Abstract
배양 실험 1-7에 걸쳐 서브 샘플링 될 수 있도록 미세 조류의 실험 조작을위한 종래의 방법은 대량 배양 (5 L 내지 20 ml)에 사용했다. 대량의 서브 샘플링 다양한 이유로 문제가 될 수있다 : 1)는 총 부피와 표면적의 변화 원인은 다음 실험 기간 동안 배양 체적비; 2) 의사 복제 (즉, 동일한 치료 플라스크 8에서 샘플)는 종종 오히려 진정한 복제물 (복제 치료에서 즉, 샘플링)보다 채용을 복제; 3) 실험 기간은 총 부피에 의해 제한된다; 4) 배양 무균 또는 일반적인 세균 미생물 오염은 일반적으로 서브 샘플링 동안 발생 장기 실험 동안 유지하기 어렵다.
미세 적정 플레이트의 사용은 최대 48 내의 별도의 처리 1 ㎖의 각각의 배양에 사용되는 복제 볼륨을 가능12.65 X 8.5 X 2.2 cm 판함으로써 실험 볼륨을 감소하고 치료를 서브 샘플링하지 않고 광범위한 복제를 허용. 9-11 스크리닝 세균성 조류 공동 배양, 조류 생리 테스트 및 독소 : 또한,이 기술은 실험을 포함한 다양한 포맷에 맞게 수정 될 수있다. 조류, 박테리아 및 / 또는 공동 문화와 개인 우물로 제한 등 다양한 실험 절차에 대한 샘플링,하지만 할 수 있습니다 WATER-펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정, 현미경, 세균 집락 형성 단위 (CFU) 수와는 유동 세포 계측법. 마이크로 타이 터 플레이트 포맷 WATER-PAM 형광 측정의 조합은 광 화학적 수율 및 샘플, 높은 재현성과 낮은 가변성과 다른 광 화학적 파라미터의 다수의 신속한 측정이 가능하며 실험의 과정 속에 든 대형 유리 병 또는 원추형 플라스크를 서브 샘플링 많은 함정을 피할 .
Introduction
식물 플랑크톤의 생리는 전통적으로 원뿔 플라스크에 20 ㎖에서 carboys 1-7에서 5 L에 이르는 메조 규모의 실험에서 연구되어왔다. 각 시점에 대한 복제 샘플을 희생하는 것이 관리하기 어려운 실험 장치를 만들어으로이 실험 규모는 실험 모니터링을위한 서브 샘플링을 필요로한다.
줄이거 나 대량의 서브 샘플링 및 의사 - 복제의 제한을 제거한다 조류 생리학 실험 실험 용적을 소형화하여 일주 동일한 인큐베이터 공간을 사용하면서 기능은 독립적 인 실험의 수를 증가시키는. 마이크로 타이 터 플레이트 포맷은 가변 실험적 조건에서 조류를 조작 1ml의 배양 부피를 사용하여 조류 생물 검정을 위해 개발되었다. 실험이 작은 부피 복제물의 수가 증가 될 수 있도록 허용 복제에 의한 샘플 간의 감소 가변성 실험의 재현성을 증가(그림 2) 12 1백40일에 대한 실험 컨트롤 (즉, 무균 조류 배양)를 유지하면서 실험하고, 진정한 복제를 할 수 있습니다.
이 마이크로 타이 터 플레이트 형식은 쉽게 같은 실험 다양한 질문에 대한 적응 : 박테리아가 조류 호스트와 공생 중성 또는 병원성 상호 작용을해야합니까? 조류의 복합 자극의 추가 또는 독성인가? 이들 및 다른 문제는이 새로운 포맷을 사용하여 9-11 빠른 높은 처리량 방법으로 해결할 수있다.
48 웰 마이크로 타이 배양 플레이트는 각 1 ㎖를 잘 단일 시간 시점에서 샘플링 독립적 인 실험 장치가 될 수 있습니다. 다양한 매개 변수를 포함하여 1 ml의 볼륨에서 샘플링, 이에 국한되지 수 있습니다 WATER-펄스 진폭 변조 (WATER-PAM) 형광 측정 (재료 및 장비 표 참조) 1을 사용 엽록소 형광 및 광 화학적 매개 변수3. WATER-PAM의 형광 측정 조류 13의 실험을 모니터링하는 데 사용할 수있는 신속하고 비 침습적 방법이다. 14, 15 (WATER-PAM 4 ml의 볼륨 - - 2 중간에 희석 문화의 300 μL 150) 그것은 작은 문화 볼륨에서 광합성 효율과 광계 건강을 측정 할 수 있습니다. WATER-PAM의 형광 측정에 더하여,이 설정을 포함한 다른 다양한 파라미터를 측정하는데 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 : 조류 세포 및 조류 세포 형태의 변화에 부착 된 박테리아를 시각화하는 현미경; 단위 (CFU) 수를 형성하는 박테리아 식민지; 및 조류 세포 수 및 식별 주민들을위한 유동 세포 계측법.
