Abstract
Lokomotiv defekter som følge af neurodegenerative lidelser kan være en sen debut symptom på sygdom, efter flere års subklinisk degeneration, og dermed nuværende terapeutiske behandlingsstrategier er ikke helbredende. Gennem brug af hele exome sekventering, har et stigende antal gener blevet identificeret til at spille en rolle i human bevægelse. Trods identificere disse gener, er det ikke kendt, hvordan disse gener er afgørende for normal lokomotiv funktion. Derfor er en pålidelig analyse, som benytter modelorganismer at belyse den rolle, som disse gener for at identificere nye targets af terapeutisk interesse, er behov for mere end nogensinde. Vi har designet et sensibiliseret version af den negative geotaxis assay, muliggør påvisning af mildere defekter tidligere og har evnen til at vurdere disse mangler over tid. Assayet udføres i et glas måleglas, som er forseglet med en voks barrierefilm. Ved at øge tærsklen afstand, der skal klatrede til 17,5 cm og øge eksperimentet varighed til 2 min, vi har observeret en større følsomhed i detektering milde mobilitet dysfunktioner. Assayet er omkostningseffektiv og ikke kræver omfattende træning for at opnå stærkt reproducerbare resultater. Dette gør det en fremragende teknik til screening lægemiddelkandidater i Drosophila-mutanter med bevægelseskomponenter defekter.
Introduction
Ødelæggende neurodegenerative lidelser, såsom Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, og arvelig spastisk paraplegi anerkendes i stigende grad. Desværre er de fleste af disse neurodegenerative lidelser er stadig uden behandlinger. Den udbredte kliniske anvendelse af genom-dækkende, upartiske genetiske tests såsom hele exome sekventering har ført til et stigende antal gener bliver impliceret i humane lokomotiv lidelser. Trods disse fremskridt den patologiske progression fra tidlig til sene stadier, forbliver undvigende i disse lidelser. Drosophila giver en med de genetiske værktøjer til at studere gen krav på en kontrolleret rumlige og tidsmæssige måde. Desuden har Drosophila vist sig nyttig i screening af lægemidler for neurologiske tilstande, såsom Parkinsons 1, Alzheimers 2, mentalt handicap 3,4 og epilepsi 5,6 blandt andre. Vores mål var at udvikle en omkostningseffektivog pålidelig analyse, der ville tillade high throughput analyse, ville stadig være følsomme nok til at detektere små ændringer i motorisk præstation.
Der er flere analyser, der anvendes til at kvantificere effekten af genetisk mutation og / eller miljømæssig stand på Drosophila klatring adfærd. De fleste af de analyser kapitalisere på den naturlige tendens fluer til at forcere, kendt som negative geotaxis eller klatring analysen. Benzer 7 foreslog i 1967, at modstrøms-apparat anvendt til studiet af phototaxis også kan anvendes til at studere gravitaxis. Siden da har Ganetsky 8 og mange andre 9 -12 bygget på den oprindelige analyse. Princippet er at placere et kendt antal fluer i et hætteglas og let på hætteglasset kraftigt mod en hård overflade, hvilket får fluerne til at falde til bunden af hætteglasset. Da det er en medfødt adfærd, vil fluerne forsøge at klatre op til toppen af hætteglasset, imod tyngdekraften. Denne analyse er kvantitativ og measures hvor mange fluer har klatrede forbi en markør på hætteglasset i løbet af en tildelte tid periode. Måling af hastighed i stedet for det samlede antal fluer klatring er blevet en pålidelig parameter og vist defekter i tilfælde, hvor antallet af fluer kriterier ikke var signifikant 13.
Den klatring assay har vist sig nyttig i studiet af mange neurodegenerative lidelser, herunder Parkinsons sygdom 14. Vi bemærkede dog, at lokomotiv defekter ikke kan påvises ved tidspunktet hvor neurodegeneration allerede ses i patologiske undersøgelser 14. Således kan anvendelsen af den traditionelle assay begrænser mulighederne for at studere de tidlige stadier af sygdommen patogenese. Fremkomsten af lokomotiv defekter under senere stadier af patologi kan afspejle en sygdom, hvis progression er for avanceret for komplet redning.
Dette rejser et potentielt problem med følsomheden af traditionelle klatring analysen. Den potentielle manglende evne til tradinale klatring assay til påvisning af milde lokomotiv defekter kan tilskrives den højde, hvortil fluer skal klatre. De traditionelle assay 15,16 måler antallet af fluer med held kravle over en højde på 2 til 5 cm i 10 til 20 sek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskning i Drosophila melanogaster var i overensstemmelse med University of Alberta forsknings- retningslinjer.
1. Fly Collection
- Saml 20 fluer ved hjælp af CO 2 (g) bedøvelse og sted i en 25 mm x 95 mm samling hætteglas indeholdende mad.
