Abstract
Gebruikelijke werkwijzen voor experimentele manipulatie van microalgen grote hoeveelheid voedingsoplossing (20 ml tot 5 l) toegepast, waardoor de kweek gedurende het experiment 1-7 worden subsampled. Subbemonstering grote volumes problematisch om verschillende redenen: 1) het veroorzaakt variatie in het totale volume en het oppervlak: volume verhouding van de cultuur tijdens de proef; 2) pseudo-replicatie (dwz identieke monsters van dezelfde behandeling kolf 8) wordt vaak gebruikt in plaats van echte duplo (dwz bemonstering van herhaalde behandelingen); 3) de duur van het experiment is beperkt door het totale volume; en 4) axenic culturen of de gebruikelijke bacteriële microbiota moeilijk te handhaven gedurende langdurige experimenten verontreiniging frequent voorkomend steekproef van.
Het gebruik van microtiterplaten staat stelt 1 ml kweek volumes worden gebruikt voor elke repliceren, met tot 48 afzonderlijke behandelingen binneneen 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plaat, waardoor de experimentele volume afneemt en waardoor voor uitgebreide replicatie zonder steekproef van enige behandeling. Daarnaast kan deze techniek worden gemodificeerd om een verscheidenheid van experimentele formaten zoals fit: bacteriën en algen co-culturen algen fysiologie tests en toxine screening 9-11. Individuele putjes met een alg, bacterie en / of co-culturen worden bemonsterd voor talrijke laboratoriumprocedures waaronder, maar niet beperkt tot: WATER-Pulse Amplitude-gemoduleerde (WATER-PAM) fluorometrie, microscopie, bacteriële kolonievormende eenheid (CFU) tellingen en flow cytometrie. De combinatie van de microtiterplaat formaat en WATER-PAM fluorometrie zorgt voor meerdere snelle metingen van fotochemische opbrengst en andere fotochemische parameters met een lage variabiliteit tussen de monsters, hoge reproduceerbaarheid en vermijdt de vele valkuilen van de steekproef van een mandfles of erlenmeyer in de loop van een experiment .
Introduction
Fytoplankton fysiologie is van oudsher bestudeerd in meso-schaal experimenten gaande van 20 ml in erlenmeyers tot 5 L in mandeflessen 1-7. Deze experimentele schaal vereist subsampling voor experimentele monitoring, zoals offeren identieke monsters voor elk tijdstip creëert een onbeheersbare experimentele opstelling.
De mogelijkheid om het aantal onafhankelijke experimenten vergroten en met dezelfde dagelijkse incubatorruimte door miniaturiseren experimentele volume algen fysiologie experimenten zal verminderen of elimineren de beperkingen van subsampling en pseudo-replicatie van grote volumes. Een microtiterplaat formaat werd ontwikkeld voor algen bioassays met een 1 ml kweek volume experimenteel manipuleren algen in wisselende omstandigheden. Dit kleine experimentele volume maakt het aantal herhalingen te verhogen, verhoogt experimentele reproduceerbaarheid door een verminderde variabiliteit tussen analysemonsters enexperimenten, en maakt waar replicatie behoud experimentele controles (dwz axenic algenculturen) voor 140 dagen (figuur 2) 12.
Deze microtiterplaatformaat geeft ruimte voor verschillende experimentele vragen als: is een bacterie een symbiotische, neutrale of pathogene interactie met algen host? Is de toevoeging van een verbinding stimulerende of toxisch een alg? Deze en andere vragen kunnen worden gericht op een snelle high-throughput manier gebruik van dit nieuwe formaat 9-11.
Een 48-well microtiter plaat cultuur kan elk 1 ml en een onafhankelijke experimentele opstelling die wordt bemonsterd op één tijdpunt zijn. Verscheidene parameters kunnen worden bemonsterd uit dit volume 1 ml waaronder, maar niet beperkt tot: chlorofylfluorescentie en fotochemische parameters met WATER-Pulse-amplitudegemoduleerde (WATER-PAM) fluorometrie (zie Materialen en uitrusting tabel) 13. WATER-PAM fluorometrie is een snelle en niet-invasieve techniek die kan worden gebruikt voor experimenten uitgevoerd met algen 13 volgen. Het laat meten van fotosynthetische efficiëntie en PSII de gezondheid van een kleine cultuur volume (150-300 ul van cultuur verdund in middelgrote tot een 2-4 ml volume voor WATER-PAM) 14,15. Naast WATER-PAM fluorometrie, kan deze opstelling worden gebruikt om een verscheidenheid van andere parameters zoals meten, maar niet beperkt tot: microscopie om de bacteriën aan algen cellen en veranderingen in de algen celmorfologie visualiseren; bacteriële kolonievormende eenheid (cfu) tellingen; en flowcytometrie voor algen cellen en het identificeren van subpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Berekeningen voor Experimentele Setup
- Bereken het volume van algen en / of bacteriële culturen die nodig zijn voor de controles die nodig zal zijn voor het gehele experiment met behulp van vergelijking 1:
Wanneer y gelijk aan het aantal controles bestaan per dag en z gelijk aan het aantal dagen. - Bereken het volume van algen en / of bacteriële culturen die nodig zijn voor co-kweken voor de proef door Vergelijking 2:
OPMERKING: Het is mogelijk om experimenten 'co-cultuur' te vervangen door een verbinding scherm; net pas de uiteindelijke verbinding, oplosmiddel en algen concentraties aan de experimentele opzet past. - Gebruik vergelijkingen 1 en 2 om het uiteindelijke volume van de vroege-exponentiële algencultuur berekenen (algemeen 5 dagen voor ~ 10 4 cellen / ml, maar dit moet worden bepaald door Performing een algengroei curve) vereist voor het experiment (dit volume nodig voor stap 2.3) met vergelijking 3:
- Gebruik Vergelijkingen 1 en 2 bij het eindvolume 10 4 cfu / ml bacteriecultuur (of gewenst inoculatie concentratie) vereist voor het experiment (dit volume nodig voor stap 4.2) met behulp van vergelijking 4 berekend:
OPMERKING: Gebruik de extra 10 ml in stappen 1.3 en 1.4 om rekening te houden pipetteren fout en alle tests die worden uitgevoerd (bijvoorbeeld, WATER-PAM, flowcytometrie, microscopie, etc.) op 0 d. Verhoog dit volume als dat nodig is om de experimentele opzet past.
OPMERKING: Voor een voorbeeld berekening van een 8-daagse experiment zie paragraaf 10. Zie aanvullende tabel voor de media recepten.
2. Groeiende algencellen voor Experimentele Setup
- Isoleren of het verkrijgen van eenactief groeiende axenische algencultuur.
- Aseptisch overdracht van 10% van het uiteindelijke volume van de algen cultuur in steriele algen medium (bijvoorbeeld L1 of soortgelijke mariene algen medium, zie materialen en apparatuur tabel), zorgen voor een 1: 9 verdunning van algenkweek in vers medium. Groeien de verdunde alg in een dagelijkse incubator met vooraf bepaalde groeiomstandigheden voor die stam (bijvoorbeeld 18 ° C met een 16: 8 uur licht: donker cyclus wordt vaak gebruikt).
- Wanneer de kweek vroege exponentiële fase, re-cultuur tot de alg in hetzelfde steriele medium algen (bijvoorbeeld L1 of dergelijke mariene algen medium), zorgen de uiteindelijke concentratie in een 1: 9 verdunning en het eindvolume van algen gelijk aan het V A berekende (stap 1.3).
OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen deze culturen zijn axenische. Test alle algen media en algen voorraad flessen voor besmetting door plating een 20 ul monster op een algemene mariene bacteriële medium (bijv MarineBouillon 2216 aangevuld met 1,5% agar of iets dergelijks). - Groeien algencultuur vroeg-exponentiële fase (~ 10 4 cellen / ml).
OPMERKING: Elke algen stam heeft een unieke groeicurve afhankelijk van kweekomstandigheden. Vroeg-exponentiële fase (~ 10 4 cellen / ml) kan worden bepaald door het uitvoeren van een algengroei curve gebaseerd op celdichtheid (bijvoorbeeld met flowcytometrie of microscopie).
3. Voorbereiden van bacteriële cellen voor Inenting
- Vooraf de bacteriële concentratie (cfu / ml) en optische dichtheid (OD) van de bacterie bij stationaire fase door het doen van een groeicurve in de gekozen bacteriële medium en groeiomstandigheden (bijv Marine bouillon 2216 bij 25 ° C en 160 rpm, of iets dergelijks). Gebruik deze informatie om de cellen (stap 3.3) groeien en later om de cellen goed te verdunnen in stap 3.7.
- Aseptisch overbrengen een geïsoleerd en vers geteelde bacteriële kolonie van een 1,5% agar plaat (bijvoorbeeld, Marine Bouillon 2216 soepelteerd met 1,5% agar of soortgelijke mariene bacteriële vast medium) in 5 ml van bacteriële vloeibaar medium (bijvoorbeeld, Marine Bouillon 2216 of soortgelijke mariene bacteriële gemiddeld).
- Groeien de bacterie stationaire fase op een rollende trommel of shaker (~ 12-36 uur, afhankelijk van de bacterie). Plan het experiment zodat de bacterie stationaire fase (~ 10 augustus - 10 september cfu / ml) bereikt tegelijkertijd de algen cellen de vroege exponentiële fase (~ 10 4 cellen / ml) bereikt.
- Met behulp van een pipet, spoelen elke biofilm die aan de reageerbuis in het medium. Pipetteer 1 ml van goed gemengde bacteriecultuur in een steriele 1,5 ml microtube. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14.000 x g.
