Abstract
Konventionelle metoder til eksperimentel manipulation af mikroalger har anvendt store mængder af kultur (20 ml til 5 L), således at kulturen kan subsampled hele eksperimentet 1-7. Undersampling af store mængder kan være problematisk af flere årsager: 1) det forårsager variation i den samlede mængde og overfladeareal: volumen-forholdet af kulturen under eksperimentet; 2) pseudo-replikation (dvs. replikere prøver fra den samme behandling kolbe 8) er ofte ansat i stedet for sande gentagelser (dvs. prøveudtagning fra gentagne behandlinger); 3) varigheden af forsøget er begrænset af det totale volumen; og 4) Axeniske kulturer eller den sædvanlige bakterielle mikrobiota er vanskelige at opretholde i langvarige forsøg som forurening almindeligvis forekommer under delstikprøver.
Brugen af mikrotiterplader giver 1 ml mængder kultur, der skal anvendes til hver kopiere, med op til 48 særskilte behandling indenen 12,65 x 8.5 x 2.2 cm plade, den eksperimentelle volumen dermed mindske og giver mulighed for omfattende replikation uden delstikprøver nogen behandling. Derudover kan denne teknik være modificeret til at passe til en række eksperimentelle formater, herunder: bakteriel-algernes co-kulturer, alger fysiologi tests og toksin screening 9-11. Kan udtages prøver individuelle brønde med en alge, bakterie og / eller co-kulturer for mange laboratorieprocedurer, herunder, men ikke begrænset til: WATER-Pulse-amplitudemodulerede (vand-PAM) fluorometri, mikroskopi, bakteriel kolonidannende enhed (CFU) tæller og flowcytometri. Kombinationen af mikrotiterpladeformat og vand-PAM fluorometri giver mulighed for flere hurtige målinger af fotokemisk udbytte og andre fotokemiske parametre med lav variabilitet mellem prøver, høj reproducerbarhed og undgår de mange faldgruber subsampling en ballon eller konisk kolbe i løbet af et eksperiment .
Introduction
Fytoplankton fysiologi har traditionelt været undersøgt i meso-skala forsøg fra 20 ml i koniske kolber til 5 L i dunke 1-7. Denne eksperimentelle skala kræver subsampling for eksperimentel overvågning, som at ofre, der udtages for hvert tidspunkt skaber en uoverskuelig forsøgsopstilling.
Evnen til at øge antallet af uafhængige forsøg, mens du bruger den samme døgnets inkubator plads ved miniaturisering den eksperimentelle volumen for algernes fysiologi eksperimenter vil reducere eller fjerne de begrænsninger af undersampling og pseudo-replikation fra store mængder. En mikrotiterpladeformat er udviklet til alger bioassays under anvendelse af en 1 ml kultur volumen for eksperimentelt manipulere alger i variable forhold. Denne lille eksperimenterende volumen giver mulighed for antallet af gentagelser øges, øger eksperimentel reproducerbarhed på grund af en nedsat variabilitet mellem udtages ogforsøg, og giver ægte replikation samtidig opretholde eksperimentelle kontroller (dvs. Axeniske algekulturer) for 140 dage (figur 2) 12.
Denne mikrotiterpladeformat kan nemt tilpasses til en række eksperimentelle spørgsmål, såsom: betyder en bakterie har et symbiotisk, neutral eller patogen interaktion med alger vært? Er tilsætning af en forbindelse til at stimulere eller giftige for en alge? Disse og andre spørgsmål kan behandles i en hurtig high-throughput måde under anvendelse af dette nye format 9-11.
