Summary
We hebben een in vitro ongevouwen hippocampus die CA1-CA3 reeks van neuronen behoudt ontwikkeld. Gecombineerd met de penetrerende micro elektrode-array, kunnen neurale activiteit worden gevolgd in zowel de longitudinale als transversale richtingen. Deze werkwijze verschaft voordelen boven hippocampus slice preparaat als voortplanting in de gehele hippocampus gelijktijdig kunnen worden opgenomen.
Abstract
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden van een nieuw in vitro flat hippocampus preparaat in combinatie met een micro-bewerkte array neurale activiteit in kaart in de hippocampus. De dwarse hippocampus slice voorbereiding is de meest voorkomende voorbereiding weefsel om hippocampus elektrofysiologie studeren. Een longitudinale hippocampus plak werd ontwikkeld om longitudinale verbindingen in de hippocampus onderzoeken. De intacte muis hippocampus kan ook worden gehandhaafd in vitro vanwege zijn dikte maakt voldoende zuurstof diffusie. Echter, deze drie bereidingen geen directe toegang tot neurale voortplanting omdat sommige van het weefsel ontbreekt of gevouwen. Ongevouwen intacte hippocampus levert zowel transversale als longitudinale verbindingen in een vlakke configuratie voor directe toegang tot het weefsel analyseren de volle omvang van signaalvoortplanting in de hippocampus in vitro. Om effectief toezicht op de neurale activiteit van tHij cellaag, een maat penetrerende micro-elektrode array (PMEA) werd vervaardigd en toegepast op de ongevouwen hippocampus. De PMEA met 64 elektroden van 200 micrometer in de hoogte kon neurale activiteit diep binnenin de muis hippocampus opnemen. De unieke combinatie van een ongevouwen hippocampus opstellen en PMEA verschaft een nieuwe in vitro hulpmiddel om de snelheid en de voortplantingsrichting van de neurale activiteit in de tweedimensionale CA1-CA3 gebieden van de hippocampus studie met een hoge signaal-ruisverhouding.
Introduction
Inzicht in de neurale geleiding of voortplanting van neurale signalen is cruciaal voor het bepalen van het mechanisme van neuronale communicatie in zowel de normale functie en pathologie hersenen 1-3. De hippocampus is een van de meest uitgebreid bestudeerde structuren in de hersenen omdat speelt fundamentele rol in diverse hersenfuncties zoals geheugen en ruimtelijk volgen en is betrokken bij verscheidene pathologische veranderingen dramatisch effect functie en 1,6. Hoewel, de hippocampus vertoont een complexe organisatie, kunnen de verschillende elementen van de structuur gemakkelijk worden geïdentificeerd en toegankelijk in de slice voorbereiding 4-6. In de dwarsrichting van de hippocampus, is neurale activiteit bekend voortplanten door de tri-synaptische traject dat de gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 omvatten. Er wordt aangenomen dat de synaptische transmissie en axonale geleiding spelen een belangrijke rol voor de plaatselijke communicatiein deze dwarse circuit 4,6. Echter, vermeerdering van neurale signaal vindt plaats in zowel dwars- als lengterichting 4,6. Dit betekent dat de hippocampus niet volledig kan worden onderzocht door gebruik slice preparaten die de waarneming van een bepaalde voortplantingsrichting 4 beperken. De longitudinale plak werd ontwikkeld om de axonale paden langs de langsas 5 onderzoeken. Onderzoekers hebben het gedrag van specifieke gamma en theta-oscillaties waargenomen voornamelijk langs de transversale en longitudinale assen respectievelijk 6. Deze gedragingen zijn afzonderlijk onderzocht, maar toch gelijktijdige toegang tot beide richtingen is cruciaal om dit gedrag te begrijpen. Zelfs met de ontwikkeling van de intacte hippocampus preparaat, is het moeilijk om de propagatie in het gehele weefsel toezicht door de gevouwen structuur van de hippocampus 4. Ongevouwen hippocampus geeft toegang tot de verpakte neuronenin de vorm van een platte tweedimensionale cellaag 7,8.