- Verwijderen en afvoeren van het supernatans (bacteriële media) zonder verstoring van de pellet (bacteriële cellen). Voeg 1 ml steriel algen media (bijvoorbeeld L1 of dergelijke) aan de microbuisjes (met pellet). Vortex microbuisje om pellet opnieuw in suspensie in algen media.
- Tweede wasbeurt:Herhaal stap 3.5.
Opmerking: Het is cruciaal om de bacteriële cellen met algen media wassen om grondig alle bacteriële media, cel detritus, uitgescheiden eiwitten en kleine moleculen uit de cellen te verwijderen voorafgaande aan enten algen met hen als dit de nutriënt samenstelling kan veranderen de algen media of introduceren bioactieve moleculen aan het scherm. - Serieel verdunnen gewassen bacteriële cellen in algen media, tot een uiteindelijke concentratie die 100 maal meer geconcentreerd dan de gewenste uiteindelijke bacteriële concentratie (cfu / ml). Sla de microbuisjes met cellen die zijn gewassen en verdund in algen media voor stap 4.2.
OPMERKING: Plan het experiment op basis van een 1: 1 verhouding van algen bacteriën op 0 d. Om dit de gewenste initiële bacteriële concentratie te doen voor het experiment is 10 4 kve / ml, zodat in stap 3.7 moeten de eerste cellen in serie worden verdund tot 10 6 kve / ml.
4. Voorbereiding Bacteriën voor Experimental Setup
- Bereid 4 steriele geautoclaveerd glas erlenmeyers en label ze: a) "algen controle fles ', b)' verdund bacteriële voorraad fles ', c)' bacteriële controle fles ', en d)' co-kolf '.
- Verdun de bacteriële suspensie van stap 3.7 1:99 met steriel algen media tot een eindvolume = V B (stap 1.4). Maak de verdunning in de kolf label verdunde bacteriële voorraad (stap 4.1).
Opmerking: In het voorgaande voorbeeld (stap 4.2), dit 1:99 verdunning geeft een eindconcentratie van 10 4 cfu / ml. Swirl kolf met cellen te mengen. - Pipet V controle (stap 1.1) uit het verdunde bacteriële voorraad en zet het in de bacteriële controle kolf.
- Pipetteer V control steriel algen medium in het bacteriële controle kolf (dit is een 1: 1 verdunning). Swirl kolf aan cellen te mengen en zet opzij voor stap 7.3.
- Pipette V co-cultuur uit het verdunde bacteriële voorraadkolf aan de co-cultuur fles, zet fles opzij voor stap 6.1.
OPMERKING: tijdens meerdere co-culturen dezelfde alg tegelijk (bijvoorbeeld, een co-kweek van twee verschillende bacteriële isolaten één controle) moet laten berekenen V co-cultuur elke stam afzonderlijk en vervolgens stap herhalen 4,5 voor elke co-cultuur afzonderlijk. Ook moet de V A berekende stap 1.3 verhogen zowel coculturen weergegeven in Vergelijking 5 omvatten:
5. Voorbereiding Algen voor Experimentele Setup
- Meng de vroege-exponentiële algencultuur (uit stap 2.4) met een brede mond pipet tot cellen blijken goed gemengd.
- Pipet V controle van de algen voorraad fles om de algen controle kolf. Zachtjes pipet met een pipet 10 ml. Dan terug de algen voorraad fles in de couveuse dagactieve.
- Pipet V control steriel algen medium om de algen controle kolf (dit is een 1: 1 verdunning). Wervelen om kolf en plaats te mengen in de couveuse dagactieve, totdat het nodig is voor de stap 7.4.
6. Voorbereiding Experimentele Co-cultuur
- Zachtjes pipet V co-cultuur van de algen voorraad kolf in het bacteriële co-kolf uit stap 4.5. Terug co-cultuur kolf aan de couveuse dagelijkse totdat het nodig is voor de stap 7.5.
OPMERKING: De concentratie van bacteriën in de bacteriële controle dient de bacteriële concentratie gelijk aan de experimentele co-cultuur. Evenzo moet de concentratie van algen in de algen controle van de concentratie van algen gelijk in de experimentele co-cultuur. Door dezelfde oorspronkelijke bacteriën en algen concentraties de bevolkingsdichtheid vergeleken gedurende het experiment.
7. Het opzetten van microtiterplaten
- Verdeel een steriele 48-well microtiterplaat volgens figuur 1.Label boven buitenste putjes bevattende ofwel steriel verdunningsmiddel of niet-fotosynthetische monsters.
OPMERKING: Randomisatie van de putjes kan voor monsters die op dezelfde dag. Zo zal kwadrant 1 worden bemonsterd 1 d in het experiment; de putjes die moeten worden gerandomiseerd zijn B2 - 4 en C2 - 4. Laat de omtrek van de plaat gevuld met steriele oplossing zoals weergegeven in figuur 1.
. Figuur 1. Schematische weergave van monster plaatsing in een 48-well microtiterplaat Wells worden gevuld als volgt: kolom 1 en 6, putjes A tot F ( 
) Zijn gevuld met 1 ml 1x PBS (of een andere steriele oplossing / media). Rijen A en F, putten 2-8 ( 
) Zijn gevuld met 1 ml bacteriële controle; rows B en E putten 2-8 ( 
) Zijn gevuld met 1 ml algen controle; rijen C en D, putjes 2 - 8 ( 
) Zijn gevuld met 1 ml co-kweek. De plaat bestaat uit 4 kwadranten (A2, A5, D2 en D5) deze kwadranten elk bemonsteringssequenties dagen 1-4, moet dit worden gerandomiseerd gedurende platen en dienovereenkomstig gelabeld. Binnen elke dag raden we randomizing de algen controle ( 
) En co-cultuur ( 
) Putten met behulp van een random number generator. Label de deksel op de 1x PBS en / of bacteriële controle putten schaduw van algenculturen voorkomen.
- Pipetteer 1 ml 1x fosfaatbuffer (PBS, pH 7,4) of andere steriele oplossing in de geschikte putjes zoals in figuur 1. Voer deze langzaam en zorgvuldig. PBS zal change de ionische sterkte van de algen en / of co-kweekmedium als het splatters in andere putten zo zorgvuldig omgaan.
- Pipetteer 1 ml van bacteriële controlecultuur in putten gemerkte bacteriële controle (Figuur 1). Zwenk de bacteriële fles voordat pipetteren elke plaat om bacteriële bezinking te voorkomen.
- Pipetteer 1 ml van algen controlecultuur in putten gemerkte algen besturing met een brede mond pipetpunt (figuur 1). Zwenk de algen kolf zo regelmatig als de bacteriële kolf. Als de alg neiging te zinken of drijven, swirl zo vaak als nodig is om een visueel uniform cultuur behouden.
- Met een brede mond pipet, pipet 1 ml co-cultuur in de geschikte putjes (Figuur 1). Wervelende de co-cultuur kolf zo regelmatig als de algen kolf.
- Verzegelen elke plaat met parafilm en plaats in een dagelijkse incubator op de gewenste temperatuur en de dagelijkse licht cyclus (18 ° C met een 16: 8 uur licht: donker cyclus wordt vaak gebruikt). Vertrekkende platen in de incubator dagelijkse pas klaar voor PAM lezingen (rubriek 8) nemen. Controleer alle platen zijn georiënteerd in dezelfde richting te zorgen voor consistente belichting.
- Neem een 20 pi aliquot van het PBS, algen media, algen voorraad en algen controle en drop plaat op een geschikte niet-selectief medium (bijvoorbeeld, Marine Bouillon 2216, aangevuld met 1,5% agar) en incubeer platen bij 18 - 25 ° C gedurende 72 hr te testen op contaminatie. Als de groei wordt in elk van de oplossingen die niet bacteriën moet bevatten, dan zijn deze gegevens niet worden gebruikt.
- Neem PAM fluorometrie metingen met behulp van de resterende monster uit de algen controle en co-cultuur kolven voor de experimentele 0 d PAM fluorometrie lezen (zie stap 8.1). Andere 0 d metingen worden uitgevoerd met de resterende algen controle bacteriële controle en co-cultuur monsters.
8. Het nemen van PAM fluorometrie Lezingen uit Stock Samples
- Nul de WATER-PAMmet steriele algen media in een schone cuvet alvorens metingen 8.
- Pipetteer 300 ul van algen control of co-cultuur flessen in een schone cuvet met 2,7 ml van hetzelfde medium algen gebruikt in het experiment. Meng het monster en verdunningsmiddel voorzichtig met een brede mond pipet tip.
- Wipe-off alle vingerafdrukken van buiten cuvette met een tissue voor het plaatsen van de cuvet in de WATER-PAM.
- Plaats cuvette in WATER-PAM. Bedek het monster met de dop en laat het donker aan te passen voor 3 min. Dark aanpassing variëren afhankelijk van de soorten algen en moet worden vastgesteld voor het specifieke alg gebruikt in het experiment. Vermijd langdurige donkere passingstermijnen (> 20 min) rekening WATER-PAM waarden in het midden van de donkere cyclus van de algen dagelijkse incubators 16,17.
- Na het donker aanpassing, raakte F 0-toets. Als fluorescentie metingen boven 3.900, verdunnen monster 1: 1 in algen medium. Dark-passen gedurende nog 3 minuten en takea nieuwe lezen. Als de F 0 of F m lezingen zijn nog steeds boven 3900, blijft het monster te verdunnen 1: 1 in algen medium totdat de F 0 en F m lezingen zijn onder 3.900.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u rekening te houden met deze verdunningen bij het opnemen uiteindelijke fluorescentie: bijvoorbeeld als de algen monster wordt verdund 1: 9 tijdens de eerste overdracht van het goed aan de verwatering buis, dan is de algen fluorescentie lezing van 500 moet worden vermenigvuldigd met de inverse van de verdunningsfactor (in dit geval 10) en de feitelijke fluorescentie van de buis dan 5.000. - Na het instellen van F 0, neem een verzadigende puls (SAT-Pulse) lezen elke 90 sec door het raken van de SAT-toets om F m lezingen te nemen. Het tijdsinterval tussen metingen kan worden aangepast afhankelijk van algen stam. Discard monster.
- Herhaal stap 8,1-8,6 voor de overige monsters.
9. Het nemen van PAM fluorometrie Lezingen van microtiterplaten
- Label6 steriele monsterbuizen van> 3 ml volume putjes B2 - 4 voor de algen controle en putjes C2 - 4 voor de bacteriële co-kweek (zie plaatindeling figuur 1).
- Aliquot 2,7 ml steriel algen medium in elke buis.
- Plaats de buisjes in incubator dag- en hen in staat stellen om te acclimatiseren aan de temperatuur van de alg werd gekweekt bij 30 min.
- Vóór het verwijderen van de microtiterplaat uit de incubator ervoor te zorgen dat het licht penetratie in het donker gewend putten wordt beperkt door het bedekken van de plaat met aluminiumfolie (of iets dergelijks), maar verwijder de folie tijdens het actief overdragen van cultuur uit de bronnen naar de verdunning buizen (stappen 9.5 - 9.7).
- Aseptisch meng de eerste microtiterplaat goed (goed B2) met een brede mond pipettip door langzaam en neer te pipetteren.
- Haal de verdunning buizen uit de incubator en aseptisch overbrengen 300 ul van en B2 (figuur 1) zijn overeenkomstige monsterbuisje met een brede mond pipetpunt (Dit is een 1: 9 verdunning van het monster in algen gemiddeld).
- Herhaal stap 9,5-9,6 voor de resterende putjes (B3,4 en C2 - 4).
- Bedek monster buizen met aluminiumfolie en ze terug naar de couveuse dagactieve tot klaar voor WATER-PAM.
- Voeren WATER-PAM lezingen, zoals beschreven in de stappen 8,1-8,7. Dicht de microtiterplaat met parafilm alvorens terug te keren naar de incubator.
- Herhaal de metingen op geplande tijdstippen voor de duur van het experiment. De frequentie en duur van bemonstering gepland begin van het experiment.
10. Steekproef Experiment
Het monster experiment is een 10 dagen co-cultuur van een bacterie (Phaeobacter gallaeciensis BS107) en een microalg (Emiliania huxleyi stam (CCMP3266)). Het omvat een algen control, bacteriële controle en een bacterieel algen experimentele co-cultuur.
- Bereken volumes van bacteriële en algen voorraden nodig (stap 1.1-1,4)
- Bereid de algen stock, een VA 40 ml, door het enten 4 ml alg in 36 ml medium en geïncubeerd tot vroege exponentiële groei wordt bereikt met een celdichtheid van ~ 10 4 cellen / ml (stappen 2,1-2,4).
- Bereid de bacteriële voorraad kolf door het verdunnen van 400 ul van de 10 6 kve / ml bacteriën verkregen in hoofdstuk 3 tot en met een V B van 40 ml met algen media (uiteindelijke concentratie van bacteriën zal 10 4 kve / ml).
- Transfer helft (20 ml) van de bacteriële voorraad op de bacteriële controle kolf en voeg 20 ml algen media om de bacteriële controle maken. Transfer helft (20 ml) van de algen bouillon aan de algen controle kolf en voeg 20 ml van algen media te maken van de algen controle (hoofdstuk 5). Breng de resterende 20 ml van bacteriële bouillon aan de co-cultuur kolf en meng met de resterende 20 ml van algen bouillon aan de co-cultuur te vestigen (Sectie6).
- Pipetteer de 1x PBS (pH 7,4), controles en co-cultuur twee gelabelde microtiterplaten (figuur 1), 1 ml per putje. Gebruik 3 ml van de resterende controles en co-culturen 0 d metingen (kve tellingen, WATER-PAM (hoofdstuk 8), microscopische observatie van algencel morfologie en algencel fixatie voor flowcytometrie) te maken.
- Neem WATER-PAM metingen van de algen controle en co-cultuur eenmaal daags gedurende 10 d, en altijd tegelijkertijd de 0 d metingen werden genomen (Deel 8).
11. Andere parameters die van belang
- Bepaal bacteriële kve concentratie: het uitvoeren van een seriële verdunning van de bacteriële controle en co-cultuur in steriele 1x PBS (of iets dergelijks), dan vallen plaat op Marine Bouillon 2216, aangevuld met 1,5% agar (of iets dergelijks) en let op het aantal kve die groeien de bacteriële cfu / ml te bepalen voor elke wel 18.
