Abstract
Genexpression und ihre Regulation sind sehr wichtig, um das Verhalten von Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen. Verschiedene Techniken werden heute verwendet werden, um Genexpression zu untersuchen, aber die meisten sind in Bezug auf die Bereitstellung einen allgemeinen Überblick über die Expression des gesamten Transkriptoms begrenzt. DNA-Microarrays bieten eine schnelle und Wirtschaftsforschung-Technologie, die einen vollständigen Überblick über globale Genexpression gibt und haben eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Identifizierung neuer Gene und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, Charakterisierung der Transkriptionsaktivität der Zellen und auch dazu beitragen, bei der Analyse von tausenden von Genen (in einem einzigen Experiment). In der vorliegenden Studie, die Bedingungen für bakterielle Transkriptomanalyse von Zellernte auf DNA-Microarray-Analyse optimiert. Unter Berücksichtigung der Zeit, Kosten und Genauigkeit der Experimente, erweist sich diese Technologie-Plattform als sehr nützlich und universell applicabale zur Untersuchung bakterieller transcriptomes. Hier führen wir DNA-Microarray-Analyse mit Streptococcus pneumoniae als Fallstudie durch Vergleich der Transkriptionsreaktionen S. pneumoniae in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von L-Serin in dem Medium gezüchtet. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Macaloid Verfahren unter Verwendung eines RNA-Extraktions-Kit und die Qualität der RNA isoliert wurde unter Verwendung eines RNA-Qualitätskontrollsatz geprüft. cDNA wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase hergestellt, und die cDNA-Proben wurden unter Verwendung eines von zwei Amin-reaktive Farbstoff trägt. Selbst gemachte DNA Microarray-Slides wurden für die Hybridisierung der markierten cDNA-Proben und Mikroarray-Daten verwendet wurden unter Verwendung eines cDNA-Mikro Datenvorverarbeitung Rahmen (Microprep) analysiert. Schließlich Cyber-T verwendet wurde, um die erzeugten Verwendung Microprep zur Identifizierung statistisch signifikant unterschiedlich exprimierten Genen Daten zu analysieren. Außerdem im Haus eingebaute Software-Pakete (Pfeffer, FIVA, offenbaren, Staatsanwalt, Genome2D) wurden verwendet, um zu analysierenDaten.
Introduction
Die Untersuchung der Gesamtheit der mRNA-Häufigkeit (Transkriptom) von dem Genom eines einzelligen Organismus oder einer eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter einer bestimmten Bedingung codiert, einschließlich Gen-Überexpression oder Knock-out wird Transkriptomik bezeichnet. Transcriptomics ermöglicht es uns, in welchem Umfang Gene werden unter einer bestimmten Bedingung zu einem Zeitpunkt X ausgedrückt beobachten und gibt uns Informationen darüber, wie stark die Gene in Bezug auf einen Referenz ausgedrückt.
Ein Mikroarray ist ein zweidimensionales Array auf einem festen Substrat (in der Regel ein Glasobjektträger oder Silizium-Dünnschichtzelle), die verwendet werden kann, um große Mengen an biologischem Material Assay unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screening, und miniaturisierte, gemultiplext und parallele Verarbeitung und Detektion Methoden. Microarrays sind in verschiedenen Typen, einschließlich DNA-Microarrays, Protein-Microarrays, Peptidchips, Tissue Microarrays, Antikörper-Mikroarrays, Zellmikroarrays und andere. Ein DNA-Microarray istim Grunde eine Anordnung von mikroskopischen DNA-Spots an eine feste Oberfläche, üblicherweise Glas fixiert. DNA-Mikroarrays verwendet, um die Expression von einem Gen oder einer Reihe von Genen gleichzeitig zu messen oder mehrere Regionen eines Genoms 2,3 genotypisieren. Picomol (10 -12 mol) einer Sonde innerhalb der einzelnen DNA Stelle, die eine bestimmte DNA-Sequenz, die auch als Reporter bekannt repräsentiert vorhanden. Die markierten mRNA-Moleküle aus den Proben werden "Ziele" bezeichnet. Fluorophore verwendet werden, um Sonden-Target-Hybridisierung und Detektion von Fluorophor-markierte Targets zur Messung bestimmt die relative Häufigkeit von Nukleinsäuresequenzen in dem Ziel. Ein Mikroarray kann mehrere genetische Tests parallel zu erreichen, weil eine Anordnung kann Zehntausende von Sonden enthalten. Der Aufbau eines einfachen Mikroarray wird in Abbildung 1 gezeigt. Kürzlich konnte in unseren Laboren und anderen festgestellt, daß sich diese Anordnungen sind wiederverwendbar, die diese Technik sehr kostengünstig macht Wirksame.
8 - verschiedene RNA-Isolierung und Reinigungsverfahren sind im Laufe der Jahre, einschließlich C-TAB, SDS und GT Methoden 4 entwickelt. Darüber hinaus sind auch mehrere kommerzielle Kits zur Verfügung. Für Genexpression qualitativ hochwertige RNA ist sehr wichtig. Daher werden die RNA-Isolationsverfahren modifiziert, um eine maximale Menge an RNA zu erhalten. In ähnlicher Weise werden die Schritte für die cDNA Herstellung und Kennzeichnung von cDNA minimiert. Die Normalisierung der Daten nach dem Scanvorgang wird auch effizient durch die Verwendung in-Haus gebaut Softwarepakete und Tools 9 durchgeführt.
Streptococcus pneumoniae ist ein Gram-positiven menschlichen Erreger der Nasenrachenraum besiedelt und ist die Ursache für mehrere Infektionen wie Lungenentzündung, Sepsis, Mittelohrentzündung und Meningitis 10. Das Bakterium kann eine Vielzahl der für das Wachstum und Überleben 11,12 erforderlichen Nährstoffe zu nutzen. Eine Reihe von Untersuchungen wurden an das mitgeführtePneumokokken-Stickstoff-Stoffwechsel und Regulation die Bedeutung der Aminosäuren und ihre Rolle in der Virulenz 13,14. In dieser Studie wurde die transkriptomischen Antwort S. pneumoniae an wechselnde Konzentrationen von L-Serin, einem Aminosäure reichlich im menschlichen Blutplasma vorhanden ist, wird berichtet, unter Verwendung von DNA-Mikroarrays. Das Transkriptom Antwort von S. pneumoniae in einer minimalen Konzentration von L-Serin (150 um) aufgewachsen wurde, daß sich eine maximale Konzentration (10 mM) von Serin gewachsen verglichen. Chemisch definierten Medium (CDM oder Minimalmedium) 15 wurde für diese Untersuchung verwendet, um die Konzentration von Serin zu steuern. Der Schwerpunkt dieser Studie ist es, diese Technik benutzerfreundlich zu machen und verschiedene Werkzeuge für die Datennormalisierung und Analysen. Daher wurden eine Reihe von Werkzeugen für die Analyse und die Interpretation der Daten entwickelt. FIVA (Functional Information Viewer und Analyzer) bietet eine Plattform für die Verarbeitung von Informationen in Gruppen von Genen enthalten habenähnliches Genexpressionsmuster und zum Konstruieren Funktionsprofile 16. STAATSANWALT ist ein weiteres Softwarepaket, das die Identifizierung der mutmaßlichen Funktionen und Annotationen der Gene 17 erleichtert. Durch die Verwendung von Clusterverfahren, offenbaren eine DNA-Bindungsstelle-Erkennungsalgorithmus. Cis: Rechts Motive der Gene kann durch Verwendung dieses Algorithmus 18 projiziert werden. Genome2D bietet eine Windows-basierte Plattform für die Visualisierung und Analyse von Transkriptom-Daten, indem sie verschiedene Farbpaletten, um die Veränderungen in der Genexpression Ebenen auf einem Genomkarte 19 zu charakterisieren. Der Pfeffer Webserver bietet, zusätzlich zu den all-in-one-Analyseverfahren, einem Werkzeugkasten für den Bergbau für Regulons, Promotoren und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 20. Voll Annotation von intergenischen Regionen in einem bakteriellen Genom kann mit diesem Paket erzielt werden. Biologen können stark von Pfeffer profitieren, da sie bietet ihnen eine Plattform für die Entwicklung Experiments, so dass der hypothetische Informationen können in vitro 20 bestätigt werden. Diese Softwarepakete tragen wesentlich zur Microarray-Analyse, wie die meisten von ihnen sind frei verfügbar und machen die Datennormalisierung und Analyse sehr zuverlässig.
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Protocol
1. Vorbereitung der Medien und Zellkultur
- Wachsen S. pneumoniae D39 Wildtyp-Stamm 21, wie zuvor 11 beschrieben. Beimpfen von Zellen bei -80 ° C in 10% Glycerin (mit 1/100 Verhältnis in 50 ml sterile Röhrchen) in 50 ml chemisch definiertem Medium (CDM) mit einem End-pH von 6,4 15 gespeichert, aber ohne L-serin aus dem Aminosäure Mischung.
Hinweis: zwei verschiedene CDM verwendet wurden; eine mit einer Mindestkonzentration von L-Serin (150 uM), und die andere, die eine maximale Konzentration von L-Serin (10 mM). Diese Mindestkonzentration ist im Allgemeinen die Konzentration von L-Serin im menschlichen Blutplasma, und das Ziel ist es, die Genexpression von S. vergleiche pneumoniae D39-Stamm unter diesen beiden Bedingungen.
2. Isolierung von Gesamt-RNA
- Materialien
- Verwenden Säure Phenol, RNA-Note für die Isolierung von Gesamt-RNA.
- Macaloid:
- Suspend 2 GrammMacaloid in 100 ml TE und kochen für 5 min. Abkühlen auf RT und beschallen bis Macaloid gels.Centrifuge die Lösung bei 2000 × g für 5 min bei RT, Resuspendieren in 50 ml TE pH 8 und bei 4 ° C.
- Lösungen:
- Behandeln Sie alle Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC). 100 l DEPC / 100 ml Lösung, Inkubation O / N bei 37 ° C und Autoklaven für 15 min.
- Methodik
- Wachsen 50 ml S. pneumoniae D39 Zellkultur in 50 ml-Röhrchen bei 37 ° C (ohne Schütteln) bis Mitte exponentiellen Phase (OD ~ 0.3). Centrifuge Kulturen bei 4 ° C auf 10.000 × g für 2 min. Entsorgen Medien und unverzüglich sperren Zellpellets in flüssigem Stickstoff.
- Vormischung 300 ul Chloroform: IAA (24: 1) und 300 & mgr; l Phenol (Säure Phenol, RNA-Qualität). Verwenden 500 & mgr; l der organischen Phase in Schritt 2.2.3.
- Bereiten Sie die folgende Mischung im Voraus in RNA-free-Schraube Kappe Rohre: 00,5 g Glasperlen, 50 ul 10% SDS, 500 ul Phenol / Chloroform: IAA (wie in Schritt 2.2.2 vorbereitet), Macaloid Schicht (150 bis 175 & mgr; l, nicht fordern, wie es ist sehr viskos). Resuspendieren der Zellpellets in 400 ul TE (DEPC) und fügen Sie die resuspendierten Zellen in den Schraubverschluss Röhrchen.
- Um die Zellen zu brechen, legen Sie die Schraubverschluss Röhrchen in einem Kugelmühle für 2x 60 "Impulse (" homogenisieren ") mit 1 min Pause auf dem Eis. Zentrifuge werden die Proben für 10 min bei 10.000 × g (4 ° C).
- Wird die obere Phase in ein frisches Röhrchen, 500 ul Chloroform: IAA (24: 1) und Zentrifuge 5 min bei 10.000 × g (4 ° C).
- Übertragen Sie 500 ul der oberen Phase in frische Röhrchen, fügen Sie 2 Volumina (1 ml) der Lyse / Bindungspuffer und mischen durch Auf-und Abpipettieren. Isolieren der Gesamt-RNA unter Verwendung der RNA-Isolierung Kit und folgen Sie den Hersteller empfohlenen Protokoll.
3. RNA Cleanup
< ol>4. Analyse der RNA
- Bestimmen Sie die Konzentration der RNA auf einem Spektrophotometer. Bestimmen die Qualität der RNA durch die Verwendung eines Assay folgendermaßen (Abbildung 2).
- Verdünnen Sie 1 ul Probe mit 50 ul DEPC-Wasser auf eine Konzentration von 20 bis 200 ng / ul erhalten.
- Verwenden Sie 1 ul verdünnt RNA-Probe, um die Qualität auf dem Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu überprüfen.
- Hinweis: ein Verhältnis von 23S: 16S von etwa 2,0 als gut 1 A260 Einheit RNA entspricht 40 & mgr; g / ml.. Eine empfohlene Menge für Kennzeichnung ist 10-20 & mgr; g.
5. cDNA Vorbereitung und Kennzeichnung
ntent "> Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für die cDNA-Zubereitung und Kennzeichnung gefolgt.- Glühen
- Führen Annealingreaktion in 300 ul PCR-Röhrchen, wobei die Konzentration von Gesamt-RNA von 10 bis 15 & mgr; g für hausgemachte Dias oder 5 ug für Unternehmen gemachten Folien. Mix-RNA mit 2 & mgr; Zufalls Nonamere (1,6 pg / pl) und fügen Sie Nuklease-freies Wasser, wenn notwendig, die endgültige Volumen des Glühen Mischung auf 18 & mgr; l zu halten.
- Halten Sie die Annealing-Mischung bei 70 ° C für 5 min. Danach kühlen die Mischung auf RT für 10 min (Annealing) und, wenn nötig, Spin-down die Reaktionen auf den Boden des Rohrs. Platzieren Sie die Reaktionsröhrchen auf Eis für mindestens 1 min.
- Reverse Transkription
- Bereiten Sie die Reverse-Transkriptase-Mischung wie folgt: 18 & mgr; Glühen Mischung, fügen Sie 12 ul-Master-Mix (bestehend aus 6 ul 5x First Strand Buffer, 3 ul 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x AA-dUTP / Nukleotid-Mischung und 1,8 ul Reverse transcriptase (1 ul für Unternehmen gemachten Folien). Halten Sie die Reaktionsmischung für 2-16 h bei 42 ° C.
6. Abbau von mRNA und Reinigung von cDNA
- Um die mRNA aus dem Reaktionsgemisch verschlechtern, werden 3 ul 2,5 M NaOH, bei 37 ° C für etwa 15 min. Nach Zusatz von 15 ul 2 M HEPES-freie Säure, um die NaOH neutralisieren.
- Reinige den cDNA-Gemisch unter Verwendung von PCR Clean-up-Säulen und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
7. Messung der cDNA-Konzentration
- Messen cDNA Konzentrationen auf einem Spektrophotometer. Um mit Beschriftungs weiterhin sicherstellen, dass die Konzentration der cDNA mindestens 60 ng / ul (hausgemachte Folien) oder 20 ng / ul (Unternehmen gemachten Folien).
8. Kennzeichnung von cDNA mit aminreaktiven Farbstoff und Reinigung
- Verwenden aminreaktiven Farbstoffes, um die cDNA zu markieren. Direkt mischen die cDNA mit einem Aliquot (5 ul)Amin-reaktive Farbstoff.
- Inkubieren der Mischung bei RT im Dunkeln für 60 bis 90 min und direkt auf die Reinigung von Farbstoff-markierten cDNA. Reinige farbstoffmarkierte cDNA unter Verwendung von PCR Clean-up-Säulen und nach Herstellerprotokoll. Eluieren cDNA in 50 & mgr; l Elutionspuffer.
9. Messung der markierten cDNA
- Verwenden eines Spektrophotometers, um den Einbau von aminreaktiven Farbstoffen in das cDNA messen. Überprüfen, dass die Konzentration von Amin-reaktiven Farbstoffe mindestens 0,5 pmol / ul in einem Gesamtvolumen von 50 ul.
10. Mischen von markierten cDNA-Proben
- Für hausgemachte Folien, verwenden alle markierten cDNA zur Hybridisierung mit nicht mehr als 30% Unterschied in der cDNA-Konzentration. Für Unternehmen gemachten Folien verwenden cDNA mit nicht mehr als 2-fachen Unterschied in der cDNA-Konzentration.
Anmerkung: In der Regel werden etwa 300 ng cDNA für Firmen hergestellte Folien benötigt, was im Vergleich zu dem req sehr weniguired Menge an cDNA für hausgemachte Folien.
11. Die Hybridisierung und Waschen
- Verwenden Sie die folgenden Reagenzien: demi Wasser, Ethanol 99%, schüchtern Buffer (hausgemachte, mit 40 ul Hefe-RNA). Bereiten maximal 1 ml SHY.
- Geräte und Lösungen Zubereitung
- Schalten Sie Vakuumkonzentratoren und Heizung mindestens 1 Stunde vor dem Trocknen. Schalten Sie Hybridisierungsofen, mit auf den richtigen Hybridisierungstemperatur eingestellten Sollwert (für S. pneumoniae DNA-Microarrays, verwenden 45 ° C). Ebenso vorheizen Hybridisierung Kassette und Ofen für 30-60 Minuten.
- Heizen Sie SHY Puffer bei 68 C für mindestens 30 min.
- Probenvorbereitung (markierter cDNA)
- Kombinieren Sie gleiche Mengen von markierten cDNAs (max 30% Unterschied). Trocknen Sie die Probe mit Hilfe der Vakuum-Konzentratoren bei hoher Temperatur (ca. 40 Min.), Bis das Volumen ist kleiner als 7 & mgr; l.
- Lifter-Rutsch-
- Verwenden Sie saubere Heber rutscht.Anmerkung: ± 30 & mgr; l auf die Objektträger eingelegt werden.
- Reinigen Sie die Heber-Zettel mit Seife, reichlich Leitungswasser und 100% Ethanol. Hinweis: Schmutzige Heber rutscht geben Hoch Hintergrund.
- Lufttrocknen Heber-Zettel mit Luftpistole wegblasen Staubpartikel. Ein sauberes Heber-Rutsch auf der Folie mit dem weißen Teflon-Auskleidung an den Seiten zeigen nach unten.
- Hinzufügen Hybridisierungspuffer (zum markierten cDNA)
- Man löst die getrocknete Farbstoffproben in 7 ul H & sub2; O und Inkubation bei 94 ° C für 2 min.
- Unmittelbar, fügen 35 ul vorerhitzt SHY-Puffer (68 ° C), sanft und Schleuder Mischen bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min auf der Ausscheidungen loszuwerden. Heizen Sie die Sonde bei 68 C etwa 5 min bis zum Verladen.
- Slide-Lifter-Rutsch-Montage und Vorwärmung.
- Legen Sie die Hybridisierung Diahalter auf einem Wärmeblock bei 50 ˚C. Zeigen DNA Microarray-Slides mit dem Lifter-Slip auf der beheizten Hybridisierung Diahalter und perwärmen Sie die Folie mit Lifter-Rutsch für eine Minute. Führen Sie die weiteren Schritte so schnell wie möglich.
- Man fügt 40 ul der Probenziel zu dem Ende der Rutsche. Lassen Sie die Flüssigkeit zwischen den Glasflächen durch Kapillarkräfte fließt. Führen Sie alle Pipettieren langsam und vorsichtig.
- Halten Sie die Folien mit Lifter feste horizontale jederzeit und bewegen sich langsam, um sicherzustellen, dass der Heber-Rutsch bewegte sich nicht.
- Nehmen Sie die vorgewärmte Hybridisierungskassette aus dem Hybridisierungsofen und schließen Sie das Gerät. Platz Filterpapier mit 3 ml 2 × SSC (Standard-Kochsalzlösung-Citrat) in der Hybridisierungs Kassette eingeweicht.
- Legen Sie vorsichtig die Hybridisierung Diahalter mit Rutschen in der Hybridisierungs Kassette. Schließen Hybridisierung Kassetten und in der Hybridisierung setzen Ofen erneut (für ca. 16-18 h).
- Slide Wasch
- Bereiten Sie frischen Waschpuffer I, II und III (750 ml pro Waschschritt). Für 500 ml Waschpuffer I, verwenden Sie 2 x SSC / 0,5% SDS. Für 500 ml Wasch Buffäh II, verwenden Sie 1 x SSC / 0,25% SDS. Für 500 ml Waschpuffer III, verwenden Sie 1 x SSC / 0,1% SDS (optional)
- Legen Sie die Waschpuffer bei 30 ° C (um sicherzustellen, dass SDS gelöst ist).
- Tauchen Sie die Folien so schnell wie möglich, aber sehr leicht, in einem Falcon-Röhrchen mit 50 ml gefüllten Waschpuffer I, bis das Glas ruht auf dem konischen Boden des Röhrchens.
- Nach ein paar Sekunden, wenn der Heber-slip sinkt auf den Boden des Röhrchens, nehmen Sie die Folie mit einer Pinzette, ohne zu kratzen das Array und im Rack der Waschstation setzen. Fahren Sie mit dem Waschen ohne Zeitlücke.
- Waschen Sie die Objektträger für 5 min in 500 ml Waschpuffer I (in einer Waschstation). Geben Sie ihm einen zweiten Wasch 20-30 min in 500 ml Waschpuffer II (in einer Waschstation). Ebenso, waschen Sie die Objektträger für 5 min in 500 ml Waschpuffer III (optional) (in einer Waschstation).
- Trocknen der Objektträger für 2 min bei 2.000 Upm.
12. Microarray-Analyse
- Scannen von Bildernmit jeweiligen Wellenlängen in Scanner und speichern Sie in einem Ordner "Jove Project".
- Verwenden Sie Software, um die gescannten Dateien zunächst analysieren, wie zuvor beschrieben, 22. Nach dem Ausführen der Software, wählen Sie die Registerkarte "Bild öffnen", um den Rote-Image-Datei (-.550) als "Rot" und grünen Bilddatei (-.635) so laden "Grüne". Laden Sie die Datei gal (.gal) mit S. pneumoniae Array-Liste auf Image-Datei, indem Sie "Load Array List" Lasche 22.
Hinweis: Diese Liste Array bestand aus 48 Gitter, auf jeden Gitter gab es 16 Zeilen und 15 Spalten. Jeder Punkt in der Startaufstellung steht ein einzelnes Gen und Spot Information einschließlich Gen-Name wird durch eine Punktbeschreibungsdatei hinzugefügt. Die Punktzahlen werden von links nach rechts und von oben nach unten gegeben. - Nach sorgfältiger Auffinden des Grids, wählen Sie das Register "Suchen Array, finden Blocks, Richten Eigenschaften", um die Spots auszurichten. Nach dem Ausrichten alle Funktionen, analysieren das Bild, indem Sie die "Analyse" tab. Erstellen Sie eine neue Datei mit Ergebnissen, Histogramm und Streudiagramm. Speichern Sie diese Datei aus Reiter "Ergebnisse speichern unter" als .gpr Datei zur weiteren Analyse.