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Protocol
실험 설정 1. 계산
- 조류 및 / 또는 식 1을 사용하여, 전체 실험에 필요한 제어 될 필요 세균 배양의 체적을 계산한다 :
Y 및 Z는 일 당 필요한 컨트롤 수와 동일한 경우 일 수 같다. - 수학 식 2을 사용하여 실험을위한 공동 배양에 필요한 조류 및 / 또는 세균 배양의 체적을 계산한다 :
주 : 모든 화합물의 화면에서 '공존 배양'실험을 대체 할 수있다; 그냥 실험 설계에 맞게 용매 최종 화합물 및 조류 농도를 조정합니다. - 조기-지수 조류 문화의 최종 부피를 계산하기 위해 식 (1), (2)를 사용 (일반적으로 오일 ~ 104 세포 / ㎖하지만이 performi에 의해 결정되어야한다(이 책은 식 (3)을 사용하여 단계 2.3)에 필요한 실험에 필요한 NG 조류 성장 곡선) :
- 수학 식 4를 사용하여 (이 볼륨이 단계 4.2 필요) 실험에 필요한 × 104 CFU / ㎖의 세균 배양 (또는 원하는 접종 농도)의 최종 부피를 계산하기 위해 수학 식 1 및 수학 식 2를 사용하여
참고 : 오류를 피펫 팅을 설명하는 단계 1.3 및 1.4에서 추가로 10 ml의 수행되는 모든 시험 사용 (유동 세포 계측법, 예를 들면, 물-PAM을, 현미경 등) 0 D에. 실험 설계에 맞게 필요한 경우이 볼륨을 높입니다.
참고 : 8 일 실험의 예 계산 섹션 (10)을 참조하십시오 미디어 조리법에 대한 보충 표를 참조하십시오.
실험 설정 2. 성장 조류 세포
- 격리 또는를 얻을 수적극적으로 무균 조류 문화를 성장.
- 무균 전송 한 보장 멸균 조류 매체 (예를 들어, L1 또는 유사한 해양 조류 매체, 재료 및 장비 표 참조)에 조류 문화의 최종 부피의 10 %, : 신선한 배지에서 조류 문화의 9 희석. 그 변형에 대해 이전에 결정 성장 조건을 사용하여 낮의 인큐베이터에서 희석 된 조류 성장 (예를 들면, 16와 18 °의 C : 8 시간의 빛 : 어두운주기는 일반적으로 사용된다).
- 조류의 최종 부피가 있음 9 희석 : 배양 초기의 지수의 위상, 재 - 배양에 도달하면 동일한 균 조류 배지에서 조류 (예를 들어, L1 또는 유사한 해양 조류 배지)를, 최종 농도가 1 확보 계산 된 V의 A (1.3 단계)과 동일.
참고 : 이러한 문화가 무균되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. (일반 해양 세균 매체에 예를 들면, 해양을 20 μL 나누어지는 도금에 의한 오염에 대한 모든 조류 미디어 및 조류 재고 병 테스트국물 2216 1.5 % 한천 또는 이와 유사한 것)을 보충. - 초기 지수 단계 (~ 104 세포 / ㎖)에 조류 문화를 성장.
주 : 모든 조류 균주 배양 조건에 따라 고유 한 성장 곡선을 갖는다. 조기 지수 상 (~ / ㎖ × 104 세포) (즉, 유동 세포 계측법 또는 현미경을 이용하여) 셀 밀도에 기초 조류 성장 곡선을 수행함으로써 결정될 수있다.
3. 예방 접종에 대한 박테리아 세포를 준비
- (선택된 세균 배지 및 성장 조건에서 성장 곡선을 수행하여 정지상에서 세균의 세균 농도 (CFU / ml) 및 광학 밀도 (OD)를 미리 결정할 예, 25 ° C, 160 rpm에서 2216 해양 국물 ) 또는 유사한. 단계 3.7에서 제대로 세포를 희석 나중에 세포 (단계 3.3) 성장이 정보를 사용합니다.
- 무균는 예를 들어 1.5 % 한천 플레이트 (2216 유연한 해양 국물에서 고립과 갓 재배 세균 식민지를 전송예를 들어 박테리아 액체 배지 (5 ㎖에 1.5 % 한천 또는 유사한 해양 세균 고체 배지)과 그 취지에, 해양 국물 2216 또는 유사한 해양 세균 중).
- (- 박테리아에 따라 36 시간 ~ 12) 롤링 드럼 또는 통에 고정 단계로 박테리아를 성장. 조류 세포는 초기 지수 적 단계 (~ 10 4 세포 / ml)에 도달했는지를 동시에 - 세균 정지상 (109 CFU / ㎖ ~ 108)에 도달되도록 실험을 계획한다.
- 피펫을 사용하여 매체에 테스트 튜브에 부착 된 생물막을 씻는다. 피펫 멸균 1.5 ml의 마이크로 튜브로 잘 혼합 된 세균 배양 1 ㎖. 14,000 × g에서 1 분간 원심 분리한다.
- 제거하고 펠렛 (박테리아 세포)를 방해하지 않고 상층 액 (세균 미디어) 폐기하십시오. (펠렛)와 마이크로 튜브에 멸균 조류 미디어 (예를 들어, L1 또는 이와 유사한 것)의 1 ML을 추가합니다. 소용돌이 마이크로 튜브는 조류 미디어에서 펠렛을 재현 탁합니다.
