Abstract
Defectos locomotores resultantes de trastornos neurodegenerativos pueden ser un síntoma de aparición tardía de la enfermedad, después de años de degeneración subclínica, y por lo tanto las estrategias actuales de tratamiento terapéutico no son curativos. Mediante el uso de toda la secuenciación del exoma, un número creciente de genes han sido identificados para jugar un papel en la locomoción humana. A pesar de la identificación de estos genes, no se sabe cómo estos genes son cruciales para el funcionamiento normal locomotora. Por lo tanto, un ensayo fiable, que utiliza organismos modelo para dilucidar el papel de estos genes con el fin de identificar nuevas dianas de interés terapéutico, se necesita más que nunca. Hemos diseñado una versión sensibilizada del ensayo geotaxis negativas que permite la detección de defectos más leves anteriormente y tiene la capacidad para evaluar estos defectos en el tiempo. El ensayo se realiza en un cilindro de vidrio, que se sella con una película de barrera de cera se graduó. Al aumentar la distancia de umbral para ser subido a 17,5 cm y el aumento de la duración de la prueba a 2 min hemos observado una mayor sensibilidad en la detección de disfunciones de movilidad suaves. El ensayo es rentable y no requiere de una amplia formación para obtener resultados altamente reproducibles. Esto hace que sea una excelente técnica para el cribado de fármacos candidatos en los mutantes de Drosophila con defectos de locomoción.
Introduction
Trastornos neurodegenerativos devastadores como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, y la paraplejía espástica hereditaria se reconocen cada vez más. Desafortunadamente, la mayoría de estos trastornos neurodegenerativos siguen sin tratamientos. El uso clínico generalizado de las pruebas genéticas, imparciales en todo el genoma como la secuenciación del exoma conjunto ha llevado a un creciente número de genes están implicados en los trastornos locomotores humanos. A pesar de este progreso, la progresión patológica desde temprano a las etapas finales de los años, sigue siendo difícil de alcanzar en estos trastornos. Drosophila ofrece uno con las herramientas genéticas para el estudio de requerimiento de genes de una manera espacial y temporal controlada. Además, Drosophila ha demostrado ser útil en el cribado de fármacos para enfermedades neurológicas como el Parkinson 1, 2 Alzheimer, discapacidad intelectual y epilepsia 3,4 5,6 entre otros. Nuestro objetivo era desarrollar un rentabley ensayo fiable que permita análisis de alto rendimiento que todavía sería lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el rendimiento del motor.
Hay varios ensayos utilizados para cuantificar los efectos de la mutación genética y / o condición ambiental en el comportamiento de escalada Drosophila. La mayoría de los ensayos de sacar provecho de la tendencia natural de las moscas para subir, conocidos como geotaxis negativos, o el ensayo de escalada. Benzer 7 sugirió en 1967 que el aparato de contracorriente utilizado para el estudio de phototaxis también podría ser utilizado para estudiar gravitaxis. Desde entonces, Ganetsky 8 y muchos otros 9 -12 se han basado en el ensayo inicial. El principio es colocar un número conocido de moscas en un vial y toque el vial firmemente contra una superficie dura, haciendo que las moscas que caen al fondo del vial. Como se trata de un comportamiento innato, las moscas se intentan subir a la parte superior del vial, se opuso a la gravedad. Este ensayo es cuantitativo y measures cuántas moscas han subido más allá de un marcador en el vial durante un período de tiempo asignado. Medida de la velocidad en lugar del número total de moscas escalada se ha convertido en un parámetro fiable y se muestra defectos en los casos en que el número de criterios moscas no fue significativa 13.
El ensayo de escalada ha demostrado ser útil en el estudio de muchos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Parkinson 14. Sin embargo, hemos observado que los defectos de locomotoras pueden no ser detectables en el momento en que la neurodegeneración ya se ve en los estudios patológicos 14. Así, el uso del ensayo tradicional puede limitar la capacidad de estudiar las primeras etapas de la patogénesis de la enfermedad. La aparición de defectos de locomotoras durante las etapas posteriores de la patología puede reflejar una enfermedad cuya progresión es demasiado avanzado para el rescate completo.
Esto plantea un problema potencial con la sensibilidad del ensayo tradicional de escalada. La incapacidad potencial de la tradicióncional escalada ensayo para detectar defectos leves de la locomotora se puede atribuir a la altura a la que se requieren las moscas a subir. Los tradicionales ensayo de 15,16 mide el número de moscas que subir con éxito más de una altura de 2 a 5 cm de 10 a 20 seg.
