Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

Summary

Wir haben einen in vitro ungefalteten Hippocampus die CA1-CA3 Anordnung von Neuronen bewahrt entwickelt. In Kombination mit der durchdringenden Mikroelektrodenanordnung kann die neuronale Aktivität in sowohl der Längs- und Querrichtungen überwacht werden. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber hippocampalen Schnittpräparaten, wie die Ausbreitung im gesamten Hippocampus gleichzeitig aufgenommen werden.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines neuen in vitro Flach Hippocampus Zubereitung in Kombination mit einer mikrobearbeiteten Array auf neuronale Aktivität Karte im Hippocampus. Die Querschnittpräparat Hippocampus ist die häufigste Gewebeaufbereitung zu Hippocampus Elektrophysiologie zu studieren. Eine Längshippocampusschnitt wurde um Längsverbindungen im Hippocampus untersuchen entwickelt. Die intakten Hippocampus der Maus kann auch in vitro aufrechterhalten werden, weil seine Dicke gestattet ausreichende Sauerstoffdiffusion. Allerdings sind diese drei Zubereitungen, bieten direkten Zugriff auf neuronale Ausbreitung da ein Teil des Gewebes ist nicht vorhanden oder gefaltet. Die abgewickelte intakten Hippocampus bietet sowohl Quer- und Längsverbindungen in einer flachen Konfiguration für den direkten Zugang zu dem Gewebe, das volle Ausmaß der Signalausbreitung im Hippocampus in vitro analysiert. Um die neuronale Aktivität von t wirksam zu überwachener Zellschicht, eine maßgeschneiderte dringenden Mikroelektrodenarrays (PMEA) wurde hergestellt und in die entfaltete Hippocampus angewendet. Die PMEA mit 64 Elektroden von 200 um in der Höhe könnte neuronale Aktivität tief in Hippokampus der Maus aufzeichnen. Die einzigartige Kombination von einem ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA stellt ein neues in vitro-Werkzeug, um die Geschwindigkeit und die Richtung der Ausbreitung der Nervenaktivität in der zweidimensionalen CA1-CA3 Hippocampus Regionen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu untersuchen.

Introduction

Das Verständnis der neuronalen Leitungs oder eine Ausbreitung einer neuronalen Signale ist für die Bestimmung des Mechanismus der neuronalen Kommunikation sowohl in der normalen Funktion und pathologischen Zuständen im Gehirn ^1-3. Der Hippocampus ist eine der am besten untersuchten Strukturen im Gehirn, da sie wesentliche Rolle spielt in verschiedenen Gehirnfunktionen wie Speicher und räumliche Verfolgung und ist in mehreren pathologischen Veränderungen, die dramatisch beeinflussen Verhalten sowie ^1,6 beteiligt. Zwar weist der Hippocampus eine komplexe Organisation, können die verschiedenen Elemente der Struktur leicht identifiziert und im Schnittpräparat ^4-6 aufgerufen werden. In der Querrichtung des Hippocampus wird die neuronale Aktivität bekannt, durch das tri-synaptischen Weg, Gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5 aufweisen ausbreiten. Es wird angenommen, dass die synaptische Übertragung und axonalen Leitungs spielen eine wichtige Rolle für die Kommunikatiauf in dieser Querschluss ^4,6. Jedoch Ausbreitungs neuronalen Signals findet in sowohl Quer- als auch Längsrichtungen ^4,6. Dies impliziert, dass der Hippocampus nicht vollständig durch Verwendung Schnittpräparate, die die Beobachtung zu einer bestimmten Ausbreitungsrichtung ⁴ begrenzen sucht werden. Die Längs Scheibe wurde entwickelt, um die axonalen Bahnen entlang der Längsachse ⁵ zu untersuchen. Forscher haben Verhalten spezifischen gamma und theta Schwingungen vorwiegend entlang der Quer- und Längsachsen jeweils ⁶ beobachtet. Diese Verhaltensweisen wurden getrennt untersucht, aber gleichzeitigen Zugriff auf beide Richtungen ist von entscheidender Bedeutung, um dieses Verhalten zu verstehen. Auch bei der Entwicklung des intakten Hippocampus Herstellung ist es schwierig, die Ausbreitung über den gesamten Gewebes infolge gefalteten Struktur des Hippocampus ⁴ überwachen. Die entfaltete Hippocampus bietet Zugriff auf die verpackt Neuronenin einer Form einer flachen Zellschicht ^7,8 zweidimensional.

