini tanımlamak gerekiyor. en güvenilir mRNA çürüme oranı ölçümleri birden teknikler kullanılarak ve aynı çürüme oranı gösteriyor belirlenir olanlardır. Tek bir tekniktir her zaman en iyi ve en uygun tekniği özel duruma bağlıdır.
S. sayısız çalışma cerevisiae çeşitli koşullarda ve genetik geçmişleri mRNA çürüme oranları ölçüldü. mRNA çürüme oranları ölçülür olduğu koşulların belirli deney araştırılıyor bağlıdır. Koşullar olmanın olsun farklı hücresel ortamlarda mRNA bozulma oranlarını Ölçme belirlertercihen özel mRNA bozulma oranlarını etkileyen incelenir. mRNA çürüme oranları da kullanılan maya suşu bağlı olarak değişebilir. Örneğin mRNA, bozunma oranları işlevsiz bir saçma kaynaklı mRNA azalma (NMD) yolu ile yabani tip maya hücreleri ve maya hücreleri belirlenebilir. Bu mRNA bozulması yolu şimdiye kadar incelenmiş tüm ökaryot organizmalarda bulunan ve erken çeviri 8 sonlandırmak mRNAların bozulmasını tetikler. NMD başlangıçta erken sonlandırma edilen ya da anlamsız kodonlanyla mRNA'ları düşürür bir yol olarak tespit edilmiştir, ama şimdi de doğal mRNA'ları içermeyen saçmalık ifadesini düzenleyen bir yol olarak kabul edilmektedir. yolunun hedefleri mRNA'lar hızla fonksiyonel NMD yolu ile maya hücrelerinde parçalanır ve fonksiyonel olmayan NMD yolu ile maya hücrelerinde stabilize edilir. Bu nedenle, bu yolağın doğrudan hedefleri olan mRNA yarı-ömürleri, yabani tip maya cel daha kısadır veBir fonksiyonel olmayan NMD yolu ile, maya hücreleri ile karşılaştırıldığında mi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Maya hücrelerinin 1. Büyüme
- MRNA bozulma oranı ölçümleri için kullanılacak uygun maya suşları seçin. RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe etmek için, rpb1-1 mutasyon 1 barındıran maya suşları kullanılır. Zaten var laboratuar bu maya suşu elde edilir, ya da belirli bir genetik arka 9 gerekli ise, standart teknikler kullanılarak laboratuarda üretecektir.
- Standart prosedürler kullanılarak 10 maya ortamı hazırlamak, steril tekniği kullanarak. Hiçbir seçim gerekiyorsa, örneğin YPD gibi zengin medya hazırlamak. Plasmidler ve seçimi ile transforme edilmiş maya hücreleri gerekli ise, alternatif olarak, seçici ortam hazırlar. Medya otoklavlayın.
- Bu maya suşu için müsamahakar sıcaklık 28 ° C'de maya hücreleri büyütün. İki adımda yapın:
- İlk olarak O / N için, doyma noktasına kadar büyüme ortamı 5 ml maya hücreleri büyür.
- İkinci günün sonunda ikinci O / N ayarlayın. Ikinci O / N, ilk olarak O / N, 100 ul 1 mi, 2 ml veya daha fazlasına kadar değişen büyüme ortamı (100-150 ml maya hücrelerinin farklı miktarlarda inoküle bağlı olarak maya hücreleri gerektiğinde ) ertesi gün toplandı. Kültürlerinden biri doğru OD 600 Ertesi gün olmasını sağlamak için bu adımı yapın.
2. Hasat Maya Hücreleri
- Maya hücreleri hasat hazırlayın. Bu aşama için zamanlama önemlidir; Gerekli tüm tüpleri etiket ve tek bir yerde tüm gerekli ekipman ve malzemeleri toplamak. 39 ° C bir su banyosu önceden ısıtmak ve C 28 ° C 'de ve 60 ° C'de büyüme ortamı içinde iki adet 15 ml'lik deney tüpleri ısıtın.