- 두 번째 세척 :단계 3.5를 반복합니다.
참고 :이의 영양 성분을 변경할 수 있기 때문에 철저하게 이전에 그들과 함께 조류를 접종에 세포에서 세균 미디어, 세포 암 설, 배설 단백질과 작은 분자를 모두 제거하기 위해 조류 매체를 사용하여 박테리아 세포를 세척하는 것이 중요합니다 조류 미디어가 화면에 생리 활성 분자를 도입하거나. - 직렬 원하는 최종 박테리아 농도 (CFU / ㎖)보다 더 농축 된 100 배이다 최종 농도, 조류 매체 세정 균체를 희석. 단계 4.2 조류 미디어 세척 및 희석 된 세포를 포함하는 마이크로 튜브를 저장합니다.
주 : 0 D에 세균 조류 : 1 비율을 갖는 하나에 기초하여 상기 실험을 계획한다. 단계 3.7에서 초기 셀이 직렬로 10 6 CFU / ㎖로 희석해야하므로 실험이 원하는 초기 세균 농도를 수행하려면, 10 4 CFU / ㎖이다.
실험 4. 준비 박테리아알 설정
- 4 멸균 멸균 유리 삼각 플라스크를 준비하고 레이블 :) '조류 제어 플라스크', b)는 '희석 박테리아 스톡 플라스크', C) '세균 제어 플라스크', 및 d) '공동 문화 플라스크를'.
- 에서 세균 현탁액을 희석 최종 부피 = V B (단계 1.4)에 멸균 조류 미디어 3.7 1:99 단계. 플라스크에 표시된 희석 세균 재고 (단계 4.1)에 희석합니다.
참고 : 위의 예 (단계 4.2),이 1:99 희석 × 104 CFU / ㎖의 최종 농도를 제공한다. 소용돌이 플라스크에 세포를 혼합합니다. - 피펫 V 제어 희석 세균 주식에서 (1.1 단계) 및 세균 제어 플라스크에 넣어.
- 세균 제어 플라스크에 넣고 멸균 조류 매체의 피펫 V 제어 (이것은 1 : 1 희석). 소용돌이 플라스크에 세포를 혼합 단계 7.3 따로 설정합니다.
- 희석 세균 주식에서 피펫 V는 공동 문화단계 6.1 따로 플라스크를 설정, 공동 문화 플라스크에 플라스크.
참고 : 한 번에 같은 조류에 다수의 공동 문화를 수행 할 때이 개별적으로 각 변형에 대한 V 공동 문화를 다시 계산하고 다음 단계를 반복 할 필요가있다 (즉, 두 개의 서로 다른 박테리아의 공동 문화는 하나의 제어와 분리) 개별적으로 각각의 공동 문화 4.5. 이것은 수학 식 5에 도시 된 공동 배양 모두를 포함하도록 단계 130에서 산출 된 V를 증가시키는 것도 필요하다 :
실험 설정을위한 조류를 준비 5.
- 세포가 잘 혼합 나타날 때까지 조심스럽게 넓은 입 피펫 팁 (2.4 단계)에서 초기 지수 조류 문화를 섞는다.
- 조류 제어 플라스크에 조류 스톡 병에서 피펫 V 제어 할 수 있습니다. 부드럽게 10ml를 피펫을 사용하여 피펫. 그리고 낮의 인큐베이터에서 조류 재고 병을 반환합니다.
- 피펫 V의 계속조류 제어 플라스크에 멸균 조류 매체의 ROL (이것은 1 : 1 희석). 단계 7.4 필요한 때까지, 낮의 인큐베이터에서 술병과 장소를 섞어 소용돌이.
6. 준비 실험 공동 문화
- 부드럽게 4.5 단계에서 세균 공동 문화 플라스크에 조류 재고 플라스크 V의 공동 문화를 피펫. 단계 7.5 필요한 때까지 낮의 인큐베이터에 공동 문화 플라스크를 돌려줍니다.
주 : 세균 제어 세균의 농도는 실험 공동 문화의 세균 농도와 같아야합니다. 마찬가지로, 조류 제어 조류의 농도는 실험 공존 배양에서 조류의 농도와 동일해야한다. 동일한 초기 박테리아 및 조류의 농도를 가짐으로써, 인구 밀도는 실험 내내 비교 될 수있다.
7. 미세 적정 플레이트 설정
- 도 1에 따라 멸균 48- 웰 마이크로 타이 터 플레이트를 나눈다.멸균 희석제 또는 비 광합성 중 샘플을 포함하는 외부 우물 위의 레이블.
참고 : 판 우물의 무작위 같은 날에 찍은 샘플을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 제 1 사분면은 실험에서 D로 샘플링 한 것이다; 도 4 및 C2 - -도 1에 나타낸 바와 같이 4 멸균 용액으로 충전 플레이트의 경계를 남겨 무작위되어야 웰 B2이다.