Durch Entfalten des Gyrus dentatus (DG) (Abbildung 1), der Hippocampus nimmt eine abgeflachte Form mit einer rechteckigen Konfiguration, in welcher sowohl Quer- und Längsverbindungen intakt mit der pyramidalen Zellschicht in einer zweidimensionalen Platte, die sowohl CA3 und CA1 angeordnet zu bleiben, wobei ein Flachstück Nervengewebe, die verwendet werden können, um neuronale Ausbreitungs untersuchen (Figur 2) ^8. Neuronale Aktivität kann dann mit einzelnen Glaspipetten Mikroelektrodenarrays, Stimulationselektroden sowie spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSD) ^3,7,8 überwacht werden. Zusätzlich können genetisch kodierte Spannungsanzeige aus transgenen Mäusen verwendet, um die Ausbreitungsmuster ⁹ verfolgen.

Die flache Konfiguration des ungefalteten hippocampalen Netzwerk für optische Aufzeichnungsverfahren, sondern auch für eine Mikroelektrodenanordnung geeignet. Most der im Handel erhältlichen Arrays werden mit ebenen oder flachen Elektroden hergestellt und kann die neuronale Aktivität in beiden Gewebeschnitten und kultivierten Neuronen ^10-12 aufzeichnen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) verringert sich jedoch, wenn die Signale von einem intakten Gewebe erhalten werden, da das Soma der Neuronen befinden tiefer in das Gewebe. Mikroelektrodenanordnungen mit hohen Aspektverhältnissen erforderlich sind, um das SNR zu verbessern.

Zu diesem Zweck ist eine durchdringende Mikroelektroden-Anordnung (PMEA) in unserem Labor entwickelt worden sind, und bietet die Möglichkeit, direkt in die Gewebeprobe durch Einführen 64 Spitzen mit einem Durchmesser von 20 & mgr; m und einer Höhe von 200 um in der aufgeklappten Hippocampus ^7,13 . Das Mikroelektrodenanordnung eine höhere SNR im Vergleich zu der spannungsempfindlichen Farbstoff-Bildgebung und die SNR bleibt während eines Experiments ^7,13 stabil. Die Kombination des ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA bietet einen neuen Weg zu investierenIgate das neuronale Ausbreitung über einer zweidimensionalen Ebene. Experimente mit dieser Technik bereits erbrachte wichtige Ergebnisse über die Mechanismen der neuronalen Signalausbreitung im Hippocampus, wobei die neuronale Aktivität kann unabhängig von synaptischen oder elektrischen Synapsen ⁷ verbreiten.

Protocol

HINWEIS: Tierversuchsprotokolle wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität zugelassen. CD1-Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von P10 bis P20 sind in dieser Studie verwendet.

1. Lösungen für Chirurgie und Experimental-Aufnahme

1. Bereiten normalen künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) enthaltenden Puffer (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO 4 1,25, MgSO ₄ 2, NaHCO ₃ 26, Dextrose 10 und CaCl _{2 2.} Verwenden dieses normalen aCSF zur Gewebewiederherstellung nach der Sektion, als auch für Waschsystem zu Beginn des Experiments.
2. Bereiten Saccharose aCSF, die während des Hippocampus Dissektion verwendet wird und enthält (mM): Saccharose 220, KCl 2,95, NaH ₂ PO 4 1,3, MgSO ₄ 2, NaHCO ₃ 26, Dextrose 10 und CaCl _{2 2.} Um epileptiforme Aktivität in intakten Hippocampus Gewebeaufbereitung induzieren, fügen Sie 4-Aminopyridin (4-AP) in den Normal aCSF andie Konzentration von 100 uM.

