Abstract
Экспрессия генов и его регулирование очень важно понять поведение клеток в различных условиях. Различные методы используются в настоящее время для изучения экспрессии генов, но большинство из них ограничены в плане предоставления общей картины выражения всей транскриптома. ДНК-микрочипы обеспечивают быстрый и экономическое исследование технологии, которая дает полное представление о глобальной экспрессии генов и имеют огромное количество приложений, включая определение новых генов и сайтов связывания транскрипционных факторов, характеристику транскрипционной активности клеток, а также помочь в анализе тысячи генов (в одном эксперименте). В настоящем исследовании, условия для бактериальной анализа транскриптома от урожая клеток к анализу ДНК микрочипов были оптимизированы. Принимая во внимание время, затраты и точность экспериментов, это технологическая платформа оказывается очень полезным и универсальным applicabale для изучения бактерий transcriptoмес. Здесь мы проводим анализ ДНК микрочипов с Пневмококк как кейс-стади, сравнивая транскрипционные ответы S. пневмонии, выращенные в присутствии различных L-серин концентрации в среде. Общую РНК выделяли с помощью Macaloid метод с использованием набора для выделения РНК и качество РНК была проверена с помощью проверки качества РНК комплект. кДНК получали с использованием обратной транскриптазы и образцы кДНК были помечены с использованием одного из двух аминных реакционноспособных флуоресцентных красителей. Домашние микрочипов слайды ДНК были использованы для гибридизации с мечеными образцов кДНК и данных микрочипов были проанализированы с помощью рамки кДНК микрочипов предварительной обработки данных (Microprep). Наконец, Cyber-T был использован для анализа данных, полученных с помощью Microprep для идентификации статистически значимых дифференциально выраженных генов. Кроме того, в доме, построенные пакеты программного обеспечения (перец, FIVA, раскрывать, прокурора, Genome2D) были использованы для анализаДанные.
Introduction
Изучение всей совокупности мРНК изобилие (транскриптома) кодируется геном одноклеточного организма или эукариотической клетки в определенное время или при определенном состоянии, включая гена повышенной экспрессией или нокаута, называется транскриптомике. Транскриптомике позволяет наблюдать то, что гены экстентов экспрессируется под определенным состоянием в момент времени X и дает нам информацию о том, как сильно гены выражены относительно эталона.
Микрочипов является двумерный массив на твердом субстрате (как правило, предметное стекло или кремний тонкопленочных клетки), которые могут быть использованы для анализа больших количеств биологического материала с помощью высокопроизводительного скрининга, и миниатюрные, мультиплексируются и параллельной обработки и обнаружение методы. Microarrays прийти в различных типов, в том числе ДНК-микрочипов, белковых микрочипов, пептидные микрочипов, ткани микрочипов антител микрочипов, клеточных микрочипов и других. Микрочипов ДНКосновном сборка микроскопических точек ДНК фиксируют на твердой поверхности, как правило, стекла. ДНК-микрочипы используются для измерения уровня экспрессии гена или набор генов одновременно или к генотипу нескольких регионов генома 2,3. Пикомолях (10 -12 моль) зонда присутствуют в каждой точке ДНК, которая представляет собой определенную последовательность ДНК, также известный как репортер. Меченые молекулы мРНК из образцов называют «цели». Флуорофоры используются для измерения гибридизации зонд-мишень и обнаружение меченного флуорофором целей определяет относительное содержание последовательностей нуклеиновых кислот в мишени. Микрочипов эксперимент может выполнить несколько генетических тестов параллельно, потому что массив может содержать десятки тысяч датчиков. Схема простого микрочипов эксперимента показан на рисунке 1. Недавно было установлено, в нашей и других лабораториях, что эти массивы являются многоразовыми, что делает этот технику довольно затрат effectivе.