- Om de algencel concentratie evalueren: fix algen controle en cocultuur met een 0,15% uiteindelijke concentratie van glutaaraldehyde. Incubeer gedurende 10 minuten in het donker, dan flits bevriezen in vloeibare stikstof, en bewaar bij -80 ° C. Proces alle monsters op een flowcytometer (FACS Calibur of vergelijkbaar) met algen cellen te tellen.
- Observeren algencel morfologie: algenculturen en bacteriële-algen co-cultuur met behulp van microscopie (dwz, lichtmicroscopie, epifluorescentie, of iets dergelijks).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WATER-PAM fluorometrie lezingen.
WATER-Pulse-amplitudegemoduleerde (PAM) fluorometrie is een snelle en efficiënte methode om de fluorescentie (een proxy voor het gehalte aan chlorofyl) en fotosynthetische rendement (PSII gezondheid) van algenculturen bepalen. De PAM WinControl software genereert een spreadsheet van ruwe data waarden voor (de volgende zijn de fundamentele parameters voor donkere aangepast algen monsters):
F 0 = fluorescentie van donker aangepaste cellen
F m = maximale fluorescentie na het verzadigen van light-emitting diodes (LED) puls
F v / F m = (F m -F 0) / F m = potentieel quantum yield van een donker aangepaste steekproef 19
PAM fluorometrie heeft vele toepassingen en kan veel informatie te geven over het fotosysteem en de gezondheid van de alGae. Daarnaast zijn er andere parameters die van belang zijn bij het testen licht aangepast monsters. Voor verdere lezen van deze worden in detail besproken in deze reviews 13,16,20-23. Deze gegevens kunnen worden overgebracht naar een spreadsheet of grafische software grafieken van de initiële algen fluorescentie (F 0), de maximale algen fluorescentie (F m), en de mogelijke kwantumopbrengst (Fv / Fm, figuren 2 en 3) genereren . De grafieken in figuur 3 verbeelden hoe de algen fluorescentie en Fv / Fm beïnvloed door de bacterie door vergelijking van de alg alleen (controle) gekweekt te gekweekt met de bacterie in co-kweek gedurende de 10 dagen co-cultuur experiment (Figuur 3C). In dit voorbeeld werd een twee-monster t-test gebruikt om de parameters te vergelijken statistisch tussen de twee behandelingen op elke dag. Ook voor experimenten waarbij meer dan twee behandelingen aanwezig, een ANOVA kanworden gebruikt. De F m lezing (figuur 3B) wordt direct na de verzadigende LED puls, waardoor de primaire PSII elektron acceptor QA volledig gereduceerd en kan niet meer elektronen van het PSII reactiecentrum P680 accepteren, en als zodanig, zijn alle reactiecentra ' gesloten '17. Dit belemmert de fotochemische gebruik van licht-energie, waardoor fluorescentie-emissie tot een maximum. Dit geeft dan de maximale fluorescentie (F m) lezen. Figuur 3C toont een dramatische daling PSII gezondheid tussen 5 en 10 d d wanneer samen gekweekt met de bacterie in vergelijking met groeien alleen (controle). De standaardfout staven zijn afgeleid uit drievoud microtiterputjes die onafhankelijke experimenten van dezelfde ouderlijke bacteriën en algen culturen. De vaste kleine standaardafwijking bevestigt de robuustheid en reproduceerbaarheid van de microtiterplaat formaat voor algen bioassays omdat hiermee onafhankelijke experimenten worden gebruikt als replicaten en elimineert de noodzaak om de experimentele eenheid subgroep over de duur van het experiment.
Figuur 2. Representatieve WATER-PAM fluorometrie grafieken van 140 d groeicurve van axenic Emiliania huxleyi (CCMP3266). (A) metingen van de initiële algen fluorescentie (F 0), (B) algen maximale fluorescentie (F m) en ( C) mogelijke quantum yield (F v / F m) voor E. huxleyi worden weergegeven als zwarte cirkels. De best passende lijn voor F 0 en F m was normaal log 3 parameter (SigmaPlot) R2 = 0,94, 0,95 respectievelijk. Potentiële quantum yield (F v / F m) is een dimensieloze uitdrukking van fotosynthetische gezondheid, die wordt berekend als (F m - F 0) / F m. De best passende lijn voor de F v / F m curve was een 3 factor veelterm R2 = 0,6. Fout balken geven de standaardfout tussen triplicaatputjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger WATER-PAM fluorometrie grafieken van een 10 d co-kweek-experiment van Emiliania huxleyi (CCMP3266) met Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) De eerste algen fluorescentie (F 0), (B) maximale algen fluorescentie (F m) en (C) de potentiële quantum yield (F v / F m) in een grafiek weergegeven voor control algen (open cirkels) en algen samen gekweekt met een bacterie (zwarte cirkels). Potentiële quantum yield (F v / F m) is een dimensieloze uitdrukking van fotosynthetische gezondheid, die wordt berekend als (F m - F 0) / F m. Fout balken geven de standaardfout tussen drievoud putten. Een sterretje (*) duidt dagen waarop de parameters voor de controle en co-cultuur behandelingen significant verschilden. Verschillen tussen behandelingen voor alle dagen waren niet significant behalve 10 d in alle drie parameters (10 d - F 0: t-test, df = 2.5, t-ratio = -15, p = 0,0017 * f m: t- test, df = 2,1, t-ratio = -16,15, p = 0,003 *; F v / F m:. t-test, df = -18,68, t-ratio = 2,0, p = 0,0028 *) Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algengroei in een geminiaturiseerde format.