Door het uitvouwen van de dentate gyrus (DG) (figuur 1), de hippocampus neemt een afgeplatte vorm met een rechthoekige configuratie waarin zowel transversale als longitudinale verbindingen intact met de piramidale cellaag gerangschikt in een tweedimensionale plaat die zowel CA3 en CA1 blijven, waardoor een plat stuk neuraal weefsel dat kan worden gebruikt om neurale vermeerdering onderzoeken (figuur 2) 8. Neurale activiteit kan vervolgens worden gevolgd met afzonderlijke glazen pipetten, micro-elektrode arrays, prikkelelektroden, evenals spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD) 3,7,8. Bovendien kunnen genetisch gecodeerde voltageindicator uit transgene muizen worden gebruikt voor de vermeerdering patroon 9 te volgen.
De vlakke configuratie van het ongevouwen hippocampus netwerk geschikt voor optische registratie werkwijze, maar ook in een micro-elektrode array. Most van de commercieel beschikbare arrays worden gefabriceerd met een vlakke of low profile elektroden en kan neurale activiteit opnemen in zowel weefsel plakjes en gekweekte neuronen 10-12. De signaal-ruisverhouding (SNR) afneemt wanneer de signalen worden verkregen van een intact weefsel, aangezien de soma van de neuronen worden dieper in het weefsel bevindt. Micro-elektrode elektrode arrays met een hoge aspect ratio's zijn nodig om de SNR te verbeteren.
Daartoe heeft een indringende micro-elektrode array (PMEA) ontwikkeld in ons laboratorium, en biedt de mogelijkheid om direct sonde in het weefsel door het invoegen van 64 spikes met een diameter van 20 urn en hoogte van 200 urn in de ongevouwen hippocampus 7,13 . Deze micro-elektrode array hogere SNR vergeleken met de spanningsgevoelige kleurstof beeldvorming en de SNR blijft gedurende een experiment 7,13. De combinatie van het ongevouwen hippocampus opstellen en PMEA verschaft een nieuwe manier om te investereniGate de neurale propagatie over een tweedimensionaal vlak. Experimenten met deze techniek hebben al belangrijke resultaten over de mechanismen van neurale signaalvoortplanting in de hippocampus, waarbij neurale activiteit onafhankelijk van synaptische of elektrische synapsen 7 kunnen voortplanten opgeleverd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Animal experimentele protocollen werden beoordeeld en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de universiteit goedgekeurd. CD1-muizen van beide geslachten op de leeftijd van P10 tot P20 worden in deze studie.
1. Oplossingen voor chirurgie en experimentele Opname
- Bereid normale kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) buffer bevattende (mM): NaCl 124, KCl 3,75 KH 2 PO4 1,25 MgSO4 2, NaHCO3 26 Dextrose 10 en CaCl2 2. Met deze normaal aCSF voor weefselherstel na sectie en voor wassysteem aan het begin van het experiment.
- Bereid sucrose aCSF die wordt gebruikt tijdens de hippocampus dissectie en bevat (mM): Sucrose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO4 1.3, MgSO4 2, NaHCO3 26 Dextrose 10 en CaCl2 2. Om epileptische activiteit in de intacte hippocampus weefselpreparaat induceren wordt 4-aminopyridine (4-AP) naar normaal aCSF opde concentratie van 100 uM.
2. Chirurgische Procedure voor de Intact Hippocampus Voorbereiding
- Drop isofluraan (1 ml) in de kamer op de bodem van een exsiccator glazen pot (No.1 in bepaalde materialen en apparatuur) en gebruik een gewone papieren handdoek om het oppervlak van de onderste fase te dekken, zodat het dier niet in contact met krijgt de vloeistof. Vervolgens plaatst u de CD1 muis in de pot en sluit het deksel. Houd het dier in de gesloten pot gedurende ongeveer 1 min tot 2 min. Wanneer adem frequentie is ongeveer één per seconde, verwijdert u de muis uit de pot.
- Plaats de muis op de operatie podium en onthoofden met een geschikte schaar. Onmiddellijk na onthoofding, plaats het hoofd in het ijs-koude (3-4 ° C), geoxygeneerde sucrose aCSF gedurende 30 sec.
- Gebruik fijne schaar (No.5 in bepaalde materialen en apparatuur) om de huid op de top van de schedel te verwijderen en de schedel langs de middelste lijn van het hoofd, evenals snijden aan twee einden in de buurt van het temporal kwab. Gebruik een tang (nr 6 in bepaalde materialen en apparatuur) om de cut schedel naar elke kant van het hoofd schil om de hersenen bloot te leggen.
- Plaats een micro lab spatel (nr 8 in bepaalde materialen en apparatuur) in de spleet tussen de pariëtale kwabben van de hersenen en de schedel zorgvuldig schil de hersenen van de onderkant van de schedel en vervolgens laten vallen op een voorbereide ijskoude (3 -4 ° C) chirurgische podium bedekt met natte papieren filter (No.2 in bepaalde materialen en apparatuur). Verwijder het cerebellum met een ijs-gekoelde blad en scheiden de twee hersenhelften hierdoor de middellijn van de hersenen. Plaats vervolgens de twee gescheiden helften in een beker gevuld met ijskoude sucrose aCSF geborreld met 95% O2 / 5% CO2.
- Neem de helft van de halve bol en op de ijskoude filtreerpapier fase. Plaats gewone papieren handdoeken of filtreerpapier rond de hersenen om de extra oplossing zuigen. Gebruik twee-brand gepolijst glas pipet gereedschappen (nr 10 in Materialen enEquipment) de cortex scheiden van de rest van het centrale deel van de hersenen.
- Na de hippocampus wordt blootgesteld van de binnenkant van de cortex en op de ijskoude podium, plaatst u twee of drie druppels ijskoude sucrose aCSF op het weefsel en verwijder extra oplossing rond de hippocampus. Snijd de verbindingen met de cortex aan beide uiteinden van de hippocampus. Vervolgens ontleden de hippocampus van de hersenen met vuur gepolijst glas gereedschappen en verwijder het resterende deel van de hersenen.
- Scheid de hele hippocampus met zijn alveus kant naar boven en de hippocampus sulcus naar beneden. Snel dalen twee of drie druppels ijskoude sucrose aCSF op het weefsel opnieuw en verwijder de extra oplossing rond het weefsel met behulp van een stuk keukenpapier. Gebruik een brand gepolijst glas hulpmiddel om te draaien de hele hippocampus naar de sulcus (Figuur 1B, C) bloot.
- Onder een normale optische microscoop, plaatst u een op maat gemaakte glazen naald (No. 11 in Specifieke MateriALS activa) in een uiteinde van de sulcus en snijd de vezelverbindingen van dentate gyrus (DG) naar subiculum of het veld CA1, in de richting van sulcus (figuur 1C). Breng een ijskoude blad om de septale en temporele uiteinden van de hippocampus trimmen indien nodig. Plaats een op maat gemaakte metalen draad lus (No. 12 in bepaalde materialen en apparatuur) in de uitsparing sulcus en trek dan de DG weg van het weefsel terwijl de subiculum / CA1 einde van de hippocampus door een brand gepolijst glas gereedschap (figuur 1D) .
- Naar aanleiding van de zich ontvouwende bovenstaande procedure, voeg nog twee of drie druppels van de ijskoude sucrose aCSF op het weefsel en verwijder de extra oplossing rond het weefsel. Vervolgens trimmen uitgeklapte hippocampus met ijskoude mes aan de randen (figuur 1E) en plaats de opstelling met een spatel in de herstellende kamer vullen met aCSF en geborreld met 95% O2 / 5% CO2 bij kamertemperatuur (ongeveer 25 ° C). Vertrekkenongevouwen hippocampus weefsel tot ongeveer 1 uur te herstellen voordat u ze in de opname kamer.
- Neem de andere hersenhelft en gebruik deze om te gaan door stappen 2,5-2,9. Gewoonlijk ongeveer 1-2 min de gehele procedure te beëindigen om een hippocampus ontvouwen en drop ijskoude sucrose aCSF continu aan het weefsel zuurstof en gehydrateerd.
3. Experimentele System Setup
- Lijm een maat gefabriceerd PMEA op een pin grid array (PGA) pakket en gebruik micro wire bonding aan elke pad verbinden van een enkele micro-elektrode aan de pad van een speld op de verpakking (Figuur 3B). Steek dan het pakket in de aansluiting op een op maat gemaakte printplaat 13.