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Protocol
La investigación sobre Drosophila melanogaster se encontraba en cumplimiento con la Universidad de las pautas de investigación de Alberta.
1. Fly Colección
- Suma 20 moscas utilizando CO 2 (g) anestesia y colocar en un vial de recogida 25 mm x 95 mm que contiene alimentos.
- Tienda viales que contienen moscas horizontalmente para evitar atrapar moscas en cualquier líquido que pueda acumularse en la parte inferior del vial.
- Incubar las moscas durante al menos 21 horas a 22 ° C a 45% de humedad en una incubadora durante aproximadamente durante 15 horas. Establezca la incubadora con una luz de 12 horas: oscuridad ciclo.
Ensayo 2. Escalada
- A la mañana siguiente, la transferencia de 20 moscas de un solo vial en un vaso de 250 ml cilindro graduado. Marque la posición del cilindro para mantenerla constante todos los días. Utilice un cilindro de vidrio por genotipo para evitar la contaminación cruzada entre los genotipos. Lavar al final de cada experimento y roTate los entre los genotipos.
- Llevar a cabo los experimentos en la luz ambiental (o luz roja si hay un posible defecto en la visión) a la temperatura y la humedad de 22 ° C y 40% respectivamente. Para evitar confundir ritmo circadiano, siempre realizar experimentos en el mismo momento del día.
- Selle la parte superior del cilindro con una película de barrera (película de cera) para evitar cualquier escape de las moscas (Figura 2).
- Configure la cámara de vídeo en un trípode. Cámara Enfoque en la línea de 190 ml de los 250 ml cilindro graduado (17,5 cm).
- Contar el número de moscas muertas en la parte inferior del cilindro y en los viales de alimentos. Anote este número como la mortalidad.
- Muy golpee suavemente el cilindro contra una almohadilla de espuma de célula cerrada en varias ocasiones con la fuerza suficiente para desplazar a las moscas a la superficie inferior interna. Toque 5-10 veces, mientras con la otra mano para presionar registro en la cámara.
- Pulse el botón "Grabar" en la cámara.
- Inicie la video grabación de la cámara y toque el cilindro de seis veces en un patrón no-rítmica distinta.
- Llevar a cabo cada ensayo durante 2 minutos desde el momento en que las moscas están última intervenidos y registre el número de moscas que cruzan la altura de 17,5 cm (190 ml) en cada punto de tiempo elegido (cuantificar cada 10 seg). Nota: La ml marcado en el cilindro variará de un modelo de cilindro a otro dependiendo de diámetro. Para evitar errores, medir la altura de cada cilindro utilizado.
- Una vez que el juicio ha terminado, a disponer de moscas en etanol al 95%.
- Repita los pasos 2.1 a 2.9 hasta que todas las réplicas se han probado con moscas frescos en todo momento.
Nota: Aunque 5 repeticiones pueden ser lo suficientemente con una mutación que tiene un fuerte efecto sobre la locomoción, 10 réplicas biológicas de 20 moscas (moscas) 200 se recomienda para detectar diferencias más pequeñas. - Al finalizar el experimento, lavar los cilindros en el lavavajillas de laboratorio y O seco N para ser reutilizado /.
3. Análisis
- Analyvídeos ze de cada vuelan juicio. Cada 10 segundos, registra el número total de moscas que pasan la línea de meta.
- Si una mosca sube de nuevo hacia abajo o se cae, ficha que vuelan como -1 y contar la próxima marcha para cruzar la línea de meta como el mismo número que la mosca que subió de nuevo hacia abajo o cayó. Por ejemplo, si el 15 de mosca cae por debajo de la línea de meta, la próxima marcha para cruzar la línea (los 16 º vuelan) se considera la marcha 15 y no el 16.
- Reste la mortalidad por el número total de moscas (20) para obtener el número de moscas que permanecen en el juicio. En cada punto de tiempo, obtener la fracción de moscas por encima de la línea de meta.
- Sinopsis cada porcentaje en cada momento (ver Figura 3).
- Analizar el rendimiento en el punto de datos 120 seg y realice estudiante t-test cuando 2 grupos están presentes o ANOVA y un post-test para comparaciones múltiples (con modificación de Bonferroni para planificarse y Tukey para co no planificadomparisons). La prueba de Kolmogorov-Smirnov 17 también se lleva a cabo para determinar la normalidad y la igualdad de varianza, sino también para comparar las distribuciones del grupo mutante con el control.