Различные методы выделения РНК и очистки были разработаны в течение многих лет, включая C-TAB, SDS и методов GT 4 - 8. Кроме того, несколько коммерческих наборов, также доступны. Для экспрессии гена РНК высокого качества очень важно. Таким образом, методы выделения РНК модифицируют, чтобы получить максимальное количество РНК. Кроме того, шаги для подготовки кДНК и маркировки кДНК сведены к минимуму. Нормализация данных после сканирования осуществляется также эффективно, используя в-дом, построенный пакеты и инструменты 9 программного обеспечения.
Пневмококк является грам-положительных человек патогенный микроорганизм, который колонизирует носоглотку и является причиной множества инфекций, таких как пневмония, сепсис, отит и менингит 10. Бактерия может использовать широкий спектр питательных веществ, необходимых для роста и выживания 11,12. Ряд исследований были проведены напневмококковая азотный обмен веществ и регулирование подчеркивая важность аминокислот и их роль в вирулентности 13,14. В этом исследовании, транскриптомных ответ S. пневмонии на изменение концентрации L-серин, аминокислота в изобилии присутствуют в плазме крови человека, сообщается с использованием ДНК-микрочипов. Транскриптомных ответ S. пневмонии выращивают в минимальной концентрации L-серин (150 мкм) по сравнению с выращивали в максимальной концентрации (10 мМ) серина. Химически определенной среде (CDM или минимальной среде) 15 использовали в этом исследовании, чтобы контролировать концентрацию серина. Целью данного исследования является сделать этот метод удобно и обеспечить различные инструменты для нормализации и анализа данных. Таким образом, количество инструментов были разработаны для анализа и интерпретации данных. FIVA (функциональный Information Viewer и Analyzer) предоставляет платформу для обработки информации, содержащейся в кластерах генов, имеющихПохожие паттерны экспрессии генов, а также для построения функциональных профилей 16. Прокурор другой программный пакет, который облегчает идентификацию предполагаемых функций и аннотации генов 17. Благодаря использованию методов кластеризации, раскрывают обеспечивает ДНК-связывающего алгоритм обнаружения сайт. СНГ -regulatory мотивы генов может быть проецируются с помощью этого алгоритма 18. Genome2D предлагает для Windows-платформы для визуализации и анализа данных транскриптом, предлагая различные цветовые диапазоны для характеристики изменений в уровнях экспрессии генов на карту генома 19. Перец веб-сервер предлагает, в дополнение к методу все-в-одном анализе, набор инструментов для добычи для регулоны, промоутеров и связывающий фактор транскрипции сайтов 20. Полное аннотации межгенных в бактериальный геном может быть достигнуто с помощью этого пакета. Биологи могут извлечь большую пользу из перца, как это предлагает им платформу для разработки экспериментс тем чтобы гипотетический информация может быть подтвержден в пробирке 20. Эти программные пакеты вносят существенный вклад в анализ микрочипов, поскольку большинство из них находятся в свободном доступе и сделать нормализация и анализ данных очень надежным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка средств массовой информации, и в клеточной культуре
- Растут S. пневмонии D39 штамма дикого типа 21, как описано выше 11. Посев клеток хранили при -80 о С в 10% глицерине (с 1/100 соотношении в 50 мл стерильные пробирки) в 50 мл химически определенной среде (CDM) с конечным значением рН 6,4 15, но пропустить L-серин из аминокислоты смесь.
Примечание: используются два различных СУБКД; один, содержащий минимальную концентрацию L-серин (150 мкм) и другой, содержащей максимальную концентрацию L-серина (10 мм). Это минимальная концентрация в основном концентрация L-серина в плазме крови человека и цель состоит в том, чтобы сравнить экспрессию генов S. пневмонии D39 деформаций при выполнении этих двух условий.
2. Выделение тотальной РНК
- Материалы
- Использование кислоты фенол, РНК класс для выделения тотальной РНК.