. 다음 48- 웰 마이크로 타이 터 플레이트 웰에 샘플 배치 그림 1. 개략도 채워지 : 컬럼 1, 6, F를 통해 웰 ( 
)) PBS (또는 다른 멸균 솔루션 / 미디어 1X 1 ㎖로 채워집니다. 행 및 F, 우물 2-8 ( 
) 1 ml의 세균 제어로 가득; ROWS B와 E 우물 2-8 ( 
) 1 ml의 조류 제어로 가득; 행 C와 D, 우물 2-8 ( 
) 1 ml의 공동 문화로 채워져있다. 네,이 판에 걸쳐 무작위 따라 표시되어야합니다 - 판은 4 사분면 (A2, A5, D2 및 D5)이 사분면 (1) 각각의 특정 샘플링 시절로 나누어진다. 매일 내에서 우리는 조류 제어 (랜덤 조언한다 
)와 공동 문화 ( 
난수 발생기를 사용하여) 웰. 조류 문화의 음영을 방지하기 위해 1X PBS 및 / 또는 세균 제어 우물 위에 뚜껑을 레이블.
- 피펫 1ml의 1X 인산 완충 용액 (PBS, pH를 7.4) 또는도 1에 나타낸 바와 같이 다른 적절한 웰 멸균 용액. 천천히주의하여 수행. PBS 것 짱GE의 조류 및 / 또는 공동 문화 매체의 이온 강도가 다른 우물이 너무 신중하게 처리에 뿌려 놓은합니다.
- 피펫의 우물에 세균 제어 문화 1 ml의 세균 제어 (그림 1) 표시. 세균 침전을 방지하기 위해 각 플레이트 피펫 팅 전에 세균 플라스크를 소용돌이.
- 피펫 한 넓은 입 피펫 팁 (그림 1)를 사용하여 조류 제어를 표시 우물에 조류 제어 문화 ml의. 세균 플라스크처럼 정기적으로 조류 플라스크를 소용돌이. 조류 싱크 또는 부유하는 경향이 경우 시각적으로 균일 한 문화를 유지하기 위해 필요할 때, 규칙적으로 소용돌이 친다.
- 넓은 입 피펫 팁, 피펫 적절한 우물에 공동 문화의 1 ㎖ (그림 1)를 사용. 조류 플라스크처럼 정기적으로 공동 문화 플라스크 소용돌이.
- 원하는 온도와 낮의 빛을주기에 낮의 인큐베이터에서 파라 필름 및 장소 각 플레이트를 밀봉 (8 시간 등 16 : 18 ° C 어두운 사이클이 일반적으로 사용된다). 휴가준비가 될 때까지 낮의 인큐베이터에있는 플레이트는 PAM 판독 (8 항) 촬영합니다. 모든 플레이트를 확인 일관된 노광을 허용하기 위해 동일한 방향으로 배향된다.
- PBS, 조류 미디어, 조류 재고 및 조류 제어에서 20 μL 나누어지는을 가지고 적절한 비 선택적 매체에 판을 드롭 (예를 들면, 1.5 % 한천로 보충 해양 국물 2216)과 18 판을 품다 - 72 25 ° C 시간은 오염 테스트합니다. 성장이 박테리아를 포함 할 수 없습니다 솔루션 중 하나에 표시되면, 이러한 데이터는 사용할 수 없습니다.
- 읽기 실험 0 D의 PAM의 형광 측정 (단계 8.1 참조) 조류 제어 및 공동 문화 플라스크에 남아있는 샘플을 사용 PAM 형광 측정 수치를 가져 가라. 다른 0 D 측정은 또한 남은 제어 조류, 박테리아 제어 및 공동 배양 된 샘플로 수행되어야한다.
주식 샘플 8. 촬영 PAM 형광 측정 수치
- WATER-PAM 제로판독 8 복용하기 전에 깨끗한 큐벳에 멸균 조류 미디어.
- 피펫 실험에 사용 된 동일한 매체 조류 2.7㎖를 함유하는 깨끗한 큐벳 조류 제어 또는 공 배양 플라스크에서 300 μL. 넓은 입 피펫 팁으로 부드럽게 시료와 희석액을 혼합.
- 와이프 - 오프 티슈로 큐벳 외부에서 모든 지문을 물-PAM에 큐벳을 배치하기 전에.
- WATER-PAM에 큐벳을 놓습니다. 캡으로 샘플을 커버하고 3 분 동안 어두운 적용 할 수 있습니다. 암순응 시간은 조류의 종류에 따라 다양하며, 실험에 사용 된 특정 조류에 대해 결정되어야한다. 조류 낮의 인큐베이터 16, 17의 어두운주기의 중간 동안 물-PAM 판독을 복용하여 긴 어두운 적응 시간 (> 20 분)하지 마십시오.
- 어두운 적응 한 후, F 0 버튼을 누르십시오. 1 조류 매체 : 형광 측정 값이 3,900 이상일 경우, 샘플 1을 희석. 추가로 3 분 탁에 대한 어두운 적응EA의 새로운 독서. F 0 F m 수치가 3900 이하가 될 때까지 조류 매체에 1 : F 0 F m 수치가 3,900 이상 계속 경우, 샘플 1을 희석하는 것을 계속한다.