De miniaturisatie algenculturen een 1 ml cultuurvolume in een microtiterplaat maakt de replicatie in een experiment te verhogen. Het is van belang de alg gezond gedurende een experiment; voer een groeicurve (figuur 2) met de microtiterplaat formaat naar verschillende media algen beoordelen, te zorgen voor de voedingsbehoeften van de alg wordt voldaan. Bovendien kan het belangrijk zijn om de dagelijkse cyclus (licht en donker periodes) en temperatuur te optimaliseren. Juiste optimalisatie voor een bepaalde algen kan zorgen voor behoud van gezonde algenculturen op piekfluorescentie 26 d en voor het detecteren van potentiële kwantumopbrengst na 140 dagen (figuur 2).
Minimaliseren van verdampende effecten.
Het is belangrijk dat de verdampende werking van op vloeistof gebaseerde assays als "randeffect" minimaliseren algemeen oBServed waar grotere verdamping putjes aan de rand van de microtiterplaat dan in putjes zich naar het midden van de plaat. Hoewel verdamping is waargenomen bij de rand van de platen, is de verdampingssnelheid beperkt de experimentele duur gezond algenculturen, met een piek fluorescentie bij 26 d heeft in deze vorm gehandhaafd (figuur 2). Om eventuele "randeffect minimaliseren, 1x PBS (pH 7,4) of andere steriele oplossing wordt in porties in putjes vier randen (kolommen A en H, rijen 1 en 6, figuur 1).
Verlichting binnen een dagactieve incubator.
Microtiterplaten dienen allemaal dezelfde oriëntatie in de incubator dagelijkse. Bijvoorbeeld, de lengte oriëntatie van microtiterplaten in een incubator betekent dat de platen langs de korte as geplaatst. Bij deze oriëntatie wordt gebruikt, kan algenculturen langs de lange as BG (figuur 1) experiencEA lichte licht en temperatuurgradiënt te wijten aan de variatie in afstand van de lichtbron (de gloeilamp is een bron van licht en warmte). Dit is waargenomen temperatuur assays beïnvloeden algen aan de uiteinden van hun temperatuurbereik. Bijgevolg is dit onwaarschijnlijk dat de meeste algen gekweekt bij hun optimale temperatuur. Om de impact van dit licht en temperatuurgradiënt minimaliseren zorgen dat grotere flessen zelf geen schaduw, plaats platen op een consistente afstand van de lichten, gebruiken schaduwdoek om indien nodig het licht te reduceren, en controleer de lichtintensiteit over de lange as van de incubator dagactieve om ervoor te zorgen dat het reizen gelijkmatig.
Donkere aanpassing van algen monsters voor WATER-PAM fluorometrie.
Alvorens tot WATER-PAM metingen is het belangrijk donkere passen de algen monsters zodat de PSII reactiecentra zijn volledig open en het licht geïnduceerde transthylakoidal pH gradiënt volledig verdwenen, thons geven waar F o en F m waarden van waaruit F v / F m berekenen. Bemonstering de alg van de test voor WATER-PAM metingen in het midden van de donkere fase van de dagelijkse cyclus (dwz een 16: 8 uur licht: donker cyclus, zou een 2 uur bemonstering worden uitgevoerd bij T (donker) = 3-5 uur) maakt aanpassing aan het donker korter (3-5 min) vergeleken met het midden van de lichtcyclus (T (licht) = 7-9 uur) als het donker aanpassing langere (> 20 min) 17. De alg's donkere adaptie tijd zal ook variëren afhankelijk van de algensoorten, groeiomstandigheden en de lichtomstandigheden van zijn natuurlijke habitat bereik.
Gevoeligheid van WATER-PAM fluorometrie lezingen.