- Individueel elk micro-elektrode aan te sluiten op de filters met band pass cut-off frequentie van 1 Hz tot 4 kHz en versterkers met een winst van 100 op de op maat gemaakte printplaat 13. Digitaliseren van de analoge uitgang van de printplaat door een A / D converting systeem, en het verwerven en opslaan van de gegevens op een computer.
- Lijm een op maat gemaakte plastic opname kamer rond de array met inlaat en uitlaat slangen voor de oplossing stroom (Figuur 4A). Gebruik ten minste twee flessen om verschillende oplossingen in het systeem te houden en aan te sluiten en de controle van de uitvoer slang van de flessen door een tri-klep. Verbind de uitgang van de tri-klep een buissysteem met een IV druppelkamer die bepalend is de oplossing in de opname kamer.
- Tussen de tri-ventiel en de inlaat van de opname kamer, voeg een elektrische verhitter om de oplossing op een gecontroleerde temperatuur (35 ° C) voordat de oplossing wordt geleid naar de opname kamer te verwarmen. Bevestig de uitlaat van de opname kamer een vacuümbuis de oplossing in een vacuümbuis aangesloten kolf verzamelen. Gebruik geen oplossing in een experiment in deze studie niet te recyclen.
4. Het plaatsen van de Uitgeklapt Hippocampus op de PMEA om de neurale activiteit opnemen
5. Het verwijderen van deWeefsel van de PMEA Na een experiment
- Beheersen het weefsel anker door een micromanipulator en geleidelijk opheffen van het weefsel van de opname kamer. Stilgelegd zowel inlaat en uitlaat van de stroming in de opname kamer te stoppen. De opname kamer moet vol met oplossing of voeg een paar druppels van de oplossing om de kamer te vullen als de opname kamer niet vol is.
- Gebruik een kleine kwast op elke hoek van het weefsel te heffen. Als het weefsel niet drijft in de oplossing daarvoor beroep vacuümbuis de kamer voorzichtig droog met het weefsel zitten nog op de array. Vervolgens opent voorzichtig de inlaat om geleidelijk vullen de kamer en het afsluiten van de inlaat van de stroom te stoppen wanneer de opname kamer is vol. Breng de kleine kwast op elke hoek van het weefsel opnieuw tillen.
- Herhaal stap 5.2 totdat het weefsel wordt losgemaakt van de array en drijvend in de oplossing. Wanneer het weefsel drijft in de oplossing, vervolgens de vacuümbuis weg te zuigen weefsel. Open thij stroomt in de inlaat en open het vacuüm in de uitlaat. Was het systeem met gedestilleerd water en droog het uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in de figuren hier gegevens werden geregistreerd in ongevouwen hippocampus bereiding 4-AP (100 uM) aCSF toegevoegd tijdens de incubatie van het weefsel in de opname kamer bij kamertemperatuur (25 ° C). Gewoonlijk activiteit begint binnen 5 minuten, maar in sommige hippocampale weefsels van de oudere dieren het langer duren. De 4-AP-geïnduceerde neuronale waargenomen met de PMEA is hetzelfde als eerder beschreven 14,15. Aangezien de elektroden een hoogte van 200 urn, worden de elektrodetoppen net onder de cellaag (Figuur 3C) omdat de cellaag is gewoonlijk 250 tot 300 urn boven de alveus van de hippocampus (figuur 2) opnamen (57 van 64 in de steekproef experiment) uit verschillende kanalen hebben een overwegend positieve uitslag. Sommige van deze positieve geluidsopnamen kleine negatieve doorbuiging tonen eveneens (Figuur 5B) indien de registratie-elektrode uiteinden dicht genoeg bij de cellaag.Als de elektrode tips rechts bevinden zich op het niveau van de cellaag, zal de opname hebben zeer scherpe negatieve stekelige met positieve verschuiving op of het alleen maar negatieve stekelige (figuur 5C) 16. In de data sample hier getoond, 5 kanalen van de 57 opnames negatieve vastspijkeren. Na het verkrijgen van de gegevens van de 64 kanalen wordt de werkwijze van afzonderlijke normalisatie (figuur 6B) die aan de neurale propagatie kaart op een 2-D vlak langs de tijdas van de opname 7. Met een combinatie van de PMEA en ongevouwen hippocampus wordt neurale vermeerdering toegewezen en waargenomen meestal initiëren één kant van CA3 en longitudinaal bewegen in een diagonale golffront, die de gehele gebied van de hippocampus (figuur 6).