2. Chirurgische Verfahren für die Intact Hippocampus Vorbereitung

1. Tropfen Isofluran (1 ml) in die Kammer an der Unterseite der Exsikkator Glas (No.1 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) und mit einem normalen Papiertuch, um die Oberfläche der Bodenstufe abdecken so das Tier nicht in Kontakt kommen die Flüssigkeit. Legen Sie dann die CD1-Maus in den Topf und den Deckel schließen. Halten Sie das Tier in dem geschlossenen Gefäß für etwa 1 min bis 2 min. Bei Atemfrequenz etwa einem pro Sekunde, entfernen Sie die Maus aus dem Glas.
2. Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Bühne und enthaupten mit einer geeigneten Schere. Unmittelbar nach der Enthauptung, legen Sie den Kopf in den eiskalten (3-4 ° C), sauerstoff Saccharose aCSF für etwa 30 sec.
3. Verwenden einer feinen Schere (No.5 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung), um die Haut auf der Oberseite des Schädels zu entfernen und die Schädel entlang der Mittellinie des Kopfes als auch an den beiden Enden in der Nähe der Tempo geschnittenral Lappen. Verwenden einer Pinzette (No. 6 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung), um den Schnitt Schädel zu jeder Seite des Kopfes, um das Gehirn ausgesetzt schälen.
4. Legen Sie eine Mikro-Labor Spatel (No. 8 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) in den Spalt zwischen den Scheitellappen des Gehirns und des Schädels, um sorgfältig schälen das Gehirn von der Unterseite des Schädels und dann legen Sie es auf eine vorbereitete eiskaltem (3 -4 ° C) Operationstisch mit feuchtem Filterpapier (Nr.2 in spezifischen Materialien und Geräte) abgedeckt. Entfernen des Cerebellum mit eisgekühltem Klinge und trennen die beiden Hemisphären durch Schneiden der Mittellinie des Gehirns. Legen Sie dann die beiden Hemisphären getrennt in ein Becherglas mit dem eiskalten Saccharose aCSF mit 95% O _2/5% CO ₂ sprudelte gefüllt.
5. Nehmen Sie die Hälfte der Hemisphäre und auf den eiskalten Filterpapier Bühne. Zeigen regelmäßigen Küchenpapier oder Filterpapier, um das Gehirn, um die zusätzliche Lösung zu saugen. Verwenden Sie zwei feuerpolierte Glaspipette-Tools (No. 10 in Materialien undAusrüstung), den Kortex vom Rest des zentralen Teils des Gehirns zu trennen.
6. Nach der Hippocampus aus dem Inneren der Hirnrinde freigelegt und auf dem eiskalten Bühne zu bringen, indem Sie zwei oder drei Tropfen eiskalten Saccharose aCSF auf das Gewebe und entfernen Sie zusätzliche Lösung rund um den Hippocampus. Schneiden Sie die Verbindungen mit dem Kortex an zwei Enden des Hippocampus. Dann sezieren den Hippocampus aus dem Gehirn mit den feuerpolierten Glaswerkzeuge und den verbleibenden Teil des Gehirns zu entfernen.
7. Trennen Sie die gesamte Hippocampus mit seinen alveus Seite nach oben und Sulcus hippocampi nach unten. Drop schnell zwei oder drei Tropfen eiskaltem Saccharose aCSF auf das Gewebe wieder und entfernen Sie die zusätzliche Lösung um das Gewebe mit einem Stück Küchenpapier. Verwenden Sie eine feuerpolierte Glas Werkzeug drehen Sie den ganzen Hippocampus, den Sulcus (1B, C) ​​aussetzen.
8. Unter einem normalen Lichtmikroskop, legen Sie eine maßgeschneiderte Glas Nadel (No. 11 in bestimmten MateriALS und Equipment) in ein Ende des Sulcus und schneiden die Faserverbindungen von Gyrus dentatus (DG), um Subiculum oder der CA1-Feld, entlang der Richtung des Sulcus (Abbildung 1C). Tragen Sie eine eiskalte Klinge, um die Scheidewand und zeitliche Enden des Hippocampus bei Bedarf trimmen. Legen Sie eine maßgeschneiderte Metalldrahtschleife (No. 12 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) in den Ausschnitt Sulcus und ziehen Sie über die GD von dem Gewebe, während die Subiculum / CA1 Ende des Hippocampus halten durch eine feuerpolierte Glaswerkzeug (1D) .
9. Nach der Entfaltung Verfahren vor, fügen Sie noch zwei oder drei Tropfen des eiskalten Saccharose aCSF auf das Gewebe und entfernen Sie die zusätzliche Lösung um das Gewebe. Dann schneiden Sie die ungefaltet Hippocampus mit der eiskalte Klinge an den Rändern (1E) und legen Sie die Vorbereitung mit einem Spatel in die Rückgewinnungskammer mit normaler aCSF gefüllt und bei Raumtemperatur mit 95% O _2/5% CO ₂ sprudelte (ca. 25 ° C). Stehen Lassendie entfaltete Hippocampus Gewebe ca. 1 Stunde, bevor Sie sie in den Aufnahmeraum zu erholen.
10. Fahren Sie auf der anderen Gehirnhälfte und es verwenden, um durch die Schritte 2,5-2,9 gehen. In der Regel dauert etwa 1 bis 2 min, das gesamte Verfahren zu beenden, um eine einzelne Hippocampus entfalten & Drop eiskalten Saccharose aCSF kontinuierlich, um das Gewebe mit Sauerstoff angereichert und mit Feuchtigkeit versorgt.

3. Experimentelle System-Setup-

1. Kleben Sie ein individuell gefertigter PMEA auf einem Pin-Grid-Array (PGA) Paket und nutzen Mikrodrahtbonden, jede Unterlage aus einer Mikroelektrode auf das Kissen der auf der Verpackung (3B) einen Stift zu verbinden. Legen Sie dann das Paket in die Buchse an einem maßgeschneiderten Leiterplatte ^13.
2. Individuell verbinden jeden Mikro seiner Filter mit Bandpassgrenzfrequenz von 1 Hz bis 4 kHz und Verstärker mit Verstärkung von 100 auf der maßgeschneiderte Leiterplatte ^13. Digitalisieren des Analogausgangssignal von der Platine durch einen A / D CONVerting System und Erfassen und Speichern der Daten auf einem Computer.
3. Kleben Sie eine maßgeschneiderte Kunststoffaufnahmekammer um das Array mit Ein- und Auslaufschlauch für das Lösungsstrom (4A). Verwenden Sie mindestens zwei Flaschen, verschiedene Lösungen im System zu belassen, und kommen und den Ausgangsschlauch der Flaschen Kontrolle durch eine Tri-Ventil. Verbinden Sie den Ausgang des Tri-Ventil an ein Schlauchsystem mit einer IV Tropfkammer, die Führung wird die Lösung in den Aufnahmeraum.
4. Zwischen dem tri-Ventil und dem Einlass der Aufzeichnungskammer, fügen eine elektrische Heizung, die Lösung auf einer kontrollierten Temperatur (35 ° C), bevor die Lösung auf das Aufzeichnungskammer geführt zu erhitzen. Befestigen Sie den Ausgang der Aufnahmekammer an eine Vakuumröhre, die Lösung in eine Vakuumröhre verbunden Kolben sammeln. Sie bereiten keine Lösung in jedem Experiment in dieser Studie.

4. Platzieren des Unfolded Hippocampus auf die PMEA die neuronale Aktivität aufzuzeichnen

Um die Versuchsanordnung vorzubereiten, füllen Sie eine Flasche mit normaler aCSF und eine Flasche mit 4-AP aCSF. In beiden Flaschen, Blase 95% O _2/5% CO ₂ von Beginn eines jeden Versuchs. Verwenden Sie ein Tri-Ventilstecker zu steuern, welche Lösung bei einem Experiment ausgewählt werden. Anschließen eines Vakuumrohres am Auslaß der Kammer, um die Lösung in einen Staubbehälter zu pumpen. Erhitzen Sie die Pipeline vor der Zustellung in den Aufnahmeraum und halten Sie die Lösung bei einer kontrollierten Temperaturniveau (35 ° C).

Wenn der Einlass und Auslass des Aufnahmekammer geschlossen sind, verwenden Sie eine maßgeschneiderte Glaspipette Pipette, um in den Aufnahmeraum zu übertragen und setzen Sie den ausgeklappten Hippocampus. Unter dem Mikroskop positionieren entfaltet Hippocampus mit einem normalen kleinen Pinsel, während das Gewebe in der Lösung schweben. Stellen Sie den aufgeklappten Hippocampus mit seinen alveus Seite nach unten, CA3 Bereich wegweisend und CA1 Feld in Richtung der Forscher. Sorgfältig abzusaugen, die Lösung in der Kammer mit einer Vakuumpipette von der Kante des Aufzeichnungskammer, die Lösungspegel zu reduzieren, bis die Kammer wird getrocknet und das Gewebe wird auf die Anordnung gesenkt. Dann setzt vorsichtig eine maßgeschneiderte Gewebeanker (Bild 4) (No. 14 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) auf der Oberseite des Gewebes, um die entfaltete Hippocampus auf die Anordnung zu halten. Geben Sie einige Tropfen der Lösung in die Aufnahmekammer, um sie wieder zu füllen, und nach und nach öffnen Sie den Eingang und Ausgang zum Durchflussmenge auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde in der IV Tropfkammer einzustellen.

Inkubieren Sie die Gewebe in der Aufnahme Kammer mit normaler aCSF für ca. 1 min zu erholen, dann schalten Sie die Lösung Versorgung 4-AP aufgelöst aCSF und stellen Sie die Durchflussrate korrekt. Inkubieren des Gewebes in 4-AP aufgelöst aCSF für etwa 5 bis 10 Minuten und dann konnte der Forscher die Software zu starten, um das Signal aufnehmen, wenn spontane Aktivität angezeigt.

5. Entfernen derGewebe aus dem PMEA Nach einem Experiment

1. Steuern Sie die Gewebeanker durch einen Mikromanipulator und allmählich heben Sie das Gewebe aus der Aufnahmekammer. Fahren Sie sowohl Ein- und Ausgang, um den Fluss in der Aufnahmekammer zu stoppen. Die Aufnahmekammer sollte voll mit Lösung sein oder ein paar Tropfen der Lösung, um die Kammer zu füllen, wenn die Aufnahme Kammer nicht voll ist.
2. Mit einem kleinen Pinsel, um jede Ecke des Gewebes zu heben. Wenn das Gewebe nicht in der Lösung schweben, dann verwenden die Vakuumröhre in die Kammer sorgfältig mit dem Gewebe immer noch auf der Anordnung sitzt trocknen. Öffnen Sie dann vorsichtig den Einlass schrittweise füllen Sie die Kammer und fahren Sie den Einlass, um den Fluss zu stoppen, wenn der Aufnahmeraum ist voll. Übernehmen Sie die kleinen Pinsel, um jede Ecke des Gewebes wieder zu heben.
3. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis zum Gewebe wird aus dem Feld gelöst und schwebend in der Lösung. Wenn das Gewebe in der Lösung schwimmen, dann mit der Vakuumröhre, um das Gewebe entfernt saugen. Offene ter in der Einlassstrom und öffnen Sie den Unterdruck in der Steckdose. Waschen Sie das System mit destilliertem Wasser und trocknen Sie es heraus.

Representative Results

Die in den Figuren hier dargestellten Daten wurden im entfalteten Hippocampus Zubereitung mit 4-AP (100 uM) aCSF während der Inkubation des Gewebes in der Aufzeichnungskammer gegeben bei RT (25 ° C) aufgezeichnet. Normalerweise Aktivität beginnt innerhalb von 5 Minuten, aber in einigen Hippocampus-Gewebe von den älteren Tieren kann es länger dauern. Die mit der PMEA beobachtet 4-AP-induzierte neuronale Aktivität ist die gleiche wie zuvor berichtet ^14,15. Da die Elektroden haben eine Höhe von 200 & mgr; m, werden die Elektrodenspitzen gerade unterhalb der Zellschicht (3C), weil die Zellschicht ist üblicherweise 250 bis 300 & mgr; m oberhalb der alveus des Hippokampus (Figur 2), Aufnahmen (57 aus befindet 64 in der Probe Experiment) von verschiedenen Kanälen haben eine überwiegend positive Ablenkung. Doch einige dieser positiven Aufnahmen könnten kleine negative Ausschläge sowie (5B), wenn die Aufnahmeelektrodenspitzen sind nahe genug, um die Zellschicht an.Wenn die Elektrodenspitzen rechts auf der Ebene der Zellschicht befindet, wird die Aufnahme haben sehr scharfe negativen Spikes mit positiver Verschiebung darauf oder einfach nur negativ Spiking (5C) ^16. In der hier gezeigten Datenprobe, 5 Kanäle aus 57 Aufnahmen negative Spikes. Nach dem Erwerb der Daten von allen 64 Kanälen wird das Verfahren der individuellen Normalisierungs (6B), die an das neuronale Ausbreitung auf einer 2-D-Ebene entlang der Zeitachse des Aufzeichnungs ⁷ abzubilden. Mit einer Kombination aus der PMEA und der ungefalteten Hippocampus wird neuronalen Ausbreitungs abgebildet und zeigt vorwiegend auf einer Seite des CA3 initiieren und bewegen sich in Längsrichtung in einer diagonalen Wellenfront, über den gesamten Bereich des Hippocampus (Abbildung 6).

Abbildung 1. Chirurgische Verfahren für einem ungefalteten Hippocampus . (A) Einer der beiden hippocampi von Temporallappen einer Maus Gehirn seziert. (B) Septal und zeitliche Kündigungen entlang der Längsachse. (C) Der Hippocampus wird über eine feuerpolierte Glaspipette gekippt, um den Sulcus aus. Beide Enden des Hippocampus getrimmt und ein Glas Nadel wird verwendet, um die Verbindungen zwischen DG und CA1 oder Subiculum entlang der Längsachse geschnitten. (D) Der Hippocampus ist durch eine maßgeschneiderte Metalldrahtschlaufe entfaltet. (E) Entfaltet Hippocampus mit Subiculum und DG getrimmt. (F) Die endgültige Gewebeaufbereitung einer aufgebogenen Hippocampus. Diese Position zeigt die Ausrichtung des Hippocampus, wenn es auf dem Array in einem Versuch platziert wird. Für weitere Details über das entfaltete Hippocampus Anatomie bitte an experimentellen Methoden in früher veröffentlichten Manuskripte ⁷ beziehen.g1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2. Histologie Querschnitt des ungefalteten Hippocampus. Kristallviolett-Färbung zeigt die Position des CA1-CA3 pyramidalen Zellschicht in den ungefalteten Hippocampus ein Niveau von 250 bis 300 & mgr; m oberhalb der alveus dadurch Lokalisieren der Mikroelektroden direkt unterhalb der Zellschicht (siehe 3C). Um die Abschnitte mit dem Kristallviolett gefärbt zu erhalten, wurde das Gewebe nachfixiert, nachdem die Hippokampus war entfaltet. Die entfaltete Hippocampus wurde PFA 4% O / N gelegt. Dann wurde das Gewebe übertragen und in einer Zuckerlösung (30%) für 48 Stunden gehalten und anschließend das Schnellgefrieren in einem Radfahrer enthaltend Isopentan (2-Methylbutan) bis zu -35 ° C in Trockeneis abgekühlt. Schnellschnitt wurden dann in einem Kryostaten mit geschnitten20 & mgr; m dicke Abschnitte in der Querebene (wie in der Abbildung 2 gezeigt), um die Position der Pyramidenzellschicht zu offenbaren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 3. Entfaltet Hippocampus auf der PMEA. (A) Draufsicht auf einen neuen PMEA mit den Mikroelektroden am Ende eines jeden Goldmetallbahn entfernt. Der Einsatz auf der rechten Seite zeigt eine einzelne Mikroelektrode unter Elektronenmikroskopie mit einer Höhe von 200 um und einem Durchmesser von 20 & mgr; m ^7,13. (B) Die Mikroelektrodenanordnung wird auf einem PGA-Gehäuse mit einem Kunststoffaufnahmekammer um die Mikroelektroden auf geklebt ein Glassubstrat. Der Einsatz auf der rechten Seite zeigt eine entfaltete Hippocampus auf der Mikroelektrode arr platziertay in der Mitte. (C) Auf der linken Seite, optische Kohärenztomographie (OCT) Bildgebungs zeigt die entfalteten Gewebe an der Spitze des Feldes in einem anderen Experiment positioniert. Auf der rechten Seite, zwei Längsschnittbilder von der OCT-Bildgebung auf der linken Seite zeigt die erhaltenen Mikroelektrodenspitzen (weiße Punkte hingewiesen, die durch die Pfeile) erreichen in den Bereich direkt unterhalb des Zellkörperschicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen .

Abbildung 4. Versuchsaufbau. (A) Eine Kunststoffdeckel mit Schrauben über den Schaltungen, um es gegen mögliche Beschädigung zu schützen Wasser platziert. Die Aufnahmekammer hat sowohl Ein- und Auslaufrohren, um den Lösungsstrom zu tragen. Eine maßgeschneiderte Gewebeanker mit einer Nylonfaser Mesh geklebt wird die tiss sichernue während der Experimente. (B) Bild von der Unterseite des Glassubstrats des PMEA, die die Gewebeverankerung, die eine Probe Scheibe während eines Experiments entnommen. Die gebogenen Drähte werden die Nylonfasern aus der Maschenpress auf der Oberseite des Gewebes. Die runden Punkte sind die Grundlagen der Mikroelektroden. Pfeile zeigen auf Elektroden, die nach einigen Versuchen wurden beschädigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5. Rohdaten vom PMEA aus einem ungefalteten Hippocampus aufgezeichnet. Linke Seite: 4-AP-induzierte epileptiforme Aktivität von einem einzigen Mikroelektroden aufgezeichnet Rechts:. Zoomed-in-Version des in dem Zeitfenster auf der linken Seite markiert Signal. (A) 10 sec Schnitt eines Beispiels der spontanen Aktivität in100 & mgr; M 4-AP aCSF reduzierten erhalten aus einem der Mikroelektroden in der basalen dendritischen Bereich auf der Grundlage der Polarität der Signale mit einem SNR von 34,9 dB liegt. (B) Rohdaten von einem anderen Mikroelektrode näher an der Zellkörper mit einem SNR von 27,2 dB. (C) Beispiel für die Aufnahme von einer Elektrode in der somatischen Ebene positioniert erhalten. In diesem Beispiel ist das SNR 18,53 dB. (D) Aufzeichnen einer gebogenen Elektrode noch leitend, aber nicht in das Gewebe eindringt, erhalten. Der gebogene Elektrode eine signifikant niedrigere SNR im Vergleich zu den intakten Elektroden (1,5 dB in diesem Beispiel). (E) Grundrauschen aus einer Mikroelektrode aufgezeichnet. Die Grundlinie ist in der Regel eine Spitze-Spitze-Wert von 150 bis 200 & mgr; V und der Impedanz einer einzelnen Elektrode ist ungefähr 1 bis 2 MOhm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 6. Umwandlung von neuronalen Aufnahme von Daten in die 2-D-Ausbreitung Karten. (A) Ein 170 ms Zeitfenster schneidet eine einzige neurale spiking in jedem Kanal aufgetragen auf das Foto des PMEA. Die Rohdaten werden durch ein Tiefpassfilter bei 100 Hz gefiltert. Die Signale von den gebrochenen Elektroden sind mit den Aufnahmen herum interpoliert werden. In diesem Beispiel sind alle Spitzen positiv. (B) Eine einzelne neuronale Spike von der roten Pixel in (A) ist normiert auf den Farbbalken mit einem speziell entwickelten Verfahren für einzelne Normierung (Bitte beachten Sie die vorherige Veröffentlichung für weitere Informationen über die Normalisierung ^7). (C) Die Farbkarten, die durch die einzelnen Normalisierung zeigen, dass die Ausbreitung bewegt sich über die gesamte Fläche des ungefalteten Hippocampus zu verschiedenen Zeitpunkten.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Die Entwicklung des ungefalteten Hippocampus Zubereitung, wobei die Längs- und Querachse des Hippocampus in Kombination mit einem durchdringenden Mikroelektrodenanordnung erhalten, stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Anatomie Verbindungen oder neuronale Ausbreitung im Hippocampus ⁷ zu untersuchen. Diese sich entfaltenden Verfahren ist auch für das Studium Hippocampus in erwachsenen Mäusen. Jüngste Studien mit diesem Präparat zeigten, daß das 4-AP-induzierte epileptiforme Aktivität kann mit einer diagonalen Wellenfront über die gesamte Fläche des ungefalteten Hippokampus (Figur 6) ^7,8 ausbreiten. Diese Studien zeigten, dass die Intakt ungefalteten Hippocampus bietet erhebliche Vorteile gegenüber entweder Längs- oder Querschnitten, wenn die neuronalen Ausbreitung in einem Flach hippocampalen neuronales Netz (Figur 6) untersucht werden.

Der durchdringende Mikro bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber bestehenden microelectrode Arrays (MEA), die von mehreren Kontakten auf einer ebenen Fläche aufgestellt ^11,12,17 bestehen. MEA mit flachen Oberflächenelektroden sind nur schwer mit dem entfalteten Hippocampus zu verwenden, da die Zellschicht ist etwa 250 bis 300 um von der Oberfläche (2) befindet. Die hier beschriebene PMEA wurde entwickelt, um dieses Problem mit 64 penetrierende Elektroden geeignet für die Untersuchung der neuronalen Ausbreitung mit einer Höhe von 200 um bis tief in das Gewebe ^7,13 erreichen zu lösen. Darüber hinaus ist die PMEA verständlich auch bei jeder ebenen Gewebepräparation, wie Rindenscheiben, Hippocampus Querschnitten usw.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung dieses PMEA ist das verbesserte SNR. Ein Prototyp Studium dieser PMEA zeigt das SNR-Verhältnis von neuronalen Signals durch dieses PMEA aufgezeichnet hat einen durchschnittlichen Wert von 19,4 ± 3 dB, was im Vergleich zu der VSD Aufzeichnungs deutlich höher und stabiler ist, da frühere Studien gezeigt, dass die Toxizität undFotobleichen von VSD deutlich die Fähigkeit, Daten ⁸ aufnehmen beeinträchtigt. Mit einem verbesserten Versuchsprotokoll unter Verwendung der Gewebeanker in dieser Studie, die SNR des Aufzeichnungs der PMEA steigt bis zu einem Bereich von etwa 20 bis 30 dB (Figur 5), die einen höheren SNR im Vergleich zu den flach-Elektrodenanordnungen mit hat ein Wert von 10 bis 15 dB ^11,18. Die Fähigkeit, den Hippocampus zu entfalten ist notwendig, um zu erhalten, eine Schicht von Nervenzellen (CA1-CA3), die durch eine flache Aufzeichnung Array abgefragt werden können.