NOT: 15 mi büyüme ortamı hacmi hücreleri hasat edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak değişebilir. - Onlar 0,7 bir OD 0.4 600 ulaştığınızda maya hücreleri Hasat. Transfer 4 hücreler - 50 6 steril ml kap şişe vida. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yüksek hızlı santrifüj içinde 7500 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatant atılır ve 28 ° C'de dengeye 15 mi büyüme ortamı içinde pelet tekrar süspansiyon. Bir steril 250 ml'lik bir şişe içinde maya hücreleri havuzda toplayın ve 28 ° C artış sıcaklıkta ~ 5 dakika boyunca, onları dengeye getirin.
- Maya hücreleri büyüme sıcaklığında dengeye ulaştıktan hemen sonra, 39 ° C (infeksiyona izin vermeyen sıcaklık) kadar ısısını yükseltmek için 60 ° C 'de dengelenmiş bir büyüme ortamı 15 ml ilave edilir ve hemen 39 ° C su banyosu içine yerleştirilir . Kültür ortamı, transkripsiyon kapalı olduğundan emin olmak için, kalan hücre hasat etme aşamalarının boyunca 39 ° C su banyosu içinde kalmasını sağlayın.
- 39 ° C su banyosu içinde bir balon yerleştirdikten sonra farklı zamanlarda hücreler hasat edilir. İlk kez noktası için, 39 & # de balon yerleştirdikten sonra hemen hücreler hasat176 ° C. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir 3 ml'lik bir şişe Hasat ve ikiye 3 ml dağıtın. Mini santrifüj içinde 10 saniye boyunca pelet hücreleri veya hızlı yavaşlama ile picofuge ve süpernatant dışarı dökün.
- Hemen bir kuru buz / etanol banyosu içinde veya sıvı azot içinde dondurularak pelet. Hücreler sıfır zaman noktası olarak hasat ilk kez noktasını belirleyin.
- Deneysel olarak ilgi mRNA bağlı olarak, bir pilot deneyi ile hücreler daha sonra hasat edilmiş zaman noktaları belirlenir. Normal olarak, aşağıdaki zaman noktalarında, hasat maya hücreleri: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 ve 35 dakika (Şekil 2B). MRNA yarılanma ömrü yukarıda belirtilen zaman noktalarını kullanarak tespit edilemiyorsa, bu sefer noktaları ayarlayın. Örneğin, beklenen kısa yarı ömürlü mRNA için, daha kısa süreler noktaları kullanarak (örneğin, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ve 18 dakika) ve beklenen uzun yarı ömürleri olan mRNA için genişletmek zaman noktalarında.
- Sonra hücreler, hektar olanRNA ekstraksiyon yapılır kadar rvested, -80 ° C derin dondurucuda saklayın.
Maya Hücreleri 3. Özü RNA
- Protokol RNA ekstraksiyon kısmı için, RNaslar göre RNA bozulmasını önlemek için RNazsız tekniklerini kullanır. RNazsız çözümler, cam ve plastik eşya RNA ekstraksiyon kullanılacak hazırlayın.
- , Standart protokollere göre, maya hücrelerinden RNA ekstrakte edin. Tipik haliyle, sıcak fenol metodu 12 kullanımı. Seçenek olarak ise, maya hücrelerinden RNA çıkarmak için kullanılabilir setleri kullanın.
- Normal olarak bir 260 emicilik ve Nanodrop kullanılarak RNA'nın bir 280 2 ul ölçülerek, RNA miktarı ve saflık belirler. Konsantrasyonuna göre bir 260 RNA konsantrasyonu belirlemek, 1 ug RNA seyreltik / DEPC işlenmiş su ile ul.
NOT: Bir 260 oranı / t hakkında bilgi sağlayan bir 280RNA o saflık. A 260 / A 280 oranı 2.0 ± 0.1 ise bir RNA örneği saf.
4. Northern Blot analizi
NOT: mRNA düzeylerini ölçmek ve transkript boyutu hakkında bilgi almak için kuzeydeki lekeleri kullanın. Buna ek olarak, aynı mRNA'nın çok izoformlar üretmek mRNA'ların saptamak için northern blot kullanır.
- % 1.0 agaroz-formaldehid jel hazırlayın. Standart protokollere göre 12 elektroforez ile agaroz formaldehit jel üzerinde örnek RNA eşit miktarda çalıştırın. RNA örnekleri yanında bir RNA merdiveni çalıştırın ve kuzey leke tespit edilir RNA boyutlarını belirlemek için kullanabilirsiniz. Bir zar agaroz formaldehit jel üzerinde ayrılmış RNA aktarmadan önce, jel RNA merdiveni ile sokağın kesti ve etidyum bromür kullanarak görselleştirmek.
NOT: Alternatif olarak, tüm jel RNA transferinden önce etidyum bromür ile boyanmış olabilir. - Birfter RNA numuneleri jel üzerinde uygun bir mesafede göç etti RNazsız teknikler kullanılarak bir zara RNA aktarın. Membranların 12-13 kadar RNA aktarmak için kullanılabilecek birkaç protokollerden birini kullanın. Bir membrana transfer etmek için RNA, jel ile yaklaşık olarak aynı boyuta membran kesti. Standart protokollere göre 12 RNA aktarın.
- UV üreticisinin yönergeleri izleyerek UV çapraz bağlayıcı kullanılarak membran RNA çapraz bağlantı. Seçenek olarak ise, 1 saat boyunca 80 ° C'ye ayarlanmış bir fırın içinde membran fırında. Belirli problara hibridize edilir kadar belirsiz bir süre, bir plastik torba içinde -20 ° C de membran saklayın.
NOT: Kuru zar da filtre kağıtları arasında oda sıcaklığında saklanabilir.
5. melezleşen Problar Membran İlgi RNA Tamamlayıcı
NOT: zar üzerinde mRNA'yı tespit etmek için bir yol 32P olarak etiketlenmiş DNA sondaları hibridize etmektir. DİKKAT: Resea32 P ile çalışan rchers kontaminasyonu önlemek için koruyucu prosedürleri kullanmak gerekir. Radyoaktif madde kullanımı ile ilgili kurumsal kurallara uyun.
- 25 etiketleme DNA probu hazırlayın - DNA 50 ng standart protokollere göre 12 zara hibridize edilecek. PCR ya da plazmid sindirme ile DNA fragmanını üretir. Adi nükleotidleri 12 çıkarıldıktan sonra radyo-etiketli DNA probu 1 ul sayılarak DNA probu spesifik aktivitesini belirler.
- 42 ° C'de ön ısıtma ön hibridizasyon / hibridizasyon tamponu. Membran 12, 100 cm2 başına ön hibridizasyon / hibritleme tampon maddesi ile 10 mL kullanın.
- 1 melezleşme - membran O hibridizasyon tampon ml'si başına, radyo-etiketli bir DNA probu, 5 x 10 6 cpm /, bir hibridizasyon etüvü içinde bir N ilgi 12 mRNA'yı tespit etmek için. Melezleme sırasında hibridizasyon fırın dönme bir yönde olduğundan emin olun kitüm membran uygun hibridizasyon sağlamak için, hibridizasyon çözeltisine maruz neden olur.
- 2x SSPE, 50 ml ve 15 dakika 12 2x SSPE /% 2 SDS, 50 ml 65 ° C de bir kez 15 dakika için oda sıcaklığında, membran iki kez yıkayın. O kurumasına veya Fosfor ekranı kontamine olmadığından emin olmak için plastik wrap membran sarın.
- Bir Geiger sayacı kullanarak, membran üzerindeki radyoaktivite yoğunluğunu tahmin ediyoruz.
NOT: Bu tahmin membran zaman uygun miktarda fosfor ekranına maruz kalmasını sağlar. Radyoaktivite düşük miktarlarda zarlar daha uzun maruz bırakma sürelerinin kullanılması. - Kuzey lekeleri için, RNA eşit miktarlarda her yerinde yüklenen onaylamak için bir yükleme denetimi kullanın. Bunu yapmak için, membran şerit ve işlem incelenen etkilenmez bir RNA ile yeniden taranması. XS sökme çözeltisi (% 0.1 SDS / 0.01 kaynayan 200 ml ihtiva eden bir cam tepsi üzerine yerleştirerek, membran şerit2 dakika boyunca SC). Sıyırma çözüm dökün ve prosedür beş kez tekrarlayın 12.