En 48-brønds mikrotiterplade dyrkningsplade tillader hver 1 ml godt at være en uafhængig forsøgsopstilling, der er samplet ved en enkelt gang-point. Kan udtages prøver forskellige parametre fra denne 1 ml volumen, herunder, men ikke begrænset til: klorofylfluorescens og fotokemiske parametre ved hjælp af vand-Pulse-amplitudemodulerede (vand-PAM) fluorometri (se materialer og udstyr tabel) 13. VAND PAM fluorometri er en hurtig og ikke-invasiv teknik, der kan anvendes til at overvåge eksperimenter udført med alger 13. Det giver mulighed for måling af fotosyntetiske effektivitet og PSII sundhed fra en lille kultur volumen (150-300 pi kultur fortyndet i medium til en 2 - 4 ml volumen for VAND PAM) 14,15. Ud over vand-PAM fluorometri, kan denne opsætning anvendes til at måle en række andre parametre, herunder, men ikke begrænset til: mikroskopi at visualisere bakterierne knyttet til algeceller og ændringer i alge cellemorfologi; bakterielle kolonidannende enhed (CFU) tæller; og flowcytometri for algernes celletal og identifikation subpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beregninger for forsøgsopstilling
- Beregn mængden af alger og / eller bakteriekulturer, der er nødvendige for kontrollen, der vil være påkrævet for hele eksperimentet ved hjælp af ligning 1:
Hvor y er lig med antallet af kontroller er nødvendige per dag og z er lig med antallet af dage. - Beregn mængden af algernes og / eller bakteriekulturer, der er nødvendige for co-kulturer til forsøget ved hjælp af ligning 2:
BEMÆRK: Det er muligt at erstatte "co-kultur 'eksperimenter med enhver forbindelse skærmen; bare justere slutforbindelsen, opløsningsmiddel og alger koncentrationer til at passe den eksperimentelle design. - Brug ligning 1 og 2 for at beregne det endelige volumen af tidlig eksponentiel algekulturen (almindeligvis 5 dage for ~ 10 4 celler / ml, men dette bør afgøres af performing en algevækst kurve), der kræves til eksperimentet (denne mængde er nødvendig for trin 2.3) ved anvendelse af ligning 3:
- Brug ligning 1 og 2 til at beregne det endelige volumen af 10 4 CFU / ml bakteriekultur (eller ønsket podning koncentration), der kræves for eksperimentet (denne mængde er nødvendig for trin 4.2) ved anvendelse af ligning 4:
BEMÆRK: Brug de ekstra 10 ml i trin 1.3 og 1.4 for at tegne sig for pipetteringsfejl og eventuelle tests, der udføres (f.eks VAND PAM, flowcytometri, mikroskopi, etc.) på 0 d. Øg denne mængde, hvis nødvendigt for at passe den eksperimentelle design.
BEMÆRK: For et eksempel beregning af en 8-dages eksperiment se afsnit 10. Se supplerende tabel for medier opskrifter.
2. Voksende algeceller til forsøgsopstilling
- Isolere eller opnå enaktivt voksende axenisk algekulturen.
- Overfør aseptisk 10% af det endelige volumen af algekulturen i sterilt alge medium (f.eks L1 eller lignende marine alger medium, se Materialer og udstyr tabel), hvilket sikrer en 1: 9 fortynding af algekulturen i frisk medium. Grow fortyndet alge i en daglig inkubator ved hjælp tidligere bestemte vækstbetingelser for denne stamme (f.eks 18 ° C med en 16: 8 timers lys: mørke-cyklus er almindeligt anvendt).
- Når kulturen har nået tidlig eksponentiel fase, re-kultur algen i samme sterile alge medium (f.eks L1 eller lignende marine alger medium), sikrer den endelige koncentration er en 1: 9 fortynding og at den endelige mængde af alger er lig med V A beregnes (trin 1.3).
BEMÆRK: Det er vigtigt at sikre, at disse kulturer er aksenisk. Test alle alge medier og algernes lager flasker til forurening med plettering en 20 pi alikvot på en generel marine bakterielt medium (f.eks MarineBroth 2216 suppleret med 1,5% agar eller lignende). - Grow algekulturen til tidlig eksponentiel fase (~ 10 4 celler / ml).
BEMÆRK: Hver alge stamme har en unik vækstkurve afhængig dyrkningsbetingelser. Tidlig-eksponentielle fase (~ 10 4 celler / ml) kan bestemmes ved at udføre en algevækst kurve baseret på celledensitet (dvs. ved anvendelse af flowcytometri eller mikroskopi).
3. Forberedelse bakterieceller til podning
- Pre-bestemme den bakterielle koncentration (cfu / ml) og optisk densitet (OD) af bakterien på stationær fase ved at gøre en vækstkurve i de valgte bakterielle medium og vækstbetingelser (f.eks Marine Broth 2216 ved 25 ° C og 160 rpm, eller lignende). Brug disse oplysninger til at dyrke cellerne (trin 3.3) og senere til at fortynde cellerne korrekt i trin 3.7.
- Overfør aseptisk en isoleret og frisk dyrket bakteriekoloni fra en agarplade 1,5% (fx Marine Broth 2216 smidigmenteret med 1,5% agar eller lignende marine bakteriel fast medium) i 5 ml bakteriel flydende medium (f.eks Marine Broth 2216 eller lignende marine bakteriel medium).
- Grow bakterien til stationær fase på en rullende tromle eller shaker (~ 12-36 timer, afhængigt af bakterie). Plan eksperimentet så bakterien når stationær fase (~ August 10 - September 10 cfu / ml) på samme tid at algecellerne har nået den tidlige eksponentielle fase (~ 10 4 celler / ml).
- Ved hjælp af en pipette, vaske ned enhver biofilm knyttet til reagensglasset i mediet. Der afpipetteres 1 ml velblandet bakteriekultur i en steril 1,5 ml mikrorør. Centrifugeres i 1 min ved 14.000 x g.
- Fjern og bortskaf supernatanten (bakteriel medier) uden at forstyrre pellet (bakterieceller). Tilsæt 1 ml sterilt alge medier (f.eks, L1 eller lignende) til mikrorør (med pellet). Vortex mikrorør at resuspendere pellet i alge medier.
- Anden vask:Gentag trin 3.5.
BEMÆRK: Det er vigtigt at vaske de bakterielle celler med alger medier for at grundigt at fjerne alle de bakterielle medier, celle efterladenskaber, udskilles proteiner og små molekyler fra cellerne før podning algerne med dem, da det kan ændre ernæringsmæssige sammensætning af algernes medier eller indføre bioaktive molekyler til skærmen. - Serielt fortynde de vaskede bakterieceller i alge- medier til en slutkoncentration, der er 100 gange mere koncentreret end den ønskede endelige bakteriel koncentration (cfu / ml). Gem mikrorør indeholdende celler, der er blevet vasket og udvandet i alge medier til trin 4.2.
BEMÆRK: Planlæg forsøget bygger på at have en 1: 1-forhold af alger til bakterier på 0 d. For at gøre dette den ønskede indledende bakteriekoncentration for eksperimentet er 10 4 cfu / ml, så i trin 3.7 de første celler skal seriefortyndes til 10 6 cfu / ml.
4. Forberedelse Bakterier til eksperimental opsætning
- Forbered 4 sterile autoklaveres glas koniske kolber og mærke dem: a) »alge kontrol kolbe«, b) »fortyndet bakteriel stock kolbe«, c) »bakteriel kontrol kolbe«, og d) »co-kultur kolbe.
- Bakteriesuspensionen fra fortyndes trin 3.7 1:99 med sterile alger medier til et slutvolumen = V B (trin 1.4). Gør fortyndingen i kolben mærket fortyndet bakteriel lager (trin 4.1).
BEMÆRK: I det forrige eksempel (trin 4.2), giver det 1:99 fortynding en endelig koncentration på 10 4 cfu / ml. Swirl kolbe at blande celler. - Pipette V kontrol (trin 1.1) fra den fortyndede bakterielle lager og sætte det i den bakterielle kontrol kolben.
- Pipette V kontrol sterilt alge medium ind i bakterielle kontrol kolben (dette er en 1: 1 fortynding). Swirl kolbe at blande celler og der er afsat til trin 7.3.
- Pipette V co-kultur fra den fortyndede bakterielle lagerkolbe til co-kultur kolbe, sæt kolbe afsat til trin 6.1.
BEMÆRK: Når du gør flere co-kulturer på den samme alge på én gang (dvs. en co-kultur af to forskellige bakterielle isolater med en kontrol) er det nødvendigt at genberegne V co-kultur for hver stamme individuelt og derefter gentage trin 4.5 for hver co-kultur separat. Det er også nødvendigt at øge V A beregnet i trin 1.3 omfatter både co-kulturer vist i ligning 5:
5. Forberedelse Alger til forsøgsopstilling
- Bland forsigtigt den tidlige eksponentiel algekulturen (fra trin 2.4) med en bred mund pipette spids indtil celler synes godt blandet.
- Pipette V styring fra alge bestand flasken til alge kontrol kolben. Pipette forsigtigt under anvendelse af en 10 ml pipette. Derefter returnere alge bestand flaske i døgnets inkubator.
- Pipette V control sterilt alge medium til alge kontrol kolben (dette er en 1: 1 fortynding). Swirl at blande kolbe og plads i døgnets inkubator, indtil der er brug for trin 7.4.
6. Forberedelse Eksperimentel Co-kultur
- Pipettere forsigtigt V co-kultur fra den alge bestand kolben i den bakterielle co-kultur kolbe fra trin 4.5. Co-kultur kolbe Retur til døgnets inkubator indtil det skal bruges til trin 7.5.
BEMÆRK: Koncentrationen af bakterier i den bakterielle kontrol skal være lig den bakterielle koncentration i den eksperimentelle co-kultur. Tilsvarende bør koncentrationen af alger i alge kontrol lig med koncentrationen af alger i den eksperimentelle co-kultur. Ved at have de samme indledende bakterielle og alger koncentrationer kan befolkningstætheden sammenlignes hele eksperimentet.
7. Opsætning af mikrotiterplader
- Opdel en steril 48-brønds mikrotiterplade pr figur 1.Label ovennævnte udvendige brønde indeholdende enten sterilt fortyndingsmiddel eller ikke-fotosyntetiske prøver.
BEMÆRK: randomisering af pladebrøndene kan gøres for prøver udtaget på samme dag. For eksempel vil kvadrant 1 skal udtages prøver på 1 d i forsøget; brøndene, der skal randomiserede er B2 - 4 og C2 - 4. Lad omkredsen af pladen fyldt med steril opløsning, som vist i figur 1.
. Figur 1. Skematisk repræsentation af prøven placering i en 48-brønds mikrotiterplade Wells skal udfyldes som følger: kolonne 1 og 6, brønde A til F ( 
) Er fyldt med 1 ml 1x PBS (eller en anden steril opløsning / media). Rækker A og F, huller 2 - 8 ( 
) Er fyldt med 1 ml bakteriel kontrol; roWS B og E huller 2 - 8 ( 
) Er fyldt med 1 ml alge kontrol; rækker C og D, og hul 2 - 8 ( 
) Er fyldt med 1 ml co-kultur. Pladen er opdelt i 4 kvadranter (A2, A5, D2 og D5) disse kvadranter er hver specifikke prøveudtagning dage 1 - 4 ud, bør dette randomiserede hele plader og mærket i overensstemmelse hermed. Inden for hver dag, vi rådgive randomisering af alger kontrol ( 
) Og co-kultur ( 
) brønde med en generator af tilfældige tal. Mærk låget over 1x PBS og / eller bakterielle kontrolbrønde at forhindre skygge af algekulturer.
- Pipette 1 ml 1x phosphatpufferopløsning (PBS, pH 7,4) eller anden steril opløsning i passende brønde som angivet i figur 1. Udfør denne langsomt og med omhu. PBS vil chanGE ionstyrken af alge- og / eller co-dyrkningsmedium, hvis den splatters i andre brønde, så håndterer omhyggeligt.
- 1 ml af bakteriel kontrol kultur i brønde mærket bakteriel kontrol (figur 1). Swirl den bakterielle kolbe før pipettering hver plade for at undgå bakteriel bundfældning.
- 1 ml af alge kontrolkultur i brønde mærket alge kontrol ved hjælp af en bred mund pipettespids (figur 1). Swirl den alge kolben så regelmæssigt som den bakterielle kolbe. Hvis algen har tendens til at synke eller flyde, swirl så regelmæssigt som er nødvendig for at opretholde et visuelt ensartet kultur.
- Ved hjælp af en bred mund pipette tip, 1 ml af co-kultur i passende brønde (figur 1). Hvirvlende co-kultur kolbe så regelmæssigt som den alge kolben.
- Forsegle hver plade med parafilm og anbringes i en daglig inkubator ved den ønskede temperatur og døgnemis- lys cyklus (18 ° C med en 16: 8 timers lys: mørke-cyklus er almindeligt anvendt). Efterladpladerne i døgnets inkubator indtil den er klar til at tage PAM aflæsninger (afsnit 8). Sikre, at alle plader er orienteret i samme retning for at give mulighed for ensartet lyseksponering.
- Tag en 20 pi alikvot af PBS, alger medier, alge lager og algevækst kontrol og slip plade på en passende ikke-selektivt medium (f.eks Marine Broth 2216 suppleret med 1,5% agar) og inkuberes pladerne ved 18 - 25 ° C i 72 HR at teste for kontaminering. Hvis væksten vises i nogen af de løsninger, der bør ikke indeholde bakterier, bør derfor ikke bruges disse data.
- Tag PAM fluorometriaflæsninger hjælp af resterende prøve fra algernes kontrol- og co-dyrkningskolber for den eksperimentelle 0 d PAM fluorometri læsning (se trin 8.1). Alle andre 0 D målinger også udføres med den resterende alge kontrol, bakteriel kontrol og co-kultur prøver.
8. Tage PAM fluorometriaflæsninger fra lager Prøver
- Nul WATER-PAMmed sterile alger medier i en ren kuvette før du tager aflæsninger 8.
- Pipette 300 pi fra algernes kontrol- eller co-dyrkningskolber i en ren cuvette indeholdende 2,7 ml af den samme alge medium, der anvendes i forsøget. Prøven blandes og fortyndingsmidlet forsigtigt med en bred mund pipettespids.
- Tør-off alle fingeraftryk fra ydersiden af kuvetten med en serviet, før du placerer kuvetten i WATER-PAM.
- Placer kuvetten i vand-PAM. Dæk prøven med hætten og lad det mørke tilpasse i 3 min. Mørke tilpasning kan variere afhængigt af arten af alger og skal fastlægges for den specifikke alge anvendt i forsøget. Undgå lange mørke tilpasning gange (> 20 min) ved at tage VAND-PAM aflæsninger under midten af den mørke cyklus af algernes dagaktive inkubatorer 16,17.