Het water-PAM is ontworpen om een ultragevoelige fluorometer opsporen van F, F 0 en F m van lage chlorofyl monsters zoals oceaan oppervlaktewater 16 zijn. Bijgevolg is bij uitstek geschikt om een miniatutoriseerde bioassay waar monsters kunnen worden verdund. Door deze gevoeligheid is het belangrijk te begrijpen dat het water-PAM machine een bovengrens van fluorescentie metingen (bijvoorbeeld F, F 0 en / of F m) indien het monster niet voldoende verdund (figuur 4). Binnen de WinControl software de maximale waarden zijn eerste merkbaar na het indrukken van F 0 en het lezen van de F 0 (direct na het donker adaptatie). Derhalve F en F m zijn bij de maximale waarde 4,056 (figuur 4, no. 2286). De maximale waarden van F en F m afhankelijk van het type algen middel dat wordt gebruikt om het water-PAM kalibreren, maar monsters boven de detectielimiet gemakkelijk worden geïdentificeerd omdat herhaalde metingen bij dezelfde maximale waarde plaatsvinden totdat het monster voldoende verdund . Na een 1: 1 verdunning in algen media, minder geconcentreerde monster donker aangepaste telkens F 0 meting herhaald. De F-waarde van eenppears correct te meten, maar het F m nog lezen maximumwaarde 4,056 (figuur 4, no. 2287). Dit monster werd opnieuw verdund 1: (. Figuur 4, no 2288) 1 in algen media weer en donker aangepast gedurende nog 3 minuten alvorens een F 0 lezen en geldig aflezingen werden verkregen, zodat de volgende meting (F) genomen en de F v / F m berekening is geldig. 1 verhouding met medium dat moet worden verwerkt in de berekening van F en F m 0: In dit voorbeeld werd het monster tweemaal in 1 verdund. Het is belangrijk dat Fv / Fm mee als directe functie van F 0 en F m, onjuist berekend indien de monsters te concentreren ondanks een dimensieloze expressie van fotosynthetische gezondheid.
Figuur 4. WinControl weergave van verschillende WATER-PAM fluorometrie lezingen van een algenmonster zijn opeenvolgend verdund tot de juiste verdunning te bereiken. Dit cijfer geeft algen fluorescentie metingen bereiken van de bovengrens van de WATER-PAM machine (rode doos) en die waar een verdunning van het monster is bereikt (groene doos). Daarnaast is deze figuur toont enkele van de andere variabelen die deze methode berekent, maar deze worden hier niet in detail besproken (zie reviews 13,16,20-22). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Bacteriële besmetting.
In alle experimenten algen, algen controles noodzakelijk als een basislijn van algen gezondheid, zodat het noodzakelijk dat blijft vrij van bacteriële besmetting gedurende het experiment. Bacteriële verontreiniging treedt gemakkelijk als er geenselectie (zoals antibiotica) en fotosynthese produceert voortdurend nieuwe organische koolstof voor de groei van bacteriën. De twee belangrijkste manieren om contaminatie te voorkomen is om de steriliteit van alle oplossingen (bijvoorbeeld algen media, 1x PBS, pH 7,4) en apparatuur bij T = 0 d van het experiment en aseptische techniek gehandhaafd wordt bij de microtiterplaten waarborgen. Het experiment moeten worden gecontroleerd op besmetting op elk tijdstip door platen een 20 ul monster van alle algen controle putten. Bij verontreiniging wordt waargenomen vanuit de algen controleputjes dan die WATER-PAM fluorometrie metingen opgemerkt en uitgesloten van gegevensanalyse. Als er een oplossing wordt gebruikt voor het opzetten van het experiment zorgt ervoor dat de gehele experiment mogelijk besmet zijn, dan is het experiment en alle verontreinigde reagentia weggooien en opnieuw beginnen. De bacteriële controles en bacteriële-algen co-culturen kunnen ook besmet raken en agarplaten gebruikt voor bacteriële kve tellingen moeten worden gecontroleerd op alternatieve kolonie Morpholgieën. Well-to-well kruisbesmetting kan optreden bij het verwijderen van de microtiterplaat deksel, maar wordt gemakkelijk vermeden door niet kantelen of schudden van de platen en met gebruikmaking van aseptische techniek in een laminaire stroming kap of bij open vuur.
Toekomstige toepassingen.
Dit kleine volume bioassay biedt een snelle screeningsmethode voor microalgen door het combineren van een microtiterplaat formaat met WATER-PAM fluorometrie. Voorbeelden van toekomstige toepassingen zijn verschillende, en kan onder meer Imaging PAM fluorometrie, die inzicht geven in cel-cel variant van PSII gezondheid biedt binnen een populatie als hij presteert PAM fluorometrie op individuele cellen 24. De bioassay kan ook worden gecombineerd met microscopie en flowcytometrie zoals eerder besproken. Een andere combinatie met de potentie om verder inzicht te verschaffen is cel kleuring voor flowcytometrie en microscopie aan morfologische variatie toe te lichten binnen subpopulaties van de algen cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48-well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P.
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J.
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N.
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