- Macaloid:
- Приостановить 2 граммаmacaloid в 100 мл ТЕ и кипятить в течение 5 мин. Охлаждают до комнатной температуры и разрушать ультразвуком до macaloid gels.Centrifuge раствор при 2000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, вновь суспендируют в 50 мл ТЕ рН 8 и хранят при температуре 4 ° С.
- Решения:
- Лечить все решения диэтиловым пирокарбоната (DEPC). Добавить 100 мкл DEPC / 100 мл раствора, инкубируют O / N при 37 ° С и автоклав в течение 15 мин.
- Методология
- Вырастить 50 мл S. клеточная культура пневмонии D39 в 50 мл пробирки на 37 о С (не встряхивая) до середины экспоненциальной фазы (OD ~ 0.3). Центрифуга культуры при 4 ° С на 10000 × г в течение 2 мин. Отменить массовой информации и немедленно заморозить ячейки гранул в жидком азоте.
- Премикс 300 мкл хлороформ: IAA (24: 1) и 300 мкл фенола (фенол кислоты, РНК класс). Использование 500 мкл органической фазы на этапе 2.2.3.
- Подготовьте следующую смесь заранее в РНК-Free завинчивающейся крышкой труб: 00,5 г стеклянных шариков, 50 мкл 10% SDS, 500 мкл фенол / хлороформ: IAA (как полученного на стадии 2.2.2), macaloid слой (150-175 мкл, не точно, поскольку это очень вязкой). Ресуспендируют клеток гранул в 400 мкл ТЕ (DEPC) и добавить Ресуспендированный клеток в завинчивающейся крышкой трубки.
- Чтобы разорвать клетки, положите завинчивающейся крышкой трубки в шаровой насадкой в течение 2х 60 "импульсов ('гомогенизации») с 1-минутного интервала на льду. Центрифуга образцы в течение 10 мин при 10000 х г (4 ° C).
- Передача верхней фазы в новую пробирку, добавляют 500 мкл хлороформ: IAA (24: 1) и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 х г (4 ° C).
- Передача 500 мкл верхней фазы в свежие пробирки, добавляют 2 объемов (1 мл) лизиса / буфера для связывания и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Изолировать общей РНК с использованием набора для выделения РНК и следуйте рекомендуемым изготовителем протокол.
3. РНК Очистка
< ол>4. Анализ РНК
- Определить концентрацию РНК на спектрофотометре. Определить качество РНК с использованием анализа следующим образом (рисунок 2).
- Развести 1 мкл образца с 50 мкл DEPC воды, чтобы получить концентрацию 20-200 нг / мкл.
- Используйте 1 мкл пробы разбавляют РНК, чтобы проверить качество на Bioanalyser в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Примечание: соотношение 23S: 16S из вокруг 2,0 считается хорошим 1 A260 Блок РНК соответствует 40 мкг / мл.. Рекомендуемое количество для маркировки составляет 10-20 мкг.
5. кДНК Подготовка и маркировка
ntent "> Примечание: последовал следующий протокол для подготовки кДНК и маркировки.- Отжиг
- Выполните реакцию отжига в 300 мкл ПЦР пробирок, сохраняя общую концентрацию РНК 10-15 мкг для самодельных слайдов или 5 мкг для компании сделал слайдов. Смешайте РНК с 2 мкл случайных nonamers (1,6 мкг / мкл) и добавления нуклеазы без воды, если это необходимо, чтобы конечный объем отжига смеси с 18 мкл.
- Хранить отжига смеси при 70 ° С в течение 5 мин. После этого, охладить смесь до комнатной температуры в течение 10 мин (отжига) и, при необходимости, спин вниз реакции на дне пробирки. Поместите реакционные трубы на льду в течение по крайней мере 1 мин.
- С обратной транскрипцией
- Подготовьте обратной транскриптазы смесь следующим образом: до 18 мкл отжига смеси, добавить 12 мкл основной смеси (состоящий из 6 мкл 5x первых Strand буфер, 3 мкл 0,1 М ДДТ, 1,2 мкл 25х АА-дУТФ / нуклеотидные смеси и 1,8 мкл обратной тranscriptase (1 мкл для компании сделал слайдов). Хранить реакционную смесь в течение 2-16 ч при 42 ° С.
6. Деградация мРНК и очистка кДНК
- Деградировать мРНК из реакционной смеси, добавить 3 мкл 2,5 М NaOH и место при 37 ° С в течение примерно 15 мин. Затем добавляют 15 мкл 2М HEPES свободной кислоты для нейтрализации NaOH.
- Очищают кДНК смесь с помощью ПЦР колонки по очистке и следовал протоколу производителя.
7. Измерение кДНК концентрации
- Измерения концентрации кДНК на спектрофотометре. Чтобы продолжить маркировки, убедитесь, что концентрация кДНК, по крайней мере 60 нг / мкл (домашние горки) или 20 нг / мкл (компания-сделано слайды).
8. Маркировка кДНК с амин-реактивных красителей и очистки
- Использование аминного-реактивный краситель для обозначения кДНК. Непосредственно смешать кДНК с одной аликвоты (5 мкл)амин-реактивных красителей.
- Выдержите смесь при комнатной температуре, в темноте, в течение от 60 до 90 мин и приступить непосредственно к очистке красителя меченного кДНК. Очищают кДНК красителя помечены с помощью ПЦР колонки по очистке и в соответствии с протоколом производителя. Элюции кДНК в 50 мкл буфера для элюции.
9. Измерение Меченые кДНК
- Использование спектрофотометра для измерения включения аминов активных красителей в кДНК. Убедитесь, что концентраци амина активных красителей, по меньшей мере 0,5 пмоль / мкл в общем объеме 50 мкл.
10. Смешивание образцов маркировкой кДНК
- Для домашней слайдов, использовать все меченого кДНК для гибридизации с разницей в концентрации кДНК не более 30%. Для компании сделал слайды, использовать кДНК с не более чем 2-кратное различие в концентрации кДНК.
Примечание: как правило, около 300 нг кДНК необходим для производства компании слайдов, которые очень мало по сравнению с REQuired количество кДНК для самодельных слайдов.
11. гибридизации и промывки
- Используйте следующие реагенты: деми воде, этаноле 99%, застенчивая буфера (домашнее; с 40 мкл РНК дрожжей). Подготовка максимум 1 мл застенчивый.
- Приборы и приготовления растворов
- Включите вакуумных концентраторов и нагревателя, по крайней мере 1 час перед сушкой. Включение гибридизации печи, с заданным значением скорректированной до нужной температуры гибридизации (для S.pneumoniae, ДНК-микрочипов, использовать 45 ° C). Точно так же, разогрейте гибридизации кассету и печь в течение 30-60 мин.
- Разогреть Shy буфер на 68 ° С в течение по крайней мере 30 мин.
- Подготовка образцов (помечены кДНК)
- Зерноуборочный равные количества меченых кДНК (макс разностных 30%). Сушат образец с использованием вакуумных концентраторов при высокой температуре (прибл. 40 мин), пока объем не меньше, чем 7 мкл.
- Lifter скольжения
- Используйте чистые поводковые-слипы.Примечание: ± 30 мкл может быть загружена на слайде.
- Очистите атлет-слипы с мылом, большим количеством водопроводной воды и 100% этанола. Примечание: Грязные скользит подъемник дать высокий фон.
- Воздух сухой атлет-слипы с пневматического пистолета, чтобы сдуть пылинки. Поместите чистую подъемника скольжения на слайде с белым тефлоном по бокам вниз.
- Добавление гибридизации буфер (с меченым кДНК)
- Растворите образцы высушенных красителя в 7 мкл H 2 O и инкубировать при 94 ° С в течение 2 мин.
- Сразу же, добавить 35 мкл предварительно нагретой Shy буфер (68 ° C), мягко и спин смешать с максимальной скоростью в течение 1 мин, чтобы избавиться от выделений. Разогреть зонд на 68 ° С в течение примерно 5 мин до нагрузки.
- Слайд-подъемник-Slip сборки и прогрева.
- Поместите держатель гибридизации скользить по тепловой блок на 50 ° C. Поместите микрочипов ДНК слайды с подъемника скольжения на раскаленной держателя гибридизации слайд и рразогреть слайд с подъемника скольжения на минуту. Выполните следующие шаги как можно быстрее.
- Добавить 40 мкл образца мишени в конце ползуна. Дайте текучей среды между стеклянными поверхностей капиллярных сил. Выполните все пипеткой медленно и осторожно.
- Держите слайды с ручка Нескользящая горизонтали во все времена и двигаться медленно, чтобы убедиться, что ручка скользит не двигаться.
- Возьмем предварительно нагревают кассету гибридизации из гибридизации печи и закрыть машину. Место фильтр-бумага пропитывается 3 мл 2х SSC (стандартный раствор хлорида цитрат) в гибридизации кассеты.
- Аккуратно поместите держатель слайдов гибридизации с горками в гибридизации кассеты. Закройте гибридизации кассету и положите в гибридизации печь снова (около 16-18 часов).
- Презентация стиральная
- Подготовка свежие мыть-буферов I, II и III (750 мл на стадию промывки). Для 500 мл мыть-буфер ввода, используйте 2 х SSC / 0,5% SDS. Для 500 мл моющего-любителяэ II, использовать 1 х SSC / 0,25% SDS. Для 500 мл мыть-буфер III, используйте 1 х SSC / 0,1% SDS (по желанию)
- Поместите Вымойте буферов при 30 ° C (правда SDS растворяли).
- Погрузите слайды как можно быстрее, но очень осторожно, в сокола трубки, заполненной 50 мл буфера мыть я пока стекло не опирается на конической нижней части трубы.
- Через несколько секунд, когда атлет-скольжения опускается на дно пробирки, вынуть слайд с помощью пинцета, не царапая массив и поставить в стойку для стирки станции. Продолжить с промывкой без временного промежутка.
- Промыть слайды в течение 5 мин в 500 мл буфера мыть-I (в стиральной станции). Дайте ему второй промывки в течение 20-30 мин в 500 мл моющего буфера II (в стиральной станции). Кроме того, мыть слайды в течение 5 мин в 500 мл буфера мыть-III (по желанию) (в стиральной станции).
- Высушите слайды течение 2 мин при 2000 оборотах в минуту.
12. микрочипов анализ
- Сканирование изображенийс соответствующими длинами волн в сканер и сохранить в папке "Юпитер проекта".
- Используйте программное обеспечение для анализа отсканированных файлов, изначально, как описано выше 22. После выполнения этой программы, выберите вкладку "Открыть изображение", чтобы загрузить файл красный изображения (-.550), как «красные» и зеленой файл изображения (-.635) в качестве "Зеленый". Загрузить файл Gal (.gal), имеющий S.pneumoniae, список массивов по файлу изображения, выбрав "Load массива List" вкладку 22.
Примечание: этот список массив состоял из 48 сеток, на каждой сетке было 16 строк и 15 столбцов. Каждое пятно на сетке представляет собой один ген, и местом информацию, включая имя гена добавляют через описание местом файл. Цифры местная приведены слева направо и сверху вниз. - После тщательного кровянистые выделения сетки, выберите вкладку "Найти массива, Найти блоков, Выровнять Особенности", чтобы выровнять пятна. После выравнивания все возможности, проанализировать изображение, выбрав «Анализируя" тAB. Создайте новый файл, имеющий результаты, гистограммы и точечный график. Сохраните этот файл на вкладке «сохранять результаты в виде" как .gpr файл для дальнейшего анализа.
- Выполните дальнейшей нормализации и обработки данных с собственной разработки программного пакета Microprep, как описано 9.