참고 : 조류 샘플 1 희석되는 경우, 예를 들면 : 최종 형광을 기록 할 때이 희석을 설명 할 수 있는지 확인 희석 관 우물에서 초기 전송하는 동안 9, 500의 조류 형광 판독 역 곱해야합니다 희석 배수와 튜브의 실제 형광 (이 경우 10 년) 후 5000이다. - F 0을 설정 한 후, F의 m 판독을 적용하려면 SAT 버튼을 눌렀을 때마다 90 초를 읽고 포화 펄스 (SAT 펄스) 걸릴. 판독 값 사이의 시간 간격은 조류 균주에 따라 조정될 수있다. 폐기 샘플.
- 나머지 샘플 8.6 - 반복 8.1 단계를 반복합니다.
미세 적정 플레이트 9. 촬영 PAM 형광 측정 수치
- 상표조류 제어 및 우물 C2 4 - - 박테리아의 공동 문화 4 (그림 1의 플레이트 레이아웃 참조) 우물 B2에 대한> 3 ㎖ 볼륨의 6 멸균 샘플 튜브.
- 각 튜브에 분취 조류 멸균 배지 2.7㎖를.
- 낮의 인큐베이터에서 튜브를 삽입하고 그들에게 조류가 30 분에서 성장 온도에 적응 할 수 있습니다.
- 인큐베이터에서 마이크로 타이 터 플레이트를 제거하기 전에 적극적으로 희석 튜브 우물에서 문화를 전송하는 동안, 9.5 단계 (호일을 제거 알루미늄 호일 (또는 유사)와 플레이트를 커버에 의해 제한됩니다 어두운 적응 우물에 빛 침투를 보장 - 9.7).
- 무균는 천천히 피펫 아래로 넓은 입 피펫 팁 (물론 B2) 잘 최초의 마이크로 타이 터 플레이트를 섞는다.
- (넓은 입 피펫 팁과 해당 샘플 튜브에 300 ㎕를 잘 B2 (그림 1)에서 인큐베이터 및 무균 양도 희석 튜브를 얻습니다조류 매체 샘플)의 희석 9 : 1이된다.
- 나머지 우물 용 9.6 (B3,4 및 C2 - - 4)를 반복 9.5 단계를 반복합니다.
- 알루미늄 호일로 샘플 튜브를 덮고 물-PAM에 대한 준비가 될 때까지 낮의 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 8.7 - 8.1 단계에 설명 된대로 WATER-PAM 읽기를 수행합니다. 인큐베이터에 반환하기 전에 파라 필름과 마이크로 타이 터 플레이트를 밀봉합니다.
- 실험 기간 동안 계획된 시간 간격으로 측정 값을 반복합니다. 주파수 및 샘플링 기간은 실험의 시작 계획한다.
10. 샘플 실험
샘플 실험은 박테리아 (Phaeobacter의 gallaeciensis의 BS107)와 microalga (인 Emiliania huxleyi 변형 (CCMP3266))의 10 일 공동 문화입니다. 그것은 조류 제어, 세균 제어 및 세균 - 조류 실험 공동 문화를 포함한다.
- 1 단계 (필수 박테리아 및 조류 주식의 볼륨을 계산합니다.1-1.4)
- 36 ml의 배지에서 조류 4㎖를 접종하여, 조류 스톡, 40 ml의 V를 준비하고 초기 지수 적 성장 ~ 104 세포 / ㎖ (2.1 단계 - 2.4)의 셀 밀도가 달성 될 때까지 배양 하였다.
- (10 4 CFU / ㎖ 될 것이다 박테리아의 최종 농도) 조류 미디어 40 ml의 V B로 3 절에서 얻은 10 6 CFU / ㎖의 세균 400 μl를 희석하여 세균 재고 플라스크를 준비합니다.
- 전송 제어 세균 플라스크 세균 스톡의 절반 (20 ㎖) 및 세균을 제어하기 위해 매체 조류 20 ㎖를 추가한다. 전송 절반 (20 ㎖) 조류 조류 제어 플라스크에 주식과 조류 제어 (5 장)을 만들기 위해 조류 미디어 20 ㎖를 추가합니다. 공 배양을 설정하는 공동 배양 플라스크 세균 콘텐츠의 나머지 20 mL로 옮기고 조류 콘텐츠의 나머지 20 ㎖로 혼합 (섹션6).
- 두 미리 라벨링 미세 적정 플레이트 (도 1), 웰 당 1 ㎖의 1X PBS (PH 7.4), 제어 장치 및 공동 배양 피펫. 0 D 측정 (CFU 수, WATER-PAM (8), 조류 세포 형태의 현미경 관찰 및 유동 세포 계측법에 대한 조류의 세포 고정)를 만들기 위해 나머지 컨트롤 및 공동 문화의 3 ㎖를 사용합니다.
- 0 D의 측정 (8 항) 찍은과 동시에 항상 10 D를위한 하루에 한 번 조류 제어 및 공동 문화 WATER-PAM 판독 값을 가지고,.
관심 11. 기타 매개 변수
- 세균 CFU 농도를 결정 멸균 1X PBS (또는 유사)에서 세균 제어 및 공동 문화의 일련의 희석을 수행 한 후 1.5 % 한천 (또는 유사)로 보충 해양 국물 2216에 판을 드롭하고 성장 CFU의 수를 관찰 각 웰 (18)에 대한 세균 CFU / ㎖를 확인합니다.