- Führen Sie weitere Normalisierung und Verarbeitung von Daten mit selbst entwickelten Microprep Software-Paket wie beschrieben 9.
- Verwenden unabhängigen biologischen Replikaten für die DNA-Microarray-Daten, die farbstoff vertauscht sind. Führen CyberT Umsetzung einer Variante des t-test1 und berechnen False Discovery Raten (FDR), wie beschrieben, 9.
- Auf differentiell exprimierte Gene, nehmen p <0,001 und FDR <0,05 als Standard.
- DNA-Microarray-Daten Laden Sie am NCBI Einreichung Seite, um ein GEO (Gene Expression Omnibus) Zugangsnummer zu bekommen.
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Representative Results
RNA, cDNA-Isolationen und Analyse
L-Serin ist eine der essentiellen Aminosäuren, und seine Konzentration im menschlichen Blutplasma variiert von 60 bis 150 & mgr; M bei Kindern und Erwachsenen. Seine Rolle bei der Biosynthese von Purinen und Pyrimidinen hebt seine Bedeutung im Stoffwechsel und es ist ein Vorläufer von verschiedenen Aminosäuren (Glycin, Cystein und Tryptophan). Um die Wirkung von L-Serin auf die gesamte Transkriptom S. studieren pneumoniae D39 Wildtyp-Stamm, Microarray-Analyse der D39-Stamm im CDM mit einer Mindestkonzentration (150 uM) von L-Serin gegen die in einer maximalen Konzentration (10 mM) in der gleichen Medium gezüchtet wurde durchgeführt. Zuallererst Gesamt-RNA aus Zellen, die unter beiden Konzentrationen gezüchtet wurde isoliert. Die Konzentrationen der RNA-Proben sind in Tabelle 1 angegeben. Die Qualität der Gesamt-RNA wurde mit der Qualitätskontrolltest untersucht. RNA mit DNase I behandelt, bevor dieseAssay, um die mögliche genomische DNA zu entfernen 2 zeigt die Qualität der RNA. Spur L für die Leiter, Bahnen 1 und 2 stellen RNA von 150 uM Serin und Bahnen 3 und 4 stellen die RNA aus 10 mM Serin. Das Vorhandensein von zwei deutliche Banden entsprechend den beiden RNA-Untereinheiten zeigten die gute Qualität der RNA und der nächste Schritt des Experiments durchgeführt werden konnten.
Nach der Messung der Qualität der RNA, cDNA-Synthese wurde durchgeführt. cDNA wurde unter Verwendung von Zufalls Nanomere und Enzym Reverse Transkriptase gebildet wird. Die Konzentrationen der cDNA-Proben sind in Tabelle 1 angegeben. Diese cDNA wurde mit aminreaktiven Farbstoffen markiert, und die Konzentrationen der markierten cDNA und Farbstoffmarkierungen sind in Tabelle 1 angegeben. Nach der Markierung wurden die Proben entsprechend gemischt und dann hybridisiert. Nach dem Waschen wurden die Objektträger mit dem Scanner eingelesen und Auswertung erfolgte mit Gene Pix Pro-Software. Abbildung 3 zeigt die StreuungPlot-Analyse der aminreaktive Farbstoffe Verhältnis. Nach der ersten Analyse wurden die Daten weiter mit dem PicroPrep-Software-Paket (PrePrep, Prep, PostPrep) 9, um Rauschen und Cyber-T zu verringern, wurde für die endgültige Analyse analysiert. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Mikroarray-Studien nach der Anwendung der Kriterien von ≥ 2,0 fache Differenz und p-Wert <0,001. Eine Anzahl von Genen, die differentiell in Gegenwart von mindestens L-Serin exprimiert, verglichen mit dem Maximum (Tabelle 2).
Figur 1 eine Übersicht der DNA-Mikroarray-Technologie. RNA wird aus der Kontrolle und den Zielproben isoliert und markierten cDNA wird dann hybridisiert.
Abbildung 2.Qualitätskontrolle von RNA isoliert aus S. pneumoniae D39-Zellen in Gegenwart von mindestens (150 uM) und maximalen (10 mM) Serin-Konzentrationen gezüchtet. Lane L die Größe Leiter wohin Spur 1 und 2 stellen RNA-Proben von Zellen in Gegenwart von mindestens Serinkonzentration getrennt gewachsen. Ähnlich, Spur 3 und 4 stellen RNA-Proben von Zellen in Gegenwart von maximal Serinkonzentration getrennt gewachsen. Die Bänder stellen die 23S und 16S-rRNA. Das Vorhandensein von nur zwei Banden zeigt, daß es keine Kontamination gDNA und RNA von guter Qualität ist.