Figuur 1. Chirurgische procedure een opengevouwen hippocampus . (A) Een van de twee hippocampus wordt ontleed temporaalkwab van muizenhersenen. (B) Septal en tijdelijke afsluitingen langs de lengteas. (C) De hippocampus omgedraaid met vuur gepolijste glazen pipet naar de sulcus bloot. Beide uiteinden van de hippocampus worden bijgesneden en een glazen naald wordt gebruikt om de verbindingen tussen DG en CA1 of subiculum langs de langsas snijden. (D) De hippocampus is uitgevouwen door een op maat gemaakte metalen draadlus. (E) Unfolded hippocampus met subiculum en DG getrimd. (F) Het uiteindelijke weefsel voorbereiding van een opengevouwen hippocampus. Deze positie toont de oriëntatie van de hippocampus bij het in de array in een experiment geplaatst. Voor aanvullende informatie over de ongevouwen hippocampus anatomie verwijzen wij u naar experimentele methoden in eerder gepubliceerde manuscripten 7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Histologie dwarsdoorsnede van ongevouwen hippocampus. Crystal-violet kleuring toont de positie van de CA1-CA3 pyramidale cellaag in ongevouwen hippocampus een niveau van 250 tot 300 urn boven de alveus waardoor vinden van de micro-elektroden direct onder de cellaag (zie figuur 3C). Om de secties gekleurd met het kristal violet verkrijgen, het weefsel was achteraf vastgestelde na de hippocampus was ontvouwd. Ongevouwen hippocampus werd in PFA 4% O / N. Daarna werd het weefsel overgebracht en sucrose (30%) gedurende 48 uur gehouden en vervolgens module bevriezing fietser met isopentaan (2-methylbutaan) afkoelen tot -35 ° C in droog ijs. Vriescoupe werden vervolgens gesneden in een cryostaat met20 urn dikke secties in het horizontale vlak (zie de figuur 2) om de locatie van de pyramidale cellaag onthullen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien.
Figuur 3. Geopende hippocampus op het PMEA. (A) Bovenaanzicht van een nieuwe PMEA met micro-elektroden aan het einde van elke goud metalen spoor. Het inzetstuk rechts toont een enkele micro-elektrode onder elektronenmicroscopie met een hoogte van 200 urn en een diameter van 20 urn 7,13. (B) De micro-elektrode array gelijmd op een PGA verpakking met een plastic opname kamer rond de micro-elektroden op een glazen substraat. De insert aan de rechterkant toont een opengevouwen hippocampus geplaatst op de micro-elektrode array midden. (C) Links Optical Coherence Tomography (OCT) beeldvorming toont het gevouwen weefsel boven op de array in een ander experiment. Aan de rechterkant, twee longitudinale slice beelden verkregen uit de LGO beeldvorming links toont de micro-elektrode tips (witte stippen aangegeven door de pijlen) te bereiken in het gebied direct onder het cellichaam laag. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Figuur 4. experimentele setup. (A) Een plastic deksel met schroeven is geplaatst over de circuits om het te beschermen tegen mogelijke waterschade. De opname kamer heeft zowel inlaat- en uitlaatbuizen de vloeistoftoevoer dragen. Een maat Weefselanker verlijmd met een nylon vezelgaas wordt gebruikt om de tiss beveiligenUE tijdens de experimenten. (B) Afbeelding genomen van de bodem van het glassubstraat van de PMEA met de Weefselanker die een monster plak tijdens een experiment. De gebogen draden zijn de nylon vezels op de zeef te drukken bovenop het weefsel. De ronde stippen zijn de basis van micro-elektroden. Pijlen wijzen naar elektroden die beschadigd waren na een aantal experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Ruwe data geregistreerd door de PMEA van een opengevouwen hippocampus. Linker paneel: 4-AP-geïnduceerde epileptische activiteit opgenomen van een micro-elektrode Rechterpaneel. Ingezoomde versie van het signaal duidelijk in het tijdvenster links. (A) 10 sec doorsnede van een voorbeeld van de spontane activiteitgeproduceerd met 100 uM 4-AP aCSF verkregen één van de micro-elektroden in de basale dendritische regio op basis van de polariteit van de signalen met een SNR van 34,9 dB. (B) Ruwe data van een ander micro-elektrode dichter bij de somata gelegen met een SNR 27,2 dB. (C) Voorbeeld van opname verkregen van een elektrode gepositioneerd binnen de somatische laag. In dit voorbeeld, is de SNR 18,53 dB. (D) Opnemen verkregen uit een gebogen elektrode nog geleidend maar niet doordringen in het weefsel. De gebogen elektrode een significant lagere SNR vergeleken met die intacte elektroden (1.5 dB in dit voorbeeld). (E) Baseline ruis opgenomen van een micro-elektrode. De basislijn heeft meestal een piek-piek waarde 150-200 mV en de impedantie van een enkele elektrode is ongeveer 1 tot 2 MQ. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Omzetting van microfabricatietechnieken gegevens in de 2-D propagatie kaarten. (A) Een 170 msec tijdvenster kapt een neuraal spiking in elk kanaal uitgezet op de foto van de PMEA. De ruwe data wordt gefilterd door een laagdoorlaatfilter 100 Hz. De signalen van de gebroken elektroden worden geïnterpoleerd met de opnames eromheen. In dit voorbeeld, de spikes positief. (B) Een enkele neurale spike van de rode pixel in (A) genormaliseerd op de kleurenbalk met een speciaal ontwikkelde methode voor individuele normalisatie (Zie de voorgaande publicatie voor meer details de normalisatie 7). (C) De kleur kaarten die door de afzonderlijke normalisatie zien dat propagatie beweegt over het gehele oppervlak van het ongevouwen hippocampus op verschillende tijdstippen.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van het ongevouwen hippocampus preparaat, waarbij de longitudinale en transversale assen van de hippocampus worden bewaard in combinatie met een penetrerende micro-elektrode array, een krachtig hulpmiddel om de anatomie aansluitingen of neurale propagatie in de hippocampus 7 onderzoeken. Dit ontvouwen procedure ook voor het bestuderen van de hippocampus bij volwassen muizen. Recente studies met dit preparaat bleek dat de 4-AP-geïnduceerde epileptische activiteit kan voortplanten met een diagonale golffront over het gehele oppervlak van het ongevouwen hippocampus (figuur 6) 7,8. Deze studies toonden aan dat het intacte uitgevouwen hippocampus biedt aanzienlijke voordelen boven hetzij dwars- of langsrichting segmenten als de neurale propagatie in een vlakke hippocampus neuraal netwerk kan worden onderzocht (figuur 6).
De indringende micro-elektrode biedt een belangrijk voordeel ten opzichte van bestaande microelectrode arrays (MEA), die bestaan uit meerdere contacten geplaatst over een plat oppervlak 11,12,17. MEA met vlakke elektroden zijn moeilijk te gebruiken met de uitgeklapte hippocampus omdat de cellaag is ongeveer 250 tot 300 urn van het oppervlak (figuur 2). De hier beschreven PMEA is ontworpen om dit probleem op te lossen met 64-penetrerende elektroden geschikt voor het bestuderen van de neurale voortplanting met een hoogte van 200 urn tot diep doordringt in het weefsel 7,13. Bovendien, de PMEA ook toepasselijk in elke vlakke weefsel preparaat, zoals corticale schijfjes hippocampus dwarse plakjes etc.
Een ander voordeel van deze PMEA is de verbeterde SNR. Een prototype studie van dit PMEA toont de SNR verhouding van neurale signaal opgenomen door deze PMEA een gemiddelde waarde van 19,4 ± 3 dB, wat aanzienlijk hoger en stabieler vergeleken met die van VSD opname voorgaande studies aan dat de toxiciteit enFoto bleken van FO duidelijk verminderd de mogelijkheid om gegevens 8 opnemen. Met een verbeterde experimentele protocol via de Weefselanker in deze studie, de SNR van de opname van de PMEA toeneemt tot een gebied van ongeveer 20 tot 30 dB (figuur 5), die een hogere SNR heeft ten opzichte van die vlakken elektrode arrays met een waarde van 10 tot 15 dB 11,18. De mogelijkheid om de hippocampus ontvouwen is essentieel om een laag van neuronen (CA1-CA3) die kunnen worden ondervraagd door een vlakke opname-array te verkrijgen.