NOT:. Bir yükleme kontrolü olarak kullanılan bir RNA örneği SCR1 olan SCR1 istikrarlı ve bol bir RNA polimeraz III transkript olan SCR1 RNA bereket RNA polimeraz II inhibisyonu kısa dönemlerde önemli bir değişiklik olmamalıdır..
6. Membran Bound olan RNA niceliğini
NOT: zar üzerindeki radyoaktivite miktarını ölçmek bir fosfor ekranına membran göstermek için. Uygun pozlama süresinden sonra, bir fosforimager kullanılarak Fosfor ekranını tarayın.
- Phosphorimager üreticisi tarafından sağlanan talimatları kullanarak Fosfor ekranını tarayın.
- Her bir zaman noktasında mRNA ölçmek. ImageQuant yazılım veya ilgili yazılım kullanarak mRNA düzeylerini ölçmek. Yükleme kontrolü için her bir zaman noktasında mRNA normalize edilir. SCR1 yükleme olarak kullanılmışsaKontrol, SCR1 için yarılanma ömrü Northerns normalleştirmek.
- mRNA bir yarılanma ömrü alanına 0 mRNA mevcut miktarıyla her zaman noktasında kalan mRNA miktarını (ilk zaman noktası) bölünmesi ile hesaplanır. Semilogaritmik arsa (Şekil 2C) üzerine, zamana karşı olarak kalan mRNA grafik. Aşağıdaki denklem ile mRNA yarı ömürleri hesaplayın:
t 1/2 = -0,693 / k (negatif 0.693) - k en uygun doğrunun eğimi ve t 1/2 mRNA yarı-ömrü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA ve kuzey blotting ayıklanması sırasında doğru mRNA bozulma oranlarını ölçmek için bu protokolün yeteneği RNazsız tekniklerin transkripsiyonu inhibe, uygun zaman noktalarında maya hücreleri hasat ve kullanımına bağlıdır. Sırasıyla, stabil olmayan ve kararlı olduğu bilinmektedir iki kontrol mRNA araştırmayı deney çalışan güven sağlar. Örneğin, bu ve mRNA ön CYH2 iki tespit eden bir prob ile tarama gerçekleştirilebilir oluşturulmaktadır. Şekil 2B, transkripsiyon inhibisyonu sonra farklı zaman noktalarında, vahşi tipli ve NMD mutant maya türleri içine eksprese CYH2 ön-mRNA'nın yok olduğunu ortaya koydu . CYH2 ön-mRNA, fonksiyonel olmayan NMD hattı (upf1) ile, maya hücreleri bir işlevsel NMD yolu (UPF1) nisbetle daha hızlı maya hücrelerinde parçalanır.