- Para presentar los datos sobre el envejecimiento, trazar el porcentaje de moscas subiendo a 120 seg con moscas de diferentes edades (2 días, 1 semana, 2 semanas) para ver si hay un déficit progresivo (Figura 4).
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Representative Results
La escalada es un comportamiento fuerte y reproducible. De hecho, un día de edad de tipo salvaje moscas alcanzan el rendimiento escalada distancia objetivo rápidamente (25-30 seg). Moscas mutantes presentan una gama de rendimiento de leves (o retardada) para completar la imposibilidad de subir a la meta. Ilustramos esta aquí con dos alelos mutantes diferentes. El primero es un alelo severa de la Spastin gen causado por una deleción completa del gen Spastin (balnearios 5,75) 18. En esta línea (balnearios 5,75 con TM6B) de un Día moscas viejas no alcanzan el rendimiento escalada WT incluso después de 2 min. Esta línea mutante presenta con defectos graves, incluso cuando se utiliza el método de frasco (Figura 1 A, B). La ventaja del método presentado aquí se hace más evidente cuando se estudia un mutante para el mismo gen pero con una eliminación incompleta publicado por el mismo grupo (spas 17-7 con TM3) 18. En caso de que el rendimiento hasta 8 día es normal (Figura 1C-F (Figura 3) o interacción genética. Para una prueba más, incluir rescate del fenotipo conductual con la expresión de una proteína de tipo salvaje para el gen estudiado. Para los estudios de interacción, comparar las moscas que son heterocigotos para ambas mutaciones de interés con las moscas que sólo tienen una mutación de interés. El ensayo también permite a uno controlar la progresión del defecto escalada en el tiempo, un aspecto importante en el modelado de los trastornos del aparato locomotor progresivas (Figura 4). Además, 2 min permiten ver mejor la progresión de la escalada en mutantes severos.
Figura 1. Comparación de los diferentes ensayos de escalada. Para mutaciones severas diferentes grados de escalada defecto se pueden ver usando varios métodos pero las mutaciones leves no se puede detectar con algunos ensayos. Para demostrar esto utilizamos publicados dos líneas mutantes para el gen Spastin:. Spastin 5-75 que contiene una deleción completa del gen Spastin y Spastin 17-7 que contiene una deleción parcial del gen Spastin (A) En primer lugar, la escalada se evalúa por tener moscas suben a la cima de un vial de comida vacía. Se registra el número de moscas en la parte superior después de 18 seg. El uso de este protocolo un defecto significativo se observa en Spast 5-75 / TM6B en comparación con los controles de tipo salvaje (N = 10, p <0,001). (B) A continuación, subir el rendimiento se evaluó mediante el método descrito aquí. Escalada también es d Efectiva en el mismo genotipo Spast 5-75 / TM6B. La diferencia de rendimiento es altamente significativa (N = 5, p <0,001), pero la diferencia en el rendimiento es mayor. Para mutaciones demostrado tener menor efecto pensamiento (por ejemplo, Spast 17-7 contiene una deleción parcial del gen Spastin), el método del cilindro que aquí se presenta puede ser más sensible. (C) No defecto significativo se observa con 3 días de edad Spast 17-7 / TM3 con el método vial (N = 5). (D) No defecto significativo se observó con 3 días de edad Spast 17-7 / TM3 con el método del cilindro (N = 5). (E) Una tendencia no estadístico se observa con 8 días de edad Spast 17-7 / TM3 moscas (N = 5). (F) Pero un significado se observa durante 8 días de edad Spast 17-7 / TM3 probado con el método del cilindro presentado por el mismo número de repeticiones (N = 5, p <0,001).rget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representación esquemática de la experimental establecido. 20 moscas se insertan en un cilindro de vidrio y luego se taparon con una película de barrera de cera. Las moscas son entonces intervenidos hasta el fondo y el número de moscas que cruzan la línea media se registra utilizando una cámara de 120 seg. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los resultados representativos del experimento escalada. El porcentaje de moscas haber pasado la línea del umbral se representa cada 10 segundos durante los DURATIen el ensayo. En este experimento, 3 controles genéticamente apropiados (de tipo salvaje, UAS balnearios -RNAi / +, ELAV-GAL4 / +) se comparan con las moscas transgénicas que contienen tanto UAS y componentes Gal4 (spas Elav-GAL4 / UAS -RNAi). La UAS-RNAi balnearios es de vDRC # 108739. Esta representación permite la evaluación de la tasa de escalada para cada genotipo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. gráfico representativo para el perfil de envejecimiento. Dado que muchos trastornos locomotores son progresivas, es importante para retratar la evolución en el tiempo. En este gráfico, WT moscas se comparan con los mutantes heterocigotos (spas / WT) y mutantes trans-heterocigotos (spast5-75 / spast17-7) a los 2 días (A) y 8 días (B)(N = 10, p <0,001). Los resultados también se representan en el tiempo para el 120 sec. punto temporal (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Drosophila ya ha demostrado ser un excelente modelo en la enfermedad 14 y otras condiciones neurodegenerativas 1,2 de Parkinson. Además de las herramientas genéticas disponibles en Drosophila, su genoma está altamente conservada de genes implicados en los trastornos neurológicos 19. El advenimiento de los métodos de detección genética del genoma de ancho (incluyendo la secuenciación del exoma) es probable que continúe para proporcionar una lista más grande de genes candidatos asociados con los trastornos del movimiento humano. El desarrollo de tratamientos para estas condiciones requerirá modelos animales para aumentar nuestra comprensión de la patología involucrada en las etapas tempranas de la neurodegeneración. El uso de Drosophila y el ensayo geotaxis negativa proporciona un método barato y fiable para identificar genes implicados en los defectos de la locomotora y, posteriormente, cribar fármacos candidatos para el rescate fenotipo. Esto se suma a la molecular, electrofisiológicos, y pruebas de formación de imágenes tsombrero también se puede obtener en el mismo modelo animal. Usando el ensayo de escalada, otros han reproducido con éxito los defectos de motor en las moscas mutantes para genes interrumpiendo la locomoción humana. Sin embargo, investigaciones anteriores han demostrado que los cambios patológicos podrían preceder a la detección de defectos de locomotoras por varios días 14. Este fenómeno también se observa en enfermedades neurodegenerativas humanas, donde hablamos de los cambios subclínicos. Creemos que mediante la comprensión y el tratamiento de estos cambios subclínicos, modificación de la enfermedad se podría mejorar en gran medida.
Presentamos aquí un modelo que permite la detección de defectos de locomoción leves que pueden ayudar con la comprensión del pasaje de "presintomático para sintomática" de la patología neurodegenerativa mediante un modelo de Drosophila. Muchos grupos han utilizado una distancia corta escalada (10.05 cm), pero, aumentamos la distancia a 17,5 cm como en Palladino et al. 20. Aunque esta diferenciaentre las alturas de escalada pueden parecer menor, el aumento de la altura se destina a aumentar la dificultad de ensayo, ayudando de ese modo en la identificación de los defectos comparativamente menores de escalada. Además, algunos métodos eligieron para iluminar la parte superior del cilindro con una lámpara de fibra óptica, para tomar ventaja de la respuesta phototaxic de adulto Drosophila. Sin embargo, la fuente de luz puede provocar reflexión de la luz dentro del cilindro; por lo tanto, una fuente de luz fluorescente sobrecarga difusa se utiliza en su lugar. Además, la mutación en los genes implicados en la neurodegeneración puede afectar la función del ojo y por lo tanto sesgar los resultados. El aumento en el tamaño de la muestra de 10 a 20 moscas aumenta el poder estadístico de cada ensayo. Inicialmente, hemos aumentado este número hasta un máximo de 30 moscas, pero se redujo posteriormente a fin de minimizar los efectos de hacinamiento y de interacción entre las moscas. Las muestras se desechan después de un solo uso, en lugar de ser una duración de cuatro ensayos de repetición por muestra, para eliminar el possibility del aprendizaje o la fatiga. Debido a las moscas con muy bajo rendimiento de escalada, era contraproducente para registrar el tiempo necesario para que el 50% de las moscas para cruzar la línea de meta para que podría tomar una cantidad considerable de tiempo para que estos criterios que deben cumplirse. Más bien, las moscas se les dio una duración de 2 minutos para cruzar la línea de meta. El número de moscas para cruzar la línea fue grabado y desechado en incrementos de 10 segundos, y el valor resultante expresada como porcentaje.
Estas condiciones crean son una evaluación más sensible de las capacidades de escalada de una mosca adulta. Mientras que otros diseños del ensayo son todavía útiles, este paradigma puede ser considerado en casos en los que se investigan los primeros defectos leves. Además, este ensayo puede ayudar a detectar cