Summary
我们已经开发了一种在体外展开海马其中保留神经元的CA1-CA3阵列。结合穿透微电极阵列,神经活性可以在纵向和横向取向来监测。这种方法提供优于海马切片制剂作为整个海马的传播可以同时记录。
Abstract
这个协议描述了用于制备新的体外平坦海马制备结合了微加工阵列映射神经活动在海马的方法。横向海马切片制备是最常见的组织制剂来研究海马电。纵向海马切片也被开发,以调查海马纵向连接。完整的小鼠海马也可以在体外保持,因为它的厚度允许足够的氧扩散。但是,这三个制剂不提供直接访问神经传播,因为一些组织是丢失或折叠。展开的完整海马提供横向和在一个平面配置为直接访问组织分析在体外海马信号传播的完全程度纵向连接。为了有效地监控从T的神经活动他细胞层,定制穿透微电极阵列(PMEA),制作并施加到展开的海马。为200微米的高度64的电极的PMEA可以记录的神经活动的小鼠海马深处。未折叠海马制备及PMEA的独特组合提供了一种新的体外工具来研究的速度和神经活动的传播方向在海马的二维CA1-CA3区具有高信噪比。
Introduction
理解的神经传导的神经信号或传播是用于判定在两个正常功能和病理条件神经通信在大脑1-3的机制是至关重要的。海马是最广泛研究的结构在大脑中,因为它起着基本作用在几个脑功能,如存储器和空间跟踪并参与几个病理变化,可显着地影响行为,以及1,6-之一。虽然,海马表现出复杂的组织,其结构的不同元件可以容易地确定和切片制备4-6访问。在海马的横向方向,神经活动已知通过三-突触通路组成该齿状回(DG),CA3,CA1 andsubiculum 4,5-传播。据认为,突触传递和轴突传导中发挥重要作用的通信对于在这横电路4,6。然而,神经信号的传播发生在横向和纵向方向上4,6。这意味着,海马,不能充分利用切片制剂限制观察到传播4的特定方向的影响。纵向切片的开发是为了调查沿着纵向轴线5的轴索途径。研究人员已经观察到的行为的特定r和θ振荡主要沿着横向和纵向轴线分别为6。这些行为已分别研究,但同时访问两个方向关键是要了解这些行为。甚至与完整海马制备的发展,它是很难监测在整个组织中传播,由于海马4的折叠结构。展开海马提供访问打包元在一个平面二维细胞层7,8的一种形式。
通过展开齿状回(DG)( 图1),海马采用扁平形状具有矩形结构,其中横向和纵向的连接保持不变与设置在一个含两CA3和CA1二维片锥体细胞层,留下一块平坦的,可用于研究神经传播神经组织( 图2)8。神经活动然后可以与个别玻璃吸管,微电极阵列,刺激电极,以及电压敏感染料(VSD)3,7,8监测。另外,从转基因小鼠的基因编码的电压指示器可用于跟踪传播图9。
展开的海马网络的扁平结构非常适合于光学记录方法,而且对于一个微电极阵列。 M市售阵列OST的制作扁平或低调的电极,可在组织切片和培养的神经元10-12记录的神经活动。然而,当信号从一个完整的组织中获得,因为神经元的胞体均位于更深的组织中的信号 - 噪声比(SNR)减小。具有高纵横比的微电极的电极阵列,需要改善的信噪比。
为此,一个穿透微电极阵列(PMEA)已经制定在我们的实验室,并通过插入64尖峰的直径为20微米和200微米的高度成折叠海马7,13-提供直接探测到组织的能力。此微电极阵列具有更高的SNR相比,电压敏感性染料成像和信噪比实验7,13期间保持稳定。展开的海马制备及PMEA的结合提供了一个投资新方式IGATE过的二维平面上的神经传播。使用这种技术的实验已经产生了关于神经信号传播在海马机制显著结果,由此神经活性可以独立的突触或突触电动7传播。
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Protocol