- Используйте независимых биологических повторяет для ДНК микрочипов данные, которые красителя местами. Выполнение реализации CyberT варианта трет-test1 и цену ложные обнаружения (FDRs), как описано 9.
- Для дифференциально выраженных генов, взять р <0,001 и FDR <0,05 в качестве стандарта.
- Загрузить микрочипов данные ДНК на странице подачи NCBI, чтобы получить GEO (Gene Expression Omnibus) инвентарный номер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
РНК, кДНК изоляция и анализ
L-серин является одним из незаменимых аминокислот, и его концентрация в плазме крови человека составляет от 60-150 мкМ у детей и взрослых. Его роль в биосинтезе пуринов и пиримидинов подчеркивает его значение в метаболизме и является предшественником нескольких аминокислот (глицин, цистеин и триптофан). Для изучения влияния L-серин на весь транскриптома из S. пневмонии D39 штамма дикого типа, микрочипов анализ D39 штамма, выращенного в МЧР с минимальной концентрации (150 мкМ) L-серина с, что выращивают в максимальной концентрации (10 мМ) в той же среде проводили. Прежде всего, тотальную РНК из клеток, выращенных в обеих концентрациях был изолирован. Концентрации образцов РНК приведены в таблице 1. Качество суммарной РНК исследовали с помощью проверки качества анализа. РНК обрабатывали ДНКазы I Перед выполнением этойАнализ, чтобы удалить возможные геномной ДНК 2 показана качества РНК.; пер л представляет собой лестницу, полосы 1 и 2 представляют собой РНК из серина и 150 мкм дорожках 3 и 4 представляют собой РНК из 10 мМ серин. Наличие двух четких полос, соответствующих двум РНК подразделений указывается хорошее качество РНК и следующий шаг эксперимента может быть выполнена.
После измерения качества РНК, синтез кДНК и было сделано. кДНК получали с использованием случайных наномеров и фермента обратной транскриптазы. Концентрации образцов кДНК, приведены в таблице 1. Эту кДНК метят аминов активных красителей и концентрации меченого кДНК и этикетки красителей приведены в таблице 1. После маркировки, образцы были смешаны, соответственно, и затем гибридизовали. После промывки, слайды были отсканированы с помощью сканера, а анализ проводился с использованием Gene Pix Pro программное обеспечение. Рисунок 3 показывает разбросУчасток анализ соотношения красителей амина-реактивного. После первоначального анализа, данные дополнительно анализируют с помощью программного пакета PicroPrep (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 для уменьшения шума и кибер-T использовалась для окончательного анализа. В таблице 2 приведены результаты микрочипов исследований после применения критериев от ≥ 2,0 кратное различие и п -Value <0,001. Количество генов были дифференциально экспрессируются в присутствии минимальной L-серина по сравнению с максимумом (таблица 2).
Рисунок 1. Обзор микрочипов ДНК технологии. РНК изолирован от контроля и целевых образцов и помечены кДНК затем гибридизуют.
Рисунок 2.Проверка качества РНК, выделенной из S. пневмонии D39 клетки выращивают в присутствии минимума (150 мкм) и максимума (10 мМ) концентрации серина. пер л представляет размер лестница, тогда как полоса 1 и 2 представляют собой образцы РНК, выделенной из клеток, выращенных в присутствии минимальной концентрации серина. Кроме того, полосы 3 и 4 представляют собой образцы РНК, выделенной из клеток, выращенных в присутствии максимальной концентрации серина. Полосы представляют 23S и 16S рРНК. Наличие только двух полос показывает, что нет никакого загрязнения гДНК и РНК хорошего качества.