- Efter mørke tilpasning, ramte F 0-knappen. Hvis fluorescens aflæsninger er over 3.900, fortyndes prøven 1: 1 i alge medium. Mørk-tilpasse i yderligere 3 min og takea ny læsning. Hvis F 0 eller F m aflæsninger er stadig over 3.900, fortsætte med at fortynde prøven 1: 1 i alge medium indtil F 0 og F m aflæsninger er under 3.900.
BEMÆRK: Sørg for at tage højde for disse fortyndinger ved optagelse endelig fluorescens: for eksempel hvis algeprøven fortyndes 1: 9 i den første overførsel fra brønden til fortynding rør, så alge fluorescens læsning af 500 multipliceres med den inverse af fortyndingsfaktoren (i dette tilfælde 10), og den faktiske fluorescens af røret er da 5.000. - Efter indstilling F 0, tage en mættende puls (SAT-Pulse) læser hver 90 sek ved at trykke på knappen SAT at tage A M aflæsninger. Tidsintervallet mellem aflæsninger kan justeres afhængigt af algernes stamme. Kassér prøve.
- Gentag trin 8,1-8,6 for de resterende prøver.
9. Under PAM fluorometriaflæsninger fra mikrotiterplader
- Label6 sterile prøverør på> 3 ml volumen for brønde B2 - 4 for algernes kontrol- og Wells C2 - 4 for den bakterielle co-kultur (se plade layout i figur 1).
- Alikvot 2,7 ml sterilt alge medium i hvert rør.
- Rørene anbringes i døgnets inkubator og tillade dem at akklimatisere sig til temperaturen algen blev dyrket ved 30 min.
- Før du fjerner mikrotiterpladen fra inkubatoren sikre, at lys indtrængen i de mørke akklimatiseret brønde begrænses ved at dække pladen med aluminiumsfolie (eller lignende), kun fjerne folien, mens du aktivt overfører kultur fra brøndene til fortynding rørene (trin 9.5 - 9.7).
- Aseptisk blande første mikrotiterpladebrønd (godt B2) med en bred mund pipettespids ved langsomt at pipettere op og ned.
- Opnå fortynding rør fra inkubatoren og aseptisk overførsel 300 pi fra brønd B2 (figur 1) til det tilsvarende prøverør med en bred mund pipettespids (dette er en 1: 9 fortynding af prøven i alge medium).
- Gentag trin 9,5-9,6 for de resterende brønde (B3,4 og C2 - 4).
- Dæk prøveglas med aluminiumsfolie og returnere dem til døgnets inkubator indtil den skal VAND PAM.
- Udfør VAND PAM aflæsninger som beskrevet i trin 8,1-8,7. Seal mikrotiterpladen med parafilm inden den sendes tilbage til inkubatoren.
- Gentag aflæsninger med planlagte tidsintervaller for varigheden af forsøget. Hyppigheden og varigheden af prøveudtagningen skal planlægges ved begyndelsen af eksperimentet.
10. Prøve Experiment
Prøven eksperiment er en 10 dages co-kultur af en bakterie (Phaeobacter gallaeciensis BS107) og en makroalgen (Emiliania huxleyi stamme (CCMP3266)). Det omfatter en alge kontrol, bakteriel kontrol og et bakterielt-alge eksperimentel co-kultur.
- Beregn mængder bakterielle og alger lagre, der kræves (trin 1.1-1,4)
- Forbered alge lager, en V A 40 ml, ved at inokulere 4 ml alger i 36 ml medium og inkuberet indtil tidlig eksponentiel vækst opnås med en celledensitet på ~ 10 4 celler / ml (trin 2,1-2,4).
- Den bakterielle bestand kolben Forbered ved at fortynde 400 pi de 10 6 cfu / ml bakterier opnået i afsnit 3 til en V B på 40 ml med alger medier (slutkoncentration af bakterier vil være 10 4 cfu / ml).
- Halvdelen Transfer (20 ml) af den bakterielle materiel til den bakterielle kontrol kolbe og tilsættes 20 ml af alger medier til at bakteriel kontrol. Halvdelen Transfer (20 ml) den alge materiel til den alge kontrol kolbe og tilsættes 20 ml alger medier at gøre op alge kontrol (afsnit 5). Overfør de resterende 20 ml af bakteriel lager til co-kultur-kolbe og blandes med de resterende 20 ml alge lager at etablere co-kultur (afsnit6).
- Pipette 1x PBS (pH 7,4), kontroller og co-kultur i to pre-mærket mikrotiterplader (figur 1), 1 ml per brønd. Brug 3 ml af de øvrige kontroller og co-kulturer at gøre 0 D målinger (cfu tæller, VAND PAM (afsnit 8), mikroskopisk observation af alge cellemorfologi, og alge-celler ophæng til flowcytometri).
- Tage vand-PAM aflæsninger for alger kontrol og co-kultur en gang om dagen i 10 d, og altid på samme tid som de 0 D målinger blev taget (afsnit 8).
11. Andre parametre af interesse
- Bestem bakteriel cfu koncentration: udføre en seriel fortynding af det bakterielle kontrol og co-kultur i steril 1 x PBS (eller lignende), så drop plade på Marine Broth 2216 suppleret med 1,5% agar (eller lignende) og observere antallet af cfu der vokser at bestemme de bakterielle cfu / ml for hver brønd 18.
- At evaluere algekoncentration celle: fix alge kontrol og samarbejdekultur med en 0,15% slutkoncentration af glutaraldehyd. Inkuber i 10 minutter i mørke, og derefter flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Proces alle prøver på et flowcytometer (FACS Calibur eller lignende) til at tælle algeceller.
- Observer alge cellemorfologi: algekulturer og bakteriel-alge co-kultur ved hjælp af mikroskopi (dvs. lysmikroskopi epifluorescens, eller lignende).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VAND-PAM fluorometriaflæsninger.
VAND-Pulse-amplitudemodulerede (PAM) fluorometri er en hurtig og effektiv metode til at bestemme den fluorescens (en proxy for klorofyl indhold) og fotosyntetiske udbytte (PSII sundhed) af algekulturer. Den PAM WinControl software genererer et regneark med rådata værdier for (det følgende er de grundlæggende parametre for mørke tilpasset alger prøver):
F 0 = fluorescens af mørke-tilpassede celler
F m = maksimal fluorescens efter mætte lysdioder (LED) puls
F v / F m = (F m -F 0) / F m = potentiel kvantumudbytte af en mørk tilpasset prøve 19
PAM fluorometri har mange anvendelsesmuligheder og kan give en masse oplysninger om fotosystem og sundhed alGAE. Desuden er der andre parametre, som er vigtige, når testlyset tilpasset prøver. For yderligere læsning disse er diskuteret i detaljer i disse anmeldelser 13,16,20-23. Disse data kan overføres til et regneark eller plotning software til at generere grafer af den oprindelige alge fluorescens (F 0), den maksimale alger fluorescens (F m), og den potentielle kvanteudbytte (F V / F m; figur 2 og 3) . Graferne i figur 3 viser, hvorledes den alge fluorescens og F v / F m er påvirket af bakterien ved at sammenligne algen dyrkes alene (kontrol) til det dyrkes med bakterien i co-kultur i hele 10-dages co-kultur eksperiment (figur 3C). I dette eksempel blev en to-prøve t-test anvendes til at sammenligne parametrene statistisk mellem de to behandlinger hver dag. Tilsvarende for forsøg, hvor mere end to behandlinger er til stede, en ANOVA kunneanvendes. F m læsning (figur 3B) er taget direkte efter mættende LED puls, hvilket betyder den primære PSII elektronacceptor QA er fuldt reduceret, og kan ikke acceptere flere elektroner fra PSII reaktionscenter P680, og som sådan, er alle reaktionscentre ' lukket «17. Dette hindrer fotokemisk brug af lys energi, bringer fluorescensemission til et maksimum. Dette giver så den maksimale fluorescens (F m) læsning. Figur 3C illustrerer et dramatisk fald i PSII sundhed mellem 5 d og 10 d, når co-dyrket med bakterien i forhold til dyrkning alene (kontrol). Standardfejlen barer stammer fra tredobbelte mikrotiterbrønde, som er uafhængige forsøg fra samme forældrenes bakterielle og algekulturer. Den konsekvent små standardfejl bekræfter robusthed og reproducerbarhed mikrotiterpladeformat for alger bioassays, da det giver uafhængige forsøg, der skal anvendes som RepliCates og eliminerer behovet for at delprøve den eksperimentelle enhed over varigheden af eksperimentet.