注:动物实验方案进行了审查,并在大学批准的机构动物护理和使用委员会。 CD1小鼠任一性别的P10的年龄到P20被用于本研究。
1.解决方案手术和实验记录
- 制备含有(mM计)正常的人工脑脊液(ACSF)缓冲液:氯化钠124,氯化钾3.75,KH 2 PO 4 1.25,MgSO 4干燥2, 碳酸氢钠 26,葡萄糖10,和氯化钙 2。在实验开始时使用该正常脑脊液解剖后组织的恢复,以及用于洗涤系统。
- 备是海马解剖过程中使用,并含有蔗糖学联(mM计):蔗糖220,氯化钾2.95,将NaH 2 PO 4 1.3,MgSO 4干燥2, 碳酸氢钠 26,葡萄糖10,和氯化钙 2。为了诱导癫痫样活动的完整海马组织制剂中,添加4-氨基吡啶(4-AP),以正常的脑脊液在为100μM的浓度。
2.手术过程的完整海马准备
- 滴异氟烷(1毫升)到腔室,在一个干燥器玻璃瓶(1号中的具体材料和设备)的底部,并使用常规的纸巾覆盖底部阶段的表面上,从而对动物没有得到与接触的液体。然后,将CD1鼠标放进瓶子里,并盖上盖子。保持在封闭罐的动物为约1分钟至2分钟。当呼吸频率为约1每秒,从罐取出鼠标。
- 放置在鼠标上的手术阶段和斩首与合适的剪刀。立即斩首后,将头部放入冰冷(3-4℃),氧化蔗糖脑脊液约30秒。
- 用细剪刀(第5号中的具体材料和设备),以去除皮肤上的头骨顶部和切割沿头部的中间线颅骨以及在接近速度两端RAL叶。使用钳子(6号中具体的材料和设备)剥离朝向头部的每一侧的切口颅骨以暴露脑。
- 插入一个微型实验室压舌板(在特定的材料和设备第8号)到大脑和颅骨的顶叶之间的差距从头骨底部小心剥离脑,然后将其放到准备好的冰冷(3 -4°C)手术舞台铺上湿滤纸(第2号的具体材料和设备)。除去用冰 - 冷却的刀片小脑和通过切割脑的中线分开的两个半球。然后,将两个分离的半球入填充有冰冷蔗糖脑脊液通入95%O 2/5%CO 2的烧杯中。
- 取一半的半球和地点上的冰冷滤纸阶段。将普通纸巾或滤纸周围脑吸多余的解决方案。使用两个火抛光的玻璃吸管工具(第10号中的材料和设备)与皮质从大脑的中心部分的其余部分分离。
- 之后,海马从皮层内部暴露,换上了冰冷的阶段,将两三滴对组织冰冷的蔗糖学联然后取出海马有多余的解决方案。切断与皮层连接在海马的两端。然后,解剖海马出大脑与火抛光玻璃工具并取出大脑的剩余部分。
- 分开整个海马与alveus面朝上,海马沟朝下。迅速下降两个或三个滴冰冷蔗糖脑脊液在组织再次并取出组织周围使用了一块纸巾的额外溶液。使用火抛光的玻璃的工具改过整个海马,露出沟( 图1B,C)。
- 在一个正常的光学显微镜,插入一个定制的玻璃针(11号在特殊材料 -ALS和设备)插入沟的一端,并切断光纤连接,从齿状回(DG)到下托或海马CA1领域,沿沟的方向( 图1C)。适用的冰冷刀片如果需要修剪海马的间隔和时间结束。插入定制金属线环(第12号中的具体材料和设备)插入切沟,并从组织,同时保持了海马的下脚/ CA1端通过一火抛光的玻璃刀具拉过对DG远( 图1D) 。
- 按照上述的展开过程中,添加另外的两个或三滴的冰冷蔗糖脑脊液的到组织并移除组织周围的多余溶液。然后,修剪展开海马用冰冷刀片的边缘( 图1E)和在制备用刮刀放入填充有正常脑脊液和通入95%O 2/5%的CO 2在室温下将回收室(约25℃)。离开展开海马组织,以将其放置到录音室之前收回约1小时。
- 采取其他脑半球并用它要经过的步骤,从2.5到2.9。通常,需要约1至2分钟,以完成整个过程展开单个海马和连续地滴冰冷蔗糖脑脊液,以保持氧化和水合的组织。
3.实验系统设置
- 胶上的引脚栅格阵列(PGA)封装的定制制造的PMEA,并使用微引线接合到从一个单一的微小电极连接每个垫的包( 图3B)的销的垫。然后,将包插入一个特制的电路板13的插座中。
- 每个单独的微电极与带通截止频率为1赫兹的100上的定制的电路板13的增益连接到它的过滤器,以4千赫和放大器。由A / D转换数字化从电路板输出的模拟耳听系统,并获取和存储数据的计算机上。
- 胶与入口和出口管,用于将溶液的流动( 图4A)的阵列周围一个特制的塑料记录室中。使用至少两个瓶子,以保持不同的解决方案,在系统中,并加入并通过三阀控制瓶子的输出管道。连接三阀的一个管件系统的输出与静脉滴注室被引导溶液到记录室中。
- 三阀和录音室的入口之间,加电加热器来加热该溶液到受控温度(35℃)之前的溶液被引导到记录室中。附着在记录室的出口到一个真空管收集溶液成真空管连接烧瓶中。不回收任何实验在这项研究中的任何解决方案。
4.放置展开海马到PMEA录制的神经活动
5.删除组织从PMEA的实验后
- 控制的组织锚定由一个显微和逐步解除从记录室中的组织。关闭入口和出口停止录音室中的流动。录音室一应具全用溶液或加几滴解决方案,填补了腔,如果录音室没有满。
- 用小画笔解除所述组织的各角。如果组织未漂浮在溶液中,然后使用真空管来与组织仍然坐在阵列上仔细干燥室中。然后小心地打开进,逐步填充室并关闭入口停止流动时的录音室已满。应用小漆刷再次抬起组织的每个角落。
- 重复步骤5.2,直到组织被从阵列中分离出来并漂浮在溶液中。如果组织被漂浮在溶液中,然后用真空管吸组织消失。打开吨他流在入口和打开出口处的真空。用蒸馏水清洗系统和干出来。
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Representative Results
在这里图中所示的数据被记录在未折叠海马制剂与4-AP(100μM)脑脊液录音室中的组织的孵育期间在RT加入(25℃)。正常情况下活动开始不到5分钟,但在从旧有的动物海马组织中,可能需要更长的时间。与PMEA观察到的4-AP诱发的神经元放电是相同的如先前报道14,15。由于电极有200μm的高度,电极尖端刚好位于细胞层( 图3C),因为电池层通常为250至300微米的海马alveus以上( 图2),记录(57选自以下在样本实验)从不同渠道64有大部分是积极的偏转。然而,一些这些积极的录音可以显示小负挠度以及( 图5B),如果记录电极提示是足够接近细胞层。如果电极尖端在电池层的水平位于右侧时,记录将具有非常尖锐的负尖峰与它正移位或者仅仅负尖峰( 图5C)16。在此处所示的数据样本,5个信道的57的记录有负尖峰。从所有的64个信道获取的数据后,从个人正常化的方法( 图6B)被施加到映射神经传播上沿记录7的时间轴的2-D平面。与PMEA及展开海马的组合,神经传播被映射并观察到大多发起在CA3的一侧,并且在对角波前纵向移动,穿越海马的整个区域( 图6)。
图1.手术过程的展开海马 (A)中的一个在两个海马的从鼠脑的颞叶解剖。(B)的间隔和沿纵轴颞端接。(C)中海马翻转用火抛光的玻璃吸管,以暴露沟。海马的两端被修整和玻璃针用于切割DG和CA1区或下脚沿着纵向轴线之间的连接。(D)中的海马是由一个特制的金属丝环的展开。(E)的未折叠海马下托和DG修剪。(F)的最终组织编制的展开海马。该位置示出了海马的取向时,它被放置在一个实验的阵列上。有关展开海马解剖更多详细信息,请参见实验方法在以前出版的手稿7。g1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.组织学截面展开海马。水晶紫染色显示海马CA1-CA3锥体细胞层的展开海马内的位置250至300微米的alveus以上的水平,从而定位所述微电极右侧的细胞层下(参照图3C)。为了获得沾上了结晶紫的路段,组织是后固定后,海马陆续展开。展开海马放置在PFA 4%O / N。然后,将组织转移,并保持在蔗糖溶液(30%)48小时,并随后通过卡扣冻结在含骑车异戊烷(2-甲基丁烷)冷却至-35℃,在干冰。冰冻切片然后在用低温恒温器切断20微米厚的部分在横向平面(如在图2)揭示锥体细胞层的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图上的阿德福韦3.未折叠海马。 (A)的一个新的PMEA与位于各金金属迹线的末端的微电极的顶视图。在右侧的刀片显示在电子显微镜下的单个微电极具有200μm的高度和直径为20微米的7,13-的。(B)中的微电极阵列与周围的微电极上的塑料记录室粘在一个PGA组件的玻璃基板。右边的插入件示出展开的海马放置在微电极改编AY在中间。(℃)在左侧,光学相干断层扫描(OCT)成像显示了展开的组织定位在阵列的顶部在不同的实验。在右边,从左边的OCT成像获得两纵切片的图像显示了微电极头(白点指向的箭头)伸入右细胞体层以下的区域。 请点击此处查看该图的放大版本。 。
图4.实验装置。 (A)塑料盖盖子用螺丝被放置在保护它免受可能的水损坏电路。该记录室具有入口和出口管携带溶液流动。一个定制的组织锚粘有尼龙纤维网是用来固定悌在实验过程中的UE。(B)的图片取自PMEA的玻璃基板表示组织锚定的实验中保持的试样切片的底部。的弯曲线是从网格按压在组织上的顶部的尼龙纤维。该圆点是微电极的基础。箭头指向了多次实验后损坏电极。 请点击此处查看该图的放大版本。
从海马展开记录由PMEA图5.原始数据。左图 :4-AP诱发的来自单个微电极记录癫痫样活动右面板 :标记在左侧的时间窗的信号的放大版本。 (A)的自发活动的一个例子的10秒节通过100μM的4-AP脑脊液duced从位于靠近胞体与信噪比另一个微电极获得对位于基于所述信号与34.9分贝的SNR极性基底树突区域微电极中的一个。(B)的原始数据的记录的27.2分贝。(℃)从位于所述体层内的电极获得的实施例。在本实施例中,信噪比为18.53分贝。(D)中 ,从一个弯曲电极仍在进行,但不穿透进入组织得到记录。比起那些完好的电极(1.5分贝在本例中)的弯曲电极具有显著较低的SNR。从微电极记录(E)的基线噪声。基线通常有一个峰值,从150到200μV峰值和单电极的阻抗大约是1到2MΩ。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.转换神经记录数据的进入的2-D传播地图。 (A)170毫秒的时间窗口截断每个通道的单一神经扣球绘制在PMEA的照片。原始数据是通过一个低通滤波器,在100赫兹过滤。从破碎的电极的信号被内插与它周围的录音。在本实施例中,所有的尖峰都是正的。(B)中从红色像素(A)中的单一神经尖峰归一化到用单个归一的自定义开发的方法中,颜色条(请参考以前的出版物更多细节关于正常化7)。(C)的由各个归一化产生的彩色图显示,传播跨越折叠海马的整个区域移动时,在不同的时间点。www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
展开的海马制备,其中海马的纵轴和横轴被保存在具有穿透微电极阵列结合的发展,提供了一个有力的工具,调查解剖连接或神经传播在海马7。此展开过程也适用于在成年小鼠研究海马。与此制剂最近的研究表明,4-AP诱发的癫痫样活动可与一个对角波前越过展开的海马的整个区域( 图6)7,8-传播。这些研究表明,完整的未折叠海马提供了超过任一横向或纵向切片显著优点当在平坦的海马神经网络的神经传播可以调查( 图6)。