Рисунок 3. Массив сравнение разброс участок образца смеси. Каждое пятно в сюжете представляет Среднее значение выражения (log2) гена в эксперименте с красителем 1 на оси ординат и красителя 2 на оси абсцисс.
| Образец | РНК образца | Описание | Концентрация РНК (нг / мкл) | Концентрация кДНК (нг / мкл) | Меченые ДНК (нг / мкл) | DyLight-550 (пмоль / мкл) | DyLight-650 (пмоль / мкл) | Схема гибридизации |
| S1 | R1 | D39 дикого типа, выращенных в МЧР + Минимальный L-серин | 2057 | 255 | 225 | 0,8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 дикого типа, выращенных в МЧР + Минимальный L-серин | 2566 | 201 | 179 | 1,2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 дикого типа, выращенных в МЧР + Максимальная L-серин | 2831 | 292 | 276 | 2,3 | ||
| R4 | D39 дикого типа, выращенных в МЧР + Максмум L-серин | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Таблица 1. Гибридизация схема образцов, используемых в анализе микрочипов.
| Джин | Функция B | Соотношение с | |||
| SPD0600 | Белок Деление клеток DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Фосфоглицераткиназы | 3,5 | |||
| SPD0646 | Гипотетический белок | 3,4 | |||
| SPD0873 | Гипотетический белок | 3,3 | |||
| SPD1223 | Гипотетический белок | 3,3 | |||
| SPD0980 | Рибоза-фосфат pyrophosphokinase 2,8 | ||||
| SPD1628 | Ксантин фосфорибозилтрансферазы | 2,7 | |||
| SPD1011 | Глицерата киназы | 2,4 | |||
| SPD0645 | Гипотетический белок | 2,3 | |||
| SPD0564 | Гипотетический белок | 2,2 | |||
| SPD0641 | Манноза-6-фосфат-изомеразы, класс I, Mana | 2,1 | |||
| SPD1333 | Гипотетический белок | 2,1 | |||
| SPD1384 | Катион белок отток семья | 2,1 | |||
| SPD1432 | UDP-глюкоза 4-эпимераза, ураганные 1 | 2,1 | |||
| SPD1866 | N-ацетилглюкозамина-6-фосфат деацетилаз, наги | 2,1 | SPD0104 | Белок домена LysM | 2 |
| SPD0140 | ABC Transporter, АТФ-связывающий белок | 2 | |||
| SPD0261 | Аминопептидаза C, ФЕПК | 2 | |||
| SPD1350 | Гипотетический белок | 2 | |||
| SPD1822 | Рибосомальная большой субъединицы псевдоуридина синтазы, RluD подсемейство белков | 2 | |||
| SPD0453 | Тип I система рестрикции-модификации, S субъединицы | -2 | |||
| SPD0459 | Белок теплового шока GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Глюкоза-1-фосфат adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | Датчик гистидинкиназа, предполагаемый | -2.1 | </ TR>|||
| SPD0387 | Бета-hydroxyacyl- (ацил-носитель-белок) дегидратазы FabZ | -2,2 | |||
| SPD1494 | Сахар ABC Transporter, пермеазы белок | -2,2 | |||
| SPD0974 | Класс I глютамин амидотрансферазу, предполагаемый | -2,4 | |||
| SPD1600 | Антранилатсинтазу фосфорибозилтрансферазы | -2,5 | |||
| SPD1472 | Изолейцил-тРНК синтетазы | -2,6 | |||
| SPD0681 | Гипотетический белок | -2,7 | |||
| SPD0501 | Транскрипция antiterminator, LICT | -3,4 |
Таблица 2. Список генов, регулируемых в сравнении транскрипций из S. пневмонии штамм D39 дикого типа, выращенных в CDM 15 с минимальной концентрацией L-серин и МЧР 15 с максимальной концентрацией L-серин. Ген цифры относятся к D39 локуса тегов. Б D39 аннотации / TIGR4 аннотации 21. С Отношение представляет кратное увеличение / уменьшение экспрессии генов в CDM-максимум по сравнению с CDM-минимум (знак минус означает понижающей).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опишем протокол удобный, которые могут быть применены, чтобы выполнить всю транскриптом анализ бактерий. Ключевым моментом об этом конкретном методе является то, что условие, при котором собирают клетки будет меняться. После сбора клеток и выделение РНК, эта методика становится равным для всех типов бактериальных образцов и следует точно одинаковые шаги, и, следовательно, могут быть применены к любому типу бактериальной культуры. Протокол очень простой и удобный и начинается с выделения РНК. Наш протокол выделения РНК (с использованием Macaloid и набор для выделения РНК) является эффективным времени по сравнению с обычным фенол-хлороформом и методов триазол. На следующем этапе, препарат кДНК с транскриптазы III фермента выполняется. Далее, маркировка кДНК делается путем смешивания первой кДНК с амин-активных красителей, с последующей очисткой с надписью кДНК. Маркировка также проста и не займет много времени, как должны быть инкубировали в течение приблизительно 1 образцыч в темноте. Все эти шаги могут быть выполнены в любом стандартном лаборатории, поскольку он не требует никакого специального оборудования. Микрочипов сканер необходим для сканирования слайдов. Для сканирования и анализа слайд, Pro программа GenePix используется, что очень просто и удобная программа 22.