Figur 2. Repræsentative VAND-PAM fluorometriaflæsninger grafer af en 140 d vækstkurve af axenisk Emiliania huxleyi (CCMP3266). (A) aflæsninger for den indledende alge fluorescens (F 0), (B) maksimal alge fluorescens (F m), og ( C) potentielle kvantumudbytte (F v / F m) for E. huxleyi er vist som sorte cirkler. Den bedste rette linje for F 0 og F m var normal log 3 parameter (SigmaPlot) R2 = 0,94, 0,95 hhv. Potentiel kvantumudbytte (F v / F m) er en dimensionsløs udtryk for fotosyntetiske sundhed, som er beregnet som (F m - F 0) / F m. Den bedste rette linje for F v / F m kurve var en 3 faktor polynomium R2 = 0,6. Error søjler repræsenterer standardafvigelsen mellem tredobbelte brønde. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Repræsentative VAND-PAM fluorometriaflæsninger grafer af en 10 d co-dyrkning eksperiment af Emiliania huxleyi (CCMP3266) med Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) Den indledende alge fluorescens (F 0), (B) maksimal alge fluorescens (F m) , og (C) potentielle kvantumudbytte (F v / F m) tegnes for control alge (åbne cirkler) og alger co-dyrket med en bakterie (sorte cirkler). Potentiel kvantumudbytte (F v / F m) er en dimensionsløs udtryk for fotosyntetiske sundhed, som er beregnet som (F m - F 0) / F m. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen mellem tredobbelte brønde. En stjerne (*) angiver dage, hvor parametrene for kontrol og co-kultur behandlinger var meget forskelligt. Forskelle mellem behandlinger for alle dage var ikke-signifikant, bortset fra 10 d i alle tre parametre (10 d - F 0: t-test, df = 2,5, t-ratio = -15, p = 0,0017 *; F m: t- test, df = 2,1, t-ratio = -16,15, p = 0,003 *; F v / F m:. t-test, df = -18,68, t-ratio = 2,0, p = 0,0028 *) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algevækst en miniaturiseret format.
Miniaturisering af algekulturer til en 1 ml kultur volumen i en mikrotiterplade muliggør replikation i et eksperiment, der skal øges. Det er vigtigt at sikre, at algen er sundt hele et forsøg; udføre en vækstkurve (figur 2), ved hjælp af mikrotiterpladeformat at vurdere forskellige alger medier, for at sikre de ernæringsmæssige krav alge er opfyldt. Derudover kan det være vigtigt at optimere døgnets cyklus (lys og mørke perioder) og temperatur. Korrekt optimering for en given alge kan tillade for at opretholde en sund algekulturer på peak fluorescens til 26 d og til påvisning af potentielle kvantumudbytte efter 140 dage (figur 2).
Minimering fordampningsemissioner effekter.
Det er vigtigt at minimere fordamp- virkninger af flydende assays som et "kant effekt 'er almindeligt observed hvor der er større inddampning i brønde på kanten af mikrotiterpladen end i brønde der er placeret i midten af pladen. Mens fordampning er blevet observeret på kanten af plader, er satsen for fordampning ikke begrænse den eksperimentelle varighed som sunde algekulturer, med peak fluorescens ved 26 d er blevet fastholdt i dette format (figur 2). For at minimere eventuelle 'kant effekt', 1x PBS (pH 7,4), eller en anden steril opløsning, der alikvoteres i brønde langs alle fire kanter (kolonne A og H, række 1 og 6, figur 1).
Belysning i en daglig inkubator.
Mikrotiterplader bør alle have samme orientering i døgnets inkubator. For eksempel, i længderetningen orienteringen af mikrotiterplader i en inkubator betyder, at pladerne er placeret langs den korte akse. Hvis der anvendes denne orientering kan algekulturer langs den lange akse BG (Figur 1) experiencea let lys og temperaturgradient på grund af variation i afstand fra lyskilden (pæren er en kilde til både lys og varme). Dette er blevet observeret at påvirke temperatur assays på alger på den yderste af deres temperaturområde. Derfor er det usandsynligt, at påvirke de fleste alger dyrket på deres optimale temperatur. For at minimere konsekvenserne af dette lys og temperaturgradient sikre, at større flasker ikke skaber skygge, sted plader ved en konsekvent afstand fra lys, brug skygge klud til at reducere lysniveauet om nødvendigt, og tjek lysintensiteten over lange akse af diurnal inkubator for at sikre, at det bevæger sig jævnt.
Mørk tilpasning af alger prøver til VAND PAM fluorometri.
Før udførelse VAND PAM aflæsninger er vigtigt at mørke tilpasse alger prøver så PSII reaktionscentre er fuldt åben, og lysinduceret transthylakoidal pH-gradient er fuldt spredes, thos at give ægte F o og A M-værdier, hvorfra man kan beregne F v / F m. Prøveudtagning algen fra analysen for VAND PAM målinger i midten af den mørke fase af døgnets cyklus (dvs. for en 16: 8 timers lys: mørke-cyklus, vil en 2 hr prøveudtagning session udføres fra T (mørk) = 3-5 timer) gør mørk tilpasning kortere (3-5 min) sammenlignet med den midterste af lyset cyklus (T (lys) = 7-9 timer) når det er mørkt tilpasning er længere (> 20 min) 17. Den alge mørke tilpasning tid vil også variere afhængigt af algearter, vækstbetingelser og lysforholdene i dens naturlige habitat rækkevidde.
Følsomhed af VAND PAM fluorometriaflæsninger.