- Opbevar hætteglas indeholdende fluer vandret for at undgå indfangning fluer i væsker, der kan akkumuleres i bunden hætteglasset.
- Inkuber fluer i mindst 21 timer ved 22 ° C ved 45% fugtighed i en inkubator i omtrent i 15 timer. Indstil inkubator med en 12 h lys: mørke-cyklus.
2. Klatring Assay
- Den følgende morgen, overfører 20 fluer fra et enkelt hætteglas i en 250 ml glas måleglas. Markér placeringen af cylinderen for at holde det konstant hverdag. Brug en glascylinder pr genotype at undgå krydskontaminering mellem genotyper. Vask ved afslutningen af hvert forsøg og rotate dem mellem genotyper.
- Udførelse af forsøgene i omgivende lys (eller rødt lys, hvis der er en potentiel defekt i syn) ved temperatur og fugtighed på 22 ° C og 40%. For at undgå døgnrytme forvirre, altid udføre eksperimenter på samme tidspunkt af dagen.
- Forsegle toppen af cylinderen med en barrierefilm (voksfilm) for at forhindre udslip af fluer (figur 2).
- Opsæt videokameraet på et stativ. Fokus kamera på 190 ml linje af de 250 ml måleglas (17,5 cm).
- Tæl antallet af døde fluer i bunden af cylinderen og i fødevare- hætteglas. Optag dette nummer som dødelighed.
- Meget let tryk på cylinderen mod lukket celle skum pad gentagne gange med tilstrækkelig kraft til at fortrænge fluerne til den indre bund overflade. Tap 5 - 10 gange, mens du bruger den anden hånd til at trykke optage på kameraet.
- Tryk på "Record" -knappen på kameraet.
- Start video kamera optagelse og tryk på cylinderen seks gange i en særskilt ikke-rytmisk mønster.
- Gennemføre hvert forsøg i 2 min fra det tidspunkt, hvor fluerne er sidst aflyttet og registrere antallet af fluer krydser højde på 17,5 cm (190 ml) ved hvert tidspunkt valgt (kvantificere hver 10 sek). Bemærk: ml mærkningen på cylinderen vil variere fra den ene cylinder model til en anden afhængigt af diameter. For at undgå fejl, måle højden på hver brugt cylinder.
- Når retssagen er afsluttet, bortskaffe fluer i 95% ethanol.
- Gentag trin 2.1 til 2.9 indtil alle replikater er blevet testet med friske fluer hver gang.
Bemærk: Selvom 5 gentagelser kan være nok med en mutation, der har en stærk virkning på bevægelse, er 10 biologiske replikater af 20 fluer (200 fluer) anbefales at opdage mindre forskelle. - Ved afslutningen af forsøget, vaske cylindrene i laboratoriet opvaskemaskine og tør O / N at blive genanvendt.
3. Analyse
- AnalyZE videoer af hver flyve retssag. Hver 10 sek, registrerer det samlede antal fluer, der passerer målet linje.
- Hvis en flue klatrer ned eller falder, post, der flyver som -1 og tælle den næste flue til at krydse målet linje som det samme nummer som fluen, der klatrede ned igen eller faldt. For eksempel, hvis den 15 th fluen falder under målet linje, den næste flue til at passere linjen (de 16 th flyve) betragtes som den 15. flue og ikke de 16 th.
- Fratræk dødeligheden af det samlede antal fluer (20) for at opnå antallet af fluer, der forbliver i forsøget. Ved hvert tidspunkt, få den del af fluer over målet linje.
- Plotte hver procent på hvert tidspunkt (se figur 3).
- Analysere resultaterne ved 120 sek datapunkt og udfører student t-test, når 2 grupper er til stede eller ANOVA og en post-test for multiple sammenligninger (med Bonferroni modifikation for planlagt og Tukey for uplanlagt comparisons). The Kolmogorov-Smirnov-test 17 er også udført for at fastslå normalitet og ens varians men også for at sammenligne fordelingerne af mutanten gruppe til kontrollen.