穿透微电极提供显著优势在现有英里croelectrode阵列(MEA),其包括定位在一个平面上11,12,17多个联系人。 MEA具有平坦表面的电极是难以与展开海马使用,因为该细胞层位于约250至300微米的远离表面( 图2)。此处所描述的PMEA的目的是要解决这个问题,与适合于学习的神经传播为200微米的高度,以将组织7,13-内达到深64贯通电极。此外,PMEA也适用于任何平面组织制剂,如皮质切片,海马横切片等
使用这种PMEA的另一优点是改进的信噪比。此PMEA的原型研究显示记录本PMEA神经信号的SNR比具有19.4±3分贝,这是显著更高和更稳定的相比该VSD记录的平均值,因为先前的研究表明,毒性和VSD的光漂白明显受损,记录数据8的能力。具有改进的实验方案通过使用组织锚定在该研究中,从PMEA增加记录的SNR的范围从约20至30分贝( 图5),其具有更高的SNR相比,那些具有扁平电极阵列从10至15分贝11,18的值。展开海马的能力是必要的,以便获得一个层的神经元(CA1-CA3),可以由一台记录阵列被询问的。
此外,由于硅阵列构建在透明衬底上,电压敏感性染料成像技术可以被集成在PMEA系统来研究神经活动的传播在海马8。转基因小鼠用荧光电压敏感的指标,也可以用于研究在生理条件下的信号的诱发pharmacologi起源和传播,以及改变CAL剂或从各种动物模型9遗传修饰的组织。
还有,为了保证高质量的记录几个关键步骤。首先,以确保组织的生存力,在外科手术必须进行尽可能快。通常,需要约1至2分钟,以通过从2.1的所有步骤)至2.10)。对一些样本动物展开程序的做法是强烈建议前,实际的实验手术进行。其次,流率需要被保持恒定,以避免在记录室中的灌注流体的水平的任何波动。此外,该组织应锚定,以避免组织相对于所述阵列的移动。
虽然这里描述的PMEA可以提供有用的信号在监测神经传播在展开海马,也存在一些缺点和局限性,以该记录方法。
首先时,微电极可以由于机械力置于其上( 图5D,E)的断裂。在组织放置和移除的过程中,小画笔和阵列之间的偶然接触可能导致的微小电极,以弯曲或断裂。当组织锚被降低下来的显微,沿腔室的底部的组织的水平移动可以创建可能导致弯曲或电极的破坏的剪切力。在未来的设计中,微电极应重塑带着几分厚基础,使他们更坚强。在此PMEA的当前版本中,记录电极具有窄碱相比,其直径13,从而削弱了的电极( 图3A)。
清洁过程也应提高,以充分除去残留的组织和纤维,可以附加到该阵列。每次实验结束后,小片组织可以保持连接到微电极和左电极上此残留组织,必须清除。如果这些残留的组织不被除去,电极的阻抗和录音的SNR可能受到影响。该系统用蒸馏水冲洗被建议作为在协议部分的一部分5表示。用户也应冲洗系统与一些弱酸性解决方案,它可以溶解组织,而不破坏系统
此协议的另一个缺点是,在展开过程中,在该展开的海马的穿通通路被切断,从而防止可能的神经信号传播距离DG至海马的其它层的调查。
总之,我们在这里已经描述了一种新颖的方法通过组合高纵横比微电极阵列与展开海马Tissu酒店调查海马内的神经活动的传播即该方法确实导致更好地了解如何神经元的活动可以同时在纵向和横向的方向传播。这种技术还可以应用到皮质组织置于一个类似的方式在阵列的顶部。此外,光记录技术相结合与此制剂是可能的,因为该阵列是透明的,也有可能导致一些有关的神经组织的信号传播的重要发现。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
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