Da ferner die Siliziumarray ist auf einem transparenten Substrat aufgebaut, spannungsempfindlichen Farbstoff bildgebendes Verfahren kann im PMEA-System integriert werden, um die Vermehrung von neuralen Aktivität im Hippocampus ⁸ studieren. Transgene Mäuse, die mit fluoreszierenden spannungsempfindliche Indikatoren können auch verwendet werden, um den Ursprung und die Ausbreitung des Signals unter physiologischen Bedingungen sowie Veränderungen von pharmacologi induzierte untersuchencal Mittel oder gentechnisch veränderten Gewebe von verschiedenen Tiermodellen ^9.

Es gibt einige wichtige Schritte, um eine hohe Qualität der Aufnahme zu gewährleisten. Erstens, um die Gewebelebensfähigkeit zu gewährleisten, das chirurgische Verfahren ist so rasch wie möglich durchgeführt werden. Normalerweise dauert es etwa 1 bis 2 min, um durch alle Schritte ab 2.1) bis 2.10) gehen. Praxis des sich entfaltenden Verfahren auf einigen Beispiel Tieren wird dringend empfohlen, bevor die eigentliche experimentelle Chirurgie durchgeführt wird. Zweitens die Strömungsgeschwindigkeit muss konstant gehalten werden, um jede Veränderung der Höhe der Perfusionsflüssigkeit in der Aufzeichnungskammer zu vermeiden. Weiterhin sollte das Gewebe nach unten verankert sein, um die Bewegung des Gewebes relativ zu der Anordnung zu vermeiden.

Obwohl die hier beschriebenen PMEA können Nutzsignale der Überwachung der neuronalen Ausbreitung im entfalteten Hippocampus bereitzustellen, gibt es einige Nachteile und Einschränkungen dieser Aufzeichnungsmethode.

Erstens, Die Mikroelektroden kann durch die mechanische Kraft, die an sie gestellt (5D, E) zu brechen. Während des Verfahrens des Gewebes Platzierung und Entfernung könnte die zufälligen Kontakt zwischen dem kleinen Pinsel und Palette verursachen die Mikroelektroden zu verbiegen oder brechen. Wenn die Gewebeanker wird durch den Mikromanipulator abgesenkt könnte die horizontale Bewegung des Gewebes entlang der Boden der Kammer eine Scherkraft, die auf Biegung oder Bruch der Elektroden führen könnte. In einer zukünftigen Gestaltung sollten die Mikroelektroden mit einem etwas dickeren Basisumgeformt werden sie stärker zu machen. In der aktuellen Version dieses PMEA, müssen die Aufzeichnungselektroden eine schmale Basis im Vergleich zu seinem Durchmesser ¹³ und damit eine Schwächung der Elektroden (3A).

Der Reinigungsvorgang sollte ebenfalls verbessert, um die restliche Gewebe und Fasern, die in das Array anhängen könnte ausreichend zu entfernen. Nach jedem Versuch wurden kleine StückeGewebe könnte den Mikroelektroden verbunden bleiben und dieser Restgewebe links auf den Elektroden entfernt werden. Wenn diese verbleibenden Gewebe nicht entfernt werden, kann die Impedanz der Elektroden und das SNR der Aufzeichnungen beeinträchtigt. Spülen der Anlage mit destilliertem Wasser wird vorgeschlagen, wie in Teil 5 des Protokolls Abschnitt angegeben. Benutzer werden auch empfohlen, um das System mit etwas schwach saurer Lösung, die das Gewebe, ohne die System auflösen kann bündig

Ein weiterer Nachteil dieses Protokolls ist, dass während des Entfaltungsvorganges der perforans in dieser entfalteten Hippocampus geschnitten wird, verhindert Untersuchung der möglichen neuronalen Signale von DG zu den anderen Schichten des Hippokampus ausbreitet.

Zusammenfassend haben wir hier ein neues Verfahren beschrieben, um die Vermehrung von neuralen Aktivität im Hippocampus durch Kombinieren eines hohen Aspektverhältnisses Mikroelektrodenanordnung mit ungefalteten hippocampalen tissu untersuchene. Das Verfahren führte zwar zu einem besseren Verständnis, wie die neuronale Aktivität kann sowohl in Längs- als auch in Querrichtung ausbreiten kann. Diese Technik könnte auch für Rindengewebe in ähnlicher Weise auf der Oberseite des Arrays angeordnet aufgebracht werden. Außerdem kombiniert optische Aufzeichnungstechnik mit dieser Zubereitung ist möglich, da die Anordnung ist transparent und kann auch auf einige wichtige Erkenntnisse über die Signalausbreitung in neuralem Gewebe führt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.