Vand-PAM var designet til at være en ultrasensitiv fluorometer stand til at detektere F, F 0 og F m fra lave klorofyl prøver såsom ocean overfladevand 16. Derfor er det velegnet til en miniaturized bioassay, hvor prøver kan fortyndes. På grund af denne følsomhed, er det vigtigt at forstå, at vand-PAM maskine har en øvre grænse på Fluorescensaflæsninger (dvs. F, F 0 og / eller F m), hvis prøven ikke er tilstrækkeligt fortyndet (figur 4). Inden for WinControl software de maksimale værdier er først mærkbar efter tryk F 0 og læse F 0 (direkte efter mørke tilpasning). Følgelig F og F m er ved den maksimale værdi 4.056 (figur 4, nr. 2286). De maksimale værdier af F og F m afhænger af den type alger medium, der anvendes til at kalibrere vand-PAM, men kan let identificeres prøver over detektionsgrænsen fordi gentagne aflæsninger med samme maksimale værdi forekomme indtil prøven er tilstrækkeligt fortyndet . Efter en 1: 1 fortynding i alge- medier, mindre koncentrerede prøve er mørkt tilpasset igen, og F 0 måling blev gentaget. F-værdien appears skal måles korrekt, men F m er stadig læser den maksimale værdi 4.056 (figur 4, nr. 2287). Denne prøve blev atter fortyndet 1: (. Figur 4, nr 2288) 1 i alge medier igen og mørke tilpasset yderligere 3 min, før du tager en anden F 0 læsning og gyldige aflæsninger blev opnået, så den næste måling (F) er taget, og F beregning F v / m er gyldig. I dette eksempel blev prøven fortyndet to gange i forholdet 1: 1 med medium, som skal tages med i beregningen af F m og F 0. Det er vigtigt at bemærke, at F v / F m, som en direkte funktion af F 0 og F m er beregnet forkert, hvis prøverne også koncentreres trods en dimensionsløs ekspression af fotosyntetiske sundhed.
Figur 4. WinControl visning af flere vand-PAM fluorometriaflæsninger af en alge prøve at være sekventielt fortyndet for at opnå den korrekte fortynding. Dette tal viser alge fluorescens aflæsninger nå den øvre grænse af det vand-PAM maskine (rød boks), og dem, hvor en passende fortynding af prøven er opnået (grøn boks). Desuden er dette tal viser nogle af de andre variabler, som denne metode beregner, men disse er ikke diskuteret i detaljer her (se anmeldelser 13,16,20-22). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Bakteriel forurening.
I alle alger eksperimenter, er det nødvendigt som et udgangspunkt på alge sundhed alger kontrol, så det er bydende nødvendigt, at det fortsat er fri for bakteriel forurening under hele forsøget. Bakteriel kontamination forekommer let, da der ikke er nogenvalg (såsom antibiotika) og fotosyntese konstant producerer nye organisk kulstof for bakterievækst. De to vigtigste måder at undgå forurening er at sikre sterilitet af alle opløsninger (fx alger medier, 1x PBS, pH 7,4) og udstyr ved T = 0 d af forsøget og til at opretholde aseptisk teknik, mens håndtering af mikrotiterplader. Bør overvåges Eksperimentet for forurening ved hvert tidspunkt ved udpladning en 20 pi alikvot fra alle alger kontrolbrønde. Hvis der observeres forurening fra nogen af de algernes kontrolbrønde så de VAND PAM fluorometriaflæsninger bør bemærkes og udelukkes fra dataanalyse. Hvis en løsning, der bruges til at oprette eksperimentet får hele eksperiment at være forurenet, så kassere eksperimentet og alt forurenet reagenser og start igen. De bakterielle kontrol og bakteriel-algernes co-kulturer kan også blive forurenet og agarplader anvendes til bakterielle cfu tællinger bør overvåges for alternativ koloni Morpholgier. Well-to-godt krydskontaminering kan forekomme, når du fjerner mikrotiterpladen låg, men er let undgås ved ikke at vippe eller ryste af pladerne og beskæftiger aseptisk teknik i en laminar flow hætte eller i nærheden af en flamme.
Fremtidige ansøgninger.
Denne lille volumen bioassay giver en hurtig screeningsmetode til mikroalger ved at kombinere en mikrotiterpladeformat med VAND PAM fluorometri. Eksempler på fremtidige applikationer er forskellige, og kan omfatte Imaging PAM fluorometri, som giver indblik i celle-celle variation af PSII sundhed i en population, som det udfører PAM fluorometri på individuelle celler 24. Bioassayet kan også kombineres med mikroskopi og flowcytometri som tidligere diskuteret. En anden kombination med potentiale til at give yderligere indsigt er cellefarvning for flowcytometri og mikroskopi at belyse morfologisk variation indenfor subpopulationer af algekulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48-well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P.
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J.
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N.
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