- At præsentere de data over aldring, plotte den procentdel af fluer klatring ved 120 sek med fluer i forskellige aldre (2 dage, 1 uge, 2 uger) for at se, om der er en progressiv underskud (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klatring er en stærk og reproducerbar opførsel. Faktisk er en dag gamle vildtype-fluer nå målet afstand klatring ydeevne hurtigt (25-30 sek). Mutant fluer præsentere en vifte af præstationer fra mild (eller forsinket) at fuldføre manglende evne til at klatre op til målet. Vi illustrere dette her med to forskellige mutante alleler. Den første er en alvorlig allel af genet spastin forårsaget af en komplet deletion af spastin genet (kurbade 5.75) 18. I denne linje (kurbade 5.75 med TM6b) en dag behøver gamle fluer ikke nå WT klatring ydeevne, selv efter 2 min. Denne mutant linje præsenterer med alvorlige defekter selv ved brug hætteglasset metode (figur 1A, B). Fordelen ved metoden præsenteres her bliver tydeligere, når man studerer en mutant for det samme gen men med en ufuldstændig deletion offentliggjort af den samme gruppe (kurbade 17-7 med TM3) 18. I så fald ydeevne senest 8 dage er normalt (figur 1C-F (figur 3) eller genetisk interaktion. For yderligere bevis, omfatter redning af adfærdsmæssig fænotype med ekspressionen af et vildtypeproteinet for genet undersøgt. For interaktionsundersøgelser, sammenligne fluer, der er heterozygote for begge mutationer af interesse med fluer, der kun har én mutation af interesse. Assayet tillader også en at overvåge progressionen af klatring defekten over tid, et vigtigt aspekt ved modellering progressive sygdomme i bevægeapparatet (figur 4). Desuden 2 min tillade bedre se progression af klatring i alvorlige mutanter.
Figur 1. Sammenligning af forskellige klatring analyser. For alvorlige mutationer forskellige grader af klatring defekt kan ses ved hjælp af forskellige metoder, men mildere mutationer kan ikke påvises med nogle analyser. For at demonstrere dette har vi brugt to offentliggjorte mutant linjer for genet spastin:. Spastin 5-75, der indeholder en komplet sletning af spastin gen og spastin 17-7, som indeholder en delvis sletning af spastin gen (A) Først klatring vurderes ved at have fluer klatre op til toppen af en tom hætteglas fødevarer. Antallet af fluer på toppen efter 18 sek registreres. Brug af denne protokol en væsentlig defekt ses i SPAST genet 5-75 / TM6b sammenlignet med vildtype-kontroller (N = 10, p <0,001). (B) Dernæst klatring ydeevne vurderes ved den her beskrevne metode. Klatring er også d efective i samme genotype SPAST genet 5-75 / TM6b. Forskellen i ydelse er stærkt signifikant (N = 5, p <0,001), men forskellen i ydelse er større. For mutationer vist sig at have mindre virkning tanke (f.eks SPAST genet 17-7 indeholder en partiel deletion af spastin gen), cylinderen metode præsenteres her kan være mere følsomme. (C) Ingen væsentlig defekt observeres med 3 dage gammel SPAST genet 17-7 / TM3 med hætteglasset metode (N = 5). (D) Ingen væsentlig defekt observeres med 3 dage gammel SPAST genet 17-7 / TM3 med cylinderen metode (N = 5). (E) en ikke-statistisk tendens bemærkes med 8 dage gammel SPAST genet 17-7 / TM3 fluer (N = 5). (F) Men der observeres en betydning i 8 dage gamle SPAST genet 17-7 / testet med præsenteret for det samme antal gentagelser cylinder metode (N TM3 = 5, p <0,001).rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk afbildning af eksperimentelle oprettet. 20 fluer indsættes i en glascylinder og derefter dækket med en voks barrierefilm. Fluerne derefter tappet til bunden, og antallet af fluer krydser midterlinjen registreres ved hjælp af et kamera til 120 sek. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater af klatring eksperimentet. Procentdelen af fluer har passeret tærsklen linien er repræsenteret hver 10 sek over duratipå af assayet. I dette eksperiment 3 genetisk passende kontroller (vildtype, UAS kurbade -RNAi / +, Elav-GAL4 / +) sammenlignes transgene fluer indeholdende både UAS og Gal4 komponenter (Elav-GAL4 / UAS kurbade -RNAi). UAS kurbade-RNAi er fra VDRC # 108.739. Denne repræsentation giver mulighed for vurdering af satsen for klatring for hver genotype. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative graf for den aldrende profil. Da mange lokomotiv lidelser er progressive, er det vigtigt at skildre udviklingen over tid. I denne graf, er WT fluer sammenlignet med heterozygotiske mutanter (kurbade / WT) og trans-heterozygote mutanter (spast5-75 / spast17-7) ved 2 dage (A) og 8 dage (B)(N = 10, p <0,001). Resultaterne er også afbildet over tid for 120 sek. tidspunkt (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila har allerede vist sig at være en fremragende model i Parkinsons sygdom 14 og andre neurodegenerative tilstande 1,2. Ud over de genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, er dens genom højt konserveret for gener involveret i neurologiske lidelser 19. Fremkomsten af genom-dækkende genetiske screeningsmetoder (herunder hele exome sekventering) vil sandsynligvis fortsætte med at yde en større liste over kandidatgener associeret med human bevægelsesforstyrrelser. Udviklingen af behandlinger for disse forhold vil kræve dyremodeller til at øge vores forståelse af involveret i de tidlige stadier af neurodegeneration patologi. Brugen af Drosophila og den negative geotaxis assay tilvejebringer en billig og pålidelig metode til at identificere gener involveret i lokomotiv defekter og efterfølgende screene lægemiddelkandidater til fænotype redning. Dette øger den molekylære, elektrofysiologiske og billeddannende prøvetryk that kan også fås i samme dyremodel. Brug af klatring assayet, har andre held gengivet motoriske defekter i fluer mutant for gener, forstyrre human bevægelse. Ikke desto mindre har tidligere forskning vist, at patologiske ændringer kan gå forud for påvisning af lokomotiv defekter ved flere dage 14. Dette fænomen er også observeret i humane neurodegenerative tilstande, hvor vi taler om subkliniske ændringer. Vi mener, at ved at forstå og derefter behandle disse subkliniske ændringer, vil modifikation sygdom blive forbedret betydeligt.