- 조류 세포 농도를 평가하기 : 조류 제어 및 공동 해결글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 0.15 %에 최종 농도와 문화. -80 ° C에서 10 액체 질소에 어두운, 다음 플래시 동결에 분하고, 가게를 품어. 프로세스 흐름 세포 계수기 (FACS 팩스 칼리버 또는 이와 유사한 것)에 대한 모든 샘플은 조류 세포를 계산합니다.
- 조류 문화와 현미경 (즉, 광학 현미경, 표면 형광 또는 유사한)를 사용하여 세균-조류 공동 문화 : 조류의 세포 형태를 관찰한다.
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Representative Results
WATER-PAM의 형광 측정 수치.
물 - 펄스 진폭 변조 (PAM) 형광 측정은 형광 (엽록소 콘텐츠에 대한 프록시) 및 조류 문화의 광합성 수율 (PSII 건강)를 결정하는 빠르고 효율적인 방법입니다. PAM WinControl 소프트웨어는 원시 데이터 값의 스프레드 시트 (다음 어두운 적응 조류 시료 기본적인 파라미터이다)를 생성한다 :
어두운 적응 세포의 F 0 = 형광
F의 m = 최대 형광 발광 다이오드 포화 후 (LED) 펄스
어두운 적응 샘플 (19)의 F의 V / F의 m = (F m에 -F 0) / F의 m은 = 잠재적 인 양자 수율
PAM의 형광 측정 많이 사용하고있다 및 Al을 광계 및 건강에 대한 많은 정보를 제공 할 수 있습니다GAE. 또한, 광 구성된 샘플을 테스트 할 때 중요한 다른 파라미터들이있다. 또한이를 읽기위한이 리뷰 13,16,20-23에서 자세히 설명합니다. 이러한 데이터는 초기 조류 형광 그래프 (F 0), 최대 조류 형광 (F의 m), 및 전위 양자 수율 (;도 2 및도 3 F의 V / F의 m)을 생성하기 위해 스프레드 시트 또는 그래프 소프트웨어로 전달 될 수있다 . 조류 형광 및 F의 V / F의 m가 그것에 혼자 (제어) 성장 조류를 비교하여 세균에 의해 영향을하는 방법을 그림 3들을 도시의 그래프는 10 일 공동 배양 실험을하는 동안 공동 문화의 박테리아로 성장하고 (그림 3C). 이 예에서, 두 개의 표본 t 검정 통계적으로 하루에 두 처리 사이의 파라미터를 비교하기 위해 사용 하였다. 마찬가지로 실험되는 두 개 이상의 치료 ANOVA 수도 존재사용. 포화가 주 PSII 전자 수용체 QA가 완전히 감소되고 PSII 반응 중심 P680에서 어떤 더 많은 전자를 받아 들일 수없고, 이와 같이, 모든 반응 중심 '이되는 것을 의미한다 펄스 LED 후 (도 3b) 판독 F의 m 직접 촬영 17 '폐쇄. 이것은 최대 형광 방출을 가져, 광 에너지의 이용을 방해 광화학. 이 후, 최대 형광 (F의 m) 판독을 제공한다. 공 배양 균과 성장 단독 (대조군)에 비해도 3c는도 5 (D) 및도 10 (D) 사이에서 PSII 건강 극적인 감소를 나타낸다. 표준 오차 막대는 같은 부모의 박테리아 및 조류 문화 독립적 인 실험 3 부가 마이크로 타이 우물에서 파생됩니다. 그것은 repli로 사용될 독립적 인 실험이 허용 일관 작은 표준 오차 조류 생물 검정 용 마이크로 타이 터 플레이트 포맷의 견고성과 재현성을 확인케이 츠 및 실험 기간에 걸쳐 실험 부 표본 할 필요성을 제거한다.
무균 인 Emiliania의 huxleyi (CCMP3266)의 140 (D)의 성장 곡선을도 2 주제 WATER-PAM의 형광 측정 그래프. 초기 조류 형광 (A) 판독 (F 0), (B)의 최대 조류 형광 (F의 m) 및 ( E.위한 C) 잠재적 인 양자 수율 (F의 V / F의 M) huxleyi 검은 색 원으로 표시됩니다. F 0 F m에 대한 최적의 라인은 각각 정상 로그 3 매개 변수 (SigmaPlot) R에게 = 0.94이 0.95이었다. 잠재적 인 양자 수율 (F의 V는 / F m)은 다음과 같이 계산됩니다 광합성 건강의 차원 표현이다 (F m에 - F 0) / F의 m. F의 V / F의 m 곡선에 대한 최적의 라인은 3 계수 다항식 R에게 = 0.6이이었다. 오차 막대는 세중 우물 사이의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Phaeobacter gallaeciensis BS107와 인 Emiliania huxleyi (CCMP3266)의 10 D 공동 배양 실험 그림 3. 대표 WATER-PAM의 형광 측정 그래프. (A) 초기 조류 형광 (F 0), (B) 최대 조류 형광 (F의 M) 및 (C) 잠재적 인 양자 수율 (F의 V / F의 m은) contro에 대한 그래프로패 조류 (오픈 원)과 조류 박테리아 (검은 색 원)과 공동은-배양. 잠재적 인 양자 수율 (F의 V / F의 m)은 다음과 같이 계산됩니다 광합성 건강의 차원 표현이다 (F m에 - F 0) / F의 m. 오차 막대는 세중 우물 사이의 표준 오차를 나타냅니다. 별표 (*)가 제어와 공동 배양 처리에 대한 파라미터가 크게 달랐다하는 일을 나타낸다. 모든 일에 대한 치료의 차이점은 모든 세 개의 매개 변수에 10 D (10 D를 제외한 비 유의 하였다 - F 0 : DF = 2.5, t-비율 = -15, P = 0.0017 t-test를 *; F의 m : T- 테스트, DF = 2.1, t-비율 = -16.15, p = 0.003 *; F의 V는 / F는 m :. t-테스트, DF는 -18.68, t-비율 = 2.0, P = 0.0028 *) = 여기를 클릭하세요하여 볼 수 있습니다 이 그림의 더 큰 버전.