40fig1highres.jpg "/>
1. Yöntem akış şemasını Şekil. MRNA çürüme oranı akış şeması ölçümü
Şekil 2. mRNA'nın CYH2 yarılanma ömrü -Ön mRNA ve mRNA (A). CYH2 ön-mRNA ve CYH2 oluşturulmaktadır. CYH2 ön-mRNA'nın şematik temsili verimsiz olarak eklenmiş ve NMD tarafından bozundurulmakta sitoplazmaya taşınır yolu. Bu prematür bir terminasyon kodonu (PTC) ihtiva eden intron olmadığı için CYH2 mRNA NMD yolu ile azaltılmaz. (B), vahşi tip (UPF1) ve NMD mutant soylar (upf1) elde RNA yarı-ömür kuzey lekeleri. tra sonra zaman noktalarıoyma yazıyı inhibisyonu kuzey lekeleri, yukarıda listelenmiştir. Lekeler ile problandı radyo-etiketli CYH2 DNA arasında değişir. (C),% CYH2 ön-mRNA, vahşi tip (UPF1) ve NMD mutant soylar (upf1) zamana karşı kalan bir grafiktir. Bu grafik, CYH2 ön-mRNA, NMD mutant maya türleri (upf1) göre, vahşi tip (UPF1) 'de daha hızlı bir oranda düşer olduğunu gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MRNA sentezinin ve yeni sentez yokluğunda mRNA değişmesi takip durdurulması sıklıkla mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. S. cerevisiae RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe mRNA bozunma oranları ölçümü en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntem, özellikle, RNA polimeraz II inhibe eder. Bu tekniği kullanarak, mRNA bozulma oranlarının belirlenmesi için en kritik adımlar şunlardır: 1) maya hücreleri hasat önce, bu transkripsiyon 39 ° C'de kültürü koruyarak kapatmak olmuştur sağlanması; 2) protokol RNA ekstraksiyon ve RNA jel elektroforezi adımları sırasında RNazsız teknikler kullanılmasını sağlamak; Normalleştirme deneysel tedaviler beklendiği gibi çalıştıklarını yüklenen RNA, eşit miktarda sağlamak ve 3) bir kontrol RNA kullanın; 4) uyarlık An sağlamak için en az üç kez mRNA çürüme oranı ölçümleri tekrarlamakyarılanma ömrü ölçümleri d doğruluğu.
rpb1-1 maya cinsleri, normal olarak transkripsiyonu inhibe etmek için 37 ° C'de aktarıldı. Bununla birlikte, transkripsiyon 37 ° C inhibisyonda bir sıcaklık geçişi sonra ~ 3 dak meydana bulmuşlardır. 39 ° C transkripsiyon inhibisyonu hemen bir anda 4, 11. Ancak, mRNA bozulma oranlarını belirlemek için bu tekniğin kullanımı bazı sınırlamalar vardır. Birincil sınırlama özel bir maya suşu gerekli olmasıdır. Daha önce belirtildiği gibi, bu maya kökü ya da diğer laboratuarlardan temin edilebilir veya belirli bir maya genetik altyapı gerekli ise laboratuarda üretilen. Maya suşu elde edildikten sonra, bu teknik yalındır basittir. İkinci sınırlama yöntemi transkripsiyonunu inhibe etmek ısı şokuna maya hücreleri açığa gerektirir olmasıdır. Isı stresi özellikle mRNA çürüme oranı dahil olmak üzere hücresel süreçleri etkileyebilir. Bu mRNA çürüme oranı tha Örneğinstres yanıtına yer alan proteinlere t kodlayan etkilenebilir. Son olarak, RNA polimeraz II, bir mutasyon içeren bir maya soyunun kullanılması normal bir transkript farklı davranır alternatif transkriptleri üretilmesine neden olabilir.
Giriş bölümünde tartışıldığı gibi, diğer teknikler, S. mRNA bozunma hızını ölçmek için kullanılan çeşitli cerevisiae. Bu tür thiolutin ve 1-10-fenantrolin gibi kimyasallar kullanarak transkripsiyon önlenmesini içerir. Herhangi bir maya suşu kullanılarak yapılabilir ve mRNA bozunma oranları da genom ya da tek tek endojen kopyaları için olan tespit edilebilir ki bu teknikler avantajlıdır. Buna ek olarak, mRNA bozulma hızı ölçümleri değişik fizyolojik koşullar altında yapılabilir. Bu ilaçların programı aynı zamanda hücresel işlemleri etkileyen ve diferansiyel mRNA bozunma hızını etkileyebilir olması ile sınırlıdır. Ayrıca, thiolutin hazır ve kullanılabilir değilpahalıdır.
Bu tekniği mastering sonra bir bireysel mRNA'lardan veya genom çapında mRNA bozulma oranlarını belirlemek mümkün olacak. Buna ek olarak, mRNA bozulma oranları farklı koşullar farklı şekilde mRNA bozulma oranlarını etkileyip etkilemediğini incelemek için farklı fizyolojik koşullarda ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background |
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