Vi præsenterer her en model, der muliggør påvisning af milde bevægelseskomponenter defekter, der kan hjælpe med at forstå overgangen fra "præsymptomatisk til symptomatisk" af neurodegenerativ patologi ved anvendelse af en Drosophila model. Mange grupper har brugt en kort klatring afstand (5-10 cm), men vi har øget afstanden til 17,5 cm som i Palladino et al. 20. Selv om denne forskelmellem klatring højder kan synes mindre, blev stigningen i højden til formål at øge analysen vanskeligheder, og derved hjælpe med identifikationen af de forholdsvis små klatring defekter. Også nogle metoder valgte at belyse toppen af cylinderen med en fiberoptisk lampe, for at drage fordel af den phototaxic respons af voksne Drosophila. Imidlertid kan lyskilden forårsage lysreflektion inden i cylinderen; Således er en diffus overliggende fluorescerende lyskilde anvendes i stedet. Desuden kan mutation i gener involveret i neurodegeneration påvirker øjet funktion og dermed justere resultaterne. Stigningen i prøven størrelse fra 10 til 20 fluer øger den statistiske styrke hvert forsøg. I første omgang har vi øget dette tal til så højt som 30 fluer, men det blev senere reduceret for at minimere overbelægning og interaktion effekter mellem fluer. Prøverne kasseres efter en enkelt anvendelse, frem for at blive kørt i fire gentagne forsøg pr prøve, at fjerne possibility af læring eller træthed. På grund af fluer med ekstremt dårlig klatring præstation, var det kontraproduktivt at registrere den tid, der kræves til 50% af fluerne til at krydse målet linje for det kunne tage en betydelig mængde tid til dette kriterium, der skal opfyldes. Snarere blev fluer givet en varighed på 2 minutter at krydse målet linje. Antallet af fluer til at krydse den linje blev registreret og arkiveret lodret i intervaller på 10s, og den resulterende værdi, udtrykt i procent.
Disse betingelser skaber, er en mere følsom vurdering af en voksen flyve s klatring kapaciteter. Mens andre udformninger af assayet er stadig nyttig, kan dette paradigme overvejes i de tilfælde, hvor milde tidlige defekter efterforskes. Desuden kan dette assay hjælpe med at opdage, mindre ændringer i forbindelse med lægemiddelforsøg.
Et vigtigt punkt er, at den negative geotaxis adfærd er baseret på fluerne bliver aflyttet til bunden af cylinderen. Det er therefmalm vigtigt at vurdere andre former for bevægelse, såsom på en flad overflade eller flugt. Andre aspekter, såsom motivation og social interaktion skal betragtes som potentiel forvirre. En anden advarsel er, at analysen præsenteres kun tillader en at vurdere bevægelse hos voksne fluer. Dette begrænser evnen til at opnå neuropatologiske korrelater for adfærden observeret, hvilket er meget vigtigt for at forstå patogenesen af en sygdom. Faktisk har de fleste Neuroimaging arbejde blevet udført på larve neuromuskulære junction hidtil i Drosophila. Indhentning bevægelsesevne adfærd i larve kan være et vigtigt skridt for at trække direkte sammenhæng mellem adfærd og patologiske ændringer.
Det er meget vigtigt at styre temperaturen og fugtigheden ved hvilken fluerne hæves og testet. Ud over effekten på flue udvikling, disse faktorer en vigtig effekt på klatring evne fluer opdrættet og lagret i ikke-ideelle forhold. I presence øget statisk elektricitet eller fugt, har fluer ikke udføre optimalt. Denne effekt var ikke ens for alle genotyper, mutant fluer normalt bliver mere påvirket af sådanne faktorer end kontrol. Desuden skal vaskes og tørres korrekt mellem hvert forsøg cylindre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).