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Discussion
소형 형식으로 조류 성장.
현재 실험에서 복제가 증가 될 수 있도록 마이크로 타이 터 플레이트에서 1ml의 배양 부피 조류 배양의 소형화를 허용한다. 이 녹조류는 실험 내내 건강 보장하는 것이 중요하다; 조류의 영양 요건이 충족 될 수 있도록, 다양한 조류 매체를 평가하기 위해 마이크로 타이 터 플레이트 포맷을 사용하여, 성장 곡선 (도 2)를 수행한다. 또한,이주기 일주 (명암주기)과 온도를 최적화하는 것이 중요 할 수있다. 주어진 조류에 대한 적절한 최적화는 26 D에 대한 피크 형광에서 건강한 조류 문화를 유지하고 1백40일 (그림 2) 후 잠재적 인 양자 수율을 검출 할 수 있습니다.
증발 효과를 최소화.
그것은 "에지 효과"뿐만 액체 기재 분석법의 증발 효과를 최소화하는 것이 중요하다 O 일반적bserved 접시의 중앙을 향해있는 웰에서보다 미세 적정 플레이트의 웰의 가장자리가 큰 증발이다. 증발 플레이트는 가장자리에서 관찰되었지만, 증착 속도는이 형식으로 유지 된 26 (D) (도 2)에서의 피크와 형광, 건강 조류 배양 등 실험 기간을 한정하는 것은 아니다. 잠재적 인 "에지 효과"최소화하기 위해, 1X PBS (PH 7.4), 또는 기타 멸균 용액, 네 모서리 (H 열 및 행 1 및도 6,도 1)을 따라 우물에 분취한다.
낮의 인큐베이터 내에서 조명합니다.
마이크로 타이 터 플레이트는 모두 낮 인큐베이터 같은 방향을 가져야한다. 예를 들어, 인큐베이터에서 미세 적정 플레이트의 길이 방향 배향 플레이트를 짧은 축을 따라 배치된다는 것을 의미한다. 이 배향을 사용하는 경우, 장축을 따라 BG 조류 배양 물 (도 1) experienc에 있습니다때문에 광원으로부터의 거리의 변화에 EA 약간의 빛과 온도 구배 (전구는 빛과 열 모두의 근원이다). 이것은 이들 온도 범위의 극한 온도에서 해조류 분석에 영향을 관찰되었다. 따라서 이것은 그들의 최적 성장 온도는 대부분의 조류에 영향을 미치지 않을 것이다. 필요한 경우 조명 수준을 줄이기 위해 그늘 천 사용, 불빛에서 일관된 거리, 큰 병 음영을 생성하지 않는 그 곳 판을 보장이 빛과 온도 구배의 영향을 최소화하고의 긴 축에 걸쳐 빛의 강도를 확인하려면 낮의 인큐베이터는 균등하게 이동하는 보장합니다.
WATER-PAM의 형광 측정을위한 조류 샘플의 어두운 적응.
수행하기 전에 물-PAM은 중요하다 판독 어두운 적응 광계 반응 중심은 완전히 개방과 빛에 의한 transthylakoidal의 pH 구배가 완전히 소모된다, 일이되도록 조류 샘플을우리는 F의 V / F의 m을 계산하는 진정한 F 오와 F의 m 값을주고. 8 시간 빛 : 16, 즉 낮의주기 (의 어두운 단계의 중간에 물-PAM 측정을위한 분석에서 조류 샘플링) 어두운주기, 2 시간 샘플링 세션이 T (어두운에서 수행 할 것이다 = 3 - 어두운 적응이 더 긴 9 시간) (> 20 분) - 17 = 7 - (빛주기 (T (빛의 중간에 비해 5 분) 3) 5 시간)는 어두운 적응 시간을 단축한다. 조류의 어두운 적응 시간도 조류 종, 성장 조건 및 자연 서식지 범위의 조명 조건에 따라 달라집니다.
WATER-PAM의 형광 측정 수치의 감도.