После выполнения всех экспериментов, анализ проводился с использованием MicroPrep и CyberT. Пакет MicroPrep, состоит из трех модулей, т.е. PrePreP, PRep и PostPreP 9. Эта структура данных предварительной обработки сокращает время для нормализации данных, а также уменьшает количество отброшенных данных. Легкость, с которой программное обеспечение может быть использовано позволяет исследователю иметь представление о данных ДНК микрочипов в минимальные сроки. Это займет всего несколько минут, чтобы преобразовать необработанные данные сигнала в высококачественных данных для дальнейшей обработки после анализа слайде изображение сделано. Дальнейший анализ на бассейн генов регулируется в MICRoarray может быть сделано с помощью различных пакетов в доме программного обеспечения. Они включают в себя перец 20, Fiva 16, раскрывают 18, прокурора 17 и Genome2D 19. Эти базе Windows инструменты и программные пакеты для пользователей и обеспечить глубокое проникновение в данных во время дальнейшего расследования. Эти программные пакеты позволяют очень легко и удобно для исследователей, чтобы использовать эту технологию в качестве данных становится гораздо более значимым и актуальным.
Красители, используемые в микрочипов, как известно, подвержены озонового-эффекта, где красители становятся нестабильными в присутствии озона и силы сигнала настолько мала, что он не может быть признан сканера. Амин-активные красители, которые менее чувствительны к озоновому эффекта используются для обозначения кДНК. Решение озона эффекта сделает эту технологию еще лучше.
Список был создан генов, которые были вверх или подавляется в присутствии минимальной L-SerКонцентрация INE по сравнению с максимумом (таблица 2). В активируемых генов могут быть классифицированы в соответствии с функцией их продукта. Семь из них кодируют гипотетические белки, четыре участвуют в углеводном транспорта и метаболизма, подразделение белка клеточной DivIB и некоторых транспортных аминокислоты и обмена генами. Кроме того, существуют также определенные гены, которые подавляются в нашей тестируемой состоянии. BglG семьи регулятор транскрипции LICT, некоторые гены углеводов и некоторые гены аминокислот по конкретной среди подавляется генов. Белок GrpE теплового шока также является одним из вниз регулируется них. Таким образом, это исследование дает полное представление о генах дифференциально экспрессируется под проверенных условиях. После анализа результатов, иногда проверка результатов необходимо. Это может быть сделано либо количественной ПЦР или β-галактозидазы анализов с использованием LacZ промотора слияния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим Анну де Йонг и Сигер Holsappel за помощь в ДНК-микрочипов производства слайдов. Поддержка Энн де Йонг для анализа биоинформатики также оценены. Мы также благодарим Йелле Slager для рассмотрения этого документа. Мухаммад Афзал и Ирфан Мансур поддерживаются GC университета, Файсалабаде, Пакистан в рамках программы развития факультета ГЭЦ Пакистане.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