Abbildung 3. Array Vergleich Streudiagramm einer Probenmischung. Jeder Punkt in der Handlung stellt den Ausdruckswert bedeuten (log2) eines Gens in einem Versuch mit Farbstoff 1 auf der y-Achse und Farbstoff 2 auf der x-Achse.
| Beispiel | RNA-Probe | Beschreibung | RNA-Konzentration (ng / ul) | cDNA-Konzentration (ng / ul) | Die markierten cDNA (ng / ul) | DyLight-550 (pmol / ul) | DyLight-650 (pmol / ul) | Hybridisierungsschema |
| S1 | R1 | D39 Wildtyp in CDM + Mindest L-Serin gewachsen | 2057 | 255 | 225 | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 Wildtyp in CDM + Mindest L-Serin gewachsen | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 Wildtyp in CDM + Maximale L-Serin gewachsen | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | D39 Wildtyp in CDM + Max gewachsenimum L-Serin | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Tabelle 1. Hybridisierung Schema der in der Microarray-Analyse verwendeten Proben.
| Gene ein | Funktion b | Verhältnis c | |||
| SPD0600 | Zellteilungsprotein DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Phosphoglyceratkinase | 3.5 | |||
| SPD0646 | Hypothetisches Protein | 3.4 | |||
| SPD0873 | Hypothetisches Protein | 3.3 | |||
| SPD1223 | Hypothetisches Protein | 3.3 | |||
| SPD0980 | Ribose-Phosphat pyrophosphokinase 2.8 | ||||
| SPD1628 | Xanthin-Phosphoribosyltransferase | 2.7 | |||
| SPD1011 | Glycerat Kinase | 2.4 | |||
| SPD0645 | Hypothetisches Protein | 2.3 | |||
| SPD0564 | Hypothetisches Protein | 2.2 | |||
| SPD0641 | Mannose-6-Phosphat-Isomerase, Klasse I, Mana | 2.1 | |||
| SPD1333 | Hypothetisches Protein | 2.1 | |||
| SPD1384 | Kationen-Efflux-Protein-Familie | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP Glukose 4-Epimerase, GalE-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-Acetylglucosamin-6-Phosphat-Deacetylase, Naga | 2.1 | SPD0104 | LysM Domänenprotein | 2 |
| SPD0140 | ABC-Transporter, ATP-bindenden Proteins | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidase C, PEPC | 2 | |||
| SPD1350 | Hypothetisches Protein | 2 | |||
| SPD1822 | Ribosomale großen Untereinheit Pseudouridin Synthase, RluD Familie Protein | 2 | |||
| SPD0453 | Typ-I-Restriktions-Modifikationssystem, S-Untereinheit | -2 | |||
| SPD0459 | Hitzeschockprotein GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | Sensor Histidinkinase, putative | -2,1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hydroxyacyl- (Acyl-Carrier-Protein) Dehydratase FabZ | -2,2 | |||
| SPD1494 | Zucker ABC-Transporter, Permease Protein | -2,2 | |||
| SPD0974 | Klasse-I-Glutamin-Amidotransferase, putative | -2,4 | |||
| SPD1600 | Anthranilat-Phosphoribosyltransferase | -2,5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-tRNA-Synthetase | -2,6 | |||
| SPD0681 | Hypothetisches Protein | -2,7 | |||
| SPD0501 | Transcription Antiterminator, LICT | -3,4 |
Tabelle 2. Liste der Gene in der Transkriptom Vergleich S. geregelt pneumoniae Stammes D39 Wildtyp in CD gewachsenM 15 mit minimalen Konzentration von L-Serin und CDM-15 mit einer maximalen Konzentration von L-Serin. Ein Gen Zahlen beziehen sich auf D39-Locus-Tags. B D39 Anmerkung / TIGR4 Anmerkung 21. C Verhältnis stellt die fache Zunahme / Abnahme der Expression von Genen, in CDM-Maximum im Vergleich zu CDM-Minimum (Minuszeichen Herunterregulation).
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Discussion
Wir beschreiben eine benutzerfreundliche Protokoll, angewendet werden können, um ganze Transkriptomanalyse von Bakterien durchzuführen. Der entscheidende Punkt dieser besonderen Technik ist, dass die Bedingungen, unter denen die Zellen geerntet variieren. Nach der Ernte der Zellen und RNA-Isolation, wird diese Technik gleich für alle Arten von Bakterienproben und folgt genau identische Schritte, und daher kann auf jede Art von Bakterienkulturen angewendet werden. Das Protokoll ist sehr einfach und bequem und beginnt von der RNA-Isolierung. Unsere RNA Isolation Protokoll (unter Verwendung eines Macaloid und RNA Isolation Kit) zeiteffektiv im Vergleich zu herkömmlichen Phenol-Chloroform und Trizol Methoden. Im nächsten Schritt wird die Herstellung von cDNA mit Transkriptase III-Enzym durchgeführt. Als nächstes wird die Kennzeichnung von cDNA durch zuerst Mischen der cDNA mit aminreaktiven Farbstoffen erfolgt, und dann das Reinigen des markierten cDNA. Die Kennzeichnung ist ebenfalls einfach und dauert nicht viel Zeit, wie die Proben müssen für ca. 1 inkubiert werdenh im Dunkeln. All diese Schritte können in jedem Standard-Labor durchgeführt werden, da es keinerlei spezielle Ausrüstung erfordern. Ein Microarray-Scanner benötigt wird, um Dias scannen. Für Dia Scannen und Analyse wird die GenePix Pro Programm verwendet, die eine sehr einfache und benutzerfreundliches Programm 22 ist.
Nach all der Versuche wurde die Analyse unter Verwendung Microprep und CyberT. Die Microprep Paket besteht aus drei Modulen, dh PrePreP, PreP und PostPreP 9. Diese Daten-Vorverarbeitung Rahmen verringert die für die Normalisierung der Daten und reduziert auch die Menge der verworfenen Daten. Die Leichtigkeit, mit der die Software benutzt werden kann ist es möglich, für den Forscher, um ein Verständnis der DNA-Microarray-Daten in minimale Zeit. Es dauert nur ein paar Minuten, um die Roh-Signaldaten in qualitativ hochwertige Daten für die Weiterverarbeitung zu konvertieren, nachdem slide image Analyse durchgeführt wird. Eine weitere Analyse auf der Pool von Genen im MICR geregeltoarray kann mit verschiedenen hauseigenen Softwarepaketen durchgeführt werden. Dazu gehören Pfeffer 20, FIVA 16. OFFEN 18, 17 und STAATSANWALTSCHAFT Genome2D 19. Diese Windows-basierten Tools und Softwarepakete sind benutzerfreundlich und bieten tiefe Einblicke in die Daten während der weiteren Untersuchung. Diese Softwarepakete machen es sehr einfach und praktisch für die Forscher, diese Technologie zu nutzen, da die Daten viel mehr sinnvoll und relevant wird.
Die in Mikroarrays verwendeten Farbstoffe sind bekannt anfällig einem ozon Wirkung, falls die Farbstoffe instabil in Gegenwart von Ozon und der Signalstärke ist so gering, dass es nicht durch den Scanner erkannt werden. Aminreaktive Farbstoffe, die weniger empfindlich gegenüber dem Ozoneffekt sind, verwendet werden, um cDNA zu markieren. Die Lösung, um Ozon-Effekt macht diese Technologie noch besser.
Es wurde eine Liste von Genen, die Up- entstanden oder in Gegenwart des minimalen L-Ser herunterreguliertine Konzentration im Vergleich zu dem Maximum (Tabelle 2). Die hochreguliert Gene können nach Funktion ihres Produkt kategorisiert werden. Sieben davon kodieren hypothetischen Proteinen, vier in Kohlenhydrat Transport und Stoffwechsel, einen Zellteilungsprotein DivIB und bestimmte Aminosäure-Transport und den Stoffwechsel Gene beteiligt. In ähnlicher Weise gibt es auch bestimmte Gene, die in den geprüften Zustand herunterreguliert werden. A BglG Familientranskriptionsregulator LICT Einige Kohlenhydrat-Gene und einige Aminosäure-spezifische Gene sind unter den unten reguliert Gene. Ein Hitzeschock-Protein GrpE ist auch unter den herunterreguliert diejenigen. Daher stellt diese Studie einen umfassenden Überblick über die Gene differenziell unter den getesteten Bedingungen ausgedrückt. Nach Analyse der Ergebnisse, ist manchmal die Überprüfung der Ergebnisse notwendig. Dies kann entweder durch qPCR oder β-Galactosidase-Assays unter Verwendung von lacZ-Promotor-Fusionen durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Anne de Jong und Siger Holsappel für die Hilfe bei der DNA-Microarrays Schiebe Produktion. Unterstützung Anne de Jong für bioinformatische Analyse wird auch geschätzt. Wir danken auch Jelle Slager zur Überprüfung des Papiers. Muhammad Afzal und Irfan Manzoor werden von der GC-Universität, Faisalabad, Pakistan unter der Fakultätsentwicklungsprogramms der HEC Pakistan unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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