WATER-PAM은 이러한 바다 표면의 물 (16)로 F, 낮은 엽록소 샘플에서 F 0 F m을 검출 할 수있는 고감도 형광으로 설계되었습니다. 따라서 그것은 이상적으로 miniatu에 적합샘플이 희석 될 수있다 음 공인 된 생물 검정. 이러한 민감도로 인해 그 WATER-PAM 기계 형광 판독 값의 상한 (즉, F, F 0 및 / 또는 F를 m) 시료가 충분히 희석하지 않은 경우 (도 4)이 있는지 이해하는 것이 중요하다. WinControl 소프트웨어 내에서 최대 값은 F 0을 누르고 F 0 (직접 어두운 적응 후)을 읽은 후 눈에 띄는 첫 번째입니다. 따라서 F와 F m의 최대 값 4056 (그림 4, 아니. 2286)에 있습니다. F 및 F m의 최대 값 WATER-PAM을 보정하는 데 사용되는 조류 매체의 종류에 의존하지만, 시료가 충분히 희석 될 때까지 동일한 최대 값으로 반복 판독이 발생하기 때문에, 검출 한계의 시료를 용이하게 식별 될 수있다 . 한 후 : 조류 미디어 희석 한, 덜 농축 샘플은 다시 암순응이고 F 0 측정을 반복 하였다. F 값ppears 정확하게 측정 할 수 있지만 F의 m은 여전히 최대 값 4056 (그림 4, 아니. 2287)를 읽고 있습니다. (. 2288 그림 4, 아니오) :이 샘플을 다시 한 희석 다른 F 0 읽기를 복용하기 전에 다시 어두운 추가 3 분 동안 적응 조류 미디어 1 유효 측정 값을 얻었다, 그래서 다음 측정 (F)을 촬영하고, F의 V / F m을 계산은 유효합니다. F의 F와 0 m의 계산에 고려되어야 배지로 한 비율이 예에서, 샘플은 1 회 희석 하였다. 이것은 샘플이 너무 광합성 건강 차원 표현에도 불구하고 농축하는 경우, 잘못 계산 F 0 및 F (m)의 직접적인 함수로서, 즉 F의 V / F가 m을 주목하는 것이 중요하다.
조류 샘플 올바른 희석을 달성하기 위해 희석되고 순차적으로 여러 WATER-PAM의 형광 측정 판독 그림 4. WinControl 표시됩니다.이 그림 표시 조류 형광 WATER-PAM 기계 (빨간색 상자)의 상한에 도달 판독하고 그 곳 샘플의 적절한 희석 (녹색 상자)를 실현하고 있습니다. (13,16,20-22 리뷰 참조) 또한,이 그림은이 방법을 계산하는 다른 변수의 일부 도시 만이 여기에 자세히 설명되어 있지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세균 오염.
모든 실험에서 조류, 조류 제어 조류 건강 기준선 필요한, 그래서 그것이 실험 내내 세균 오염없는 유지하는 것이 필수적이다. 더 존재하는 한 세균 오염이 쉽게 발생하지 않는다(항생제 등) 선택과 광합성 지속적으로 박테리아의 성장을위한 새로운 유기 탄소를 생산하고 있습니다. 오염을 방지하기위한 가장 중요한 두 가지 방법은 모든 해법 미세 적정 플레이트를 처리하는 동안 (예를 들어, 조류 매체, 1X PBS, pH를 7.4) 실험 T = 0 (D)에 장비 및 무균 기술을 유지하기의 무균 성을 보장하는 것이다. 모든 실험은 조류 대조군 웰에서 20 μL 분취를 도금함으로써 각 시점에서의 오염에 대해 감시되어야한다. 오염이 다음 조류 제어 우물의 관찰되면 그 물-PAM의 형광 측정 수치는 언급과 데이터 분석에서 제외되어야한다. 실험을 설정하는 데 사용되는 용액은 전체 실험이 오염되게되면, 실험 및 오염 된 모든 시약을 버리고 다시 시작한다. 세균 제어 및 박테리아 - 조류의 공동 문화도 오염 될 수 있으며, 세균 CFU 카운트에 사용되는 한천 플레이트는 다른 식민지 morphol 모니터링해야ogies. 웰 - 투 - 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 뚜껑을 제거하지만, 쉽지 않아 경사 또는 플레이트 진탕시켜 불꽃 층류 후드에서 또는 근처 무균 기술을 이용함으로써 회피 할 때 교차 오염이 발생할 수있다.
미래의 응용 프로그램.
이 작은 볼륨은 생물학적 검정 WATER-PAM의 형광 측정으로 마이크로 타이 터 플레이트 포맷을 조합하여 미세 조류 신속한 스크리닝 방법을 제공한다. 미래의 응용 프로그램의 예는 다양하고, 개별 셀 (24)에 PAM의 형광 측정을 수행으로 인구 내에서 광계 건강의 세포 - 세포 변화에 대한 통찰력을 제공 이미징 PAM의 형광 측정을 포함 할 수있다. 생물학적 검정은 현미경과 결합하고 전술 한 바와 같이 유동 세포 계측법있다. 추가 통찰력을 제공 할 가능성이있는 다른 조합은 유동 세포 계측법 및 조류 배양의 개체군 내의 형태 학적 변형을 밝히기 현미경 세포 얼룩이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48-well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
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