Aangezien het silicium matrix is op een transparant substraat, spanningsgevoelige kleurstof beeldvormende techniek kan worden geïntegreerd in het PMEA systeem om de voortplanting van neurale activiteit in de hippocampus 8. Transgene muizen met fluorescerende voltage gevoelige indicatoren kunnen ook worden gebruikt om de oorsprong en de verspreiding van het signaal onder fysiologische omstandigheden en veranderingen bij pharmacologi onderzoekencal agenten of genetisch gemodificeerde weefsel van verschillende diermodellen 9.
Er zijn verschillende kritische stappen om hoge kwaliteit opname verzekeren. Eerst levensvatbaarheid weefsel verlenen de chirurgische procedure worden zo snel mogelijk uitgevoerd. Meestal duurt het ongeveer 1 tot 2 minuten te gaan door alle stappen van 2,1) tot 2.10). De praktijk van het ontvouwen procedure op sommige monster dieren wordt sterk aanbevolen voordat de werkelijke experimentele operatie wordt uitgevoerd. Ten tweede, de stroomsnelheid behoeften constant worden gehouden om elke wijziging van het niveau van de perfusievloeistof in de opname kamer te vermijden. Voorts moet het weefsel worden verankerd neer beweging van het weefsel ten opzichte van de matrix voorkomen.
Hoewel de hier beschreven PMEA nuttige signalen kunnen verschaffen bij de controle van de neurale propagatie in ongevouwen hippocampus, zijn er enkele nadelen en beperkingen van deze opname methode.
Ten eersteDe micro-elektroden kan breken vanwege de mechanische kracht die op hen (figuur 5D, E). Tijdens de procedure van weefsel plaatsing en verwijdering, kan het toevallig contact tussen de kleine kwast en de vele zorgen dat de micro-elektroden te buigen of breken. Wanneer de Weefselanker beneden wordt verlaagd door de micromanipulator, kan de horizontale beweging van het weefsel langs de bodem van de kamer een afschuifkracht die kunnen leiden tot buigen of breken van de elektroden te creëren. In een toekomstige vormgeving, moet de micro-elektroden worden hervormd met een wat dikkere basis om ze sterker te maken. In de huidige versie van deze PMEA, de registrerende elektroden een smalle basis opzichte van de diameter 13, waardoor verzwakking van de elektroden (Figuur 3A).
De reinigingsprocedure moet worden verbeterd om de resterende weefsel en vezels die kunnen hechten aan de matrix voldoende verwijderen. Na elk experiment reepjesweefsel kan blijven aan de micro-elektroden en het overblijvende weefsel links op de elektroden moeten worden verwijderd. Als deze resterende weefsels niet verwijderd, kan de impedantie van de elektroden en de SNR van de opnamen worden beïnvloed. Spoelen van het systeem met gedestilleerd water wordt voorgesteld als aangegeven in deel 5 van de sectie protocol. Gebruikers worden ook geadviseerd om het systeem te spoelen met een aantal zwakke zure oplossing, die het weefsel kunnen ontbinden, zonder schade aan het systeem
Een ander nadeel van dit protocol is dat tijdens het ontvouwen procedure, de perforant pad in de ongevouwen hippocampus gesneden, waardoor onderzoek naar de mogelijke neurale signalen voortplanten van DG naar de andere lagen van de hippocampus.
Concluderend hebben we hier beschreven een nieuwe methode om de voortplanting van neurale activiteit in de hippocampus onderzoeken door het combineren van een hoge aspectverhouding micro-elektrode array uitgevouwen hippocampus tissue. De werkwijze heeft geleid tot een beter begrip van hoe neuronale activiteit kan voortplanten in langs- en dwarsrichting. Deze techniek kan ook worden toegepast op corticale weefsel in een soortgelijke wijze bovenop de matrix. Bovendien combineert optische opnametechniek met dit preparaat mogelijk aangezien de matrix transparant en kan ook leiden tot belangrijke bevindingen signaalvoortplanting in zenuwweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T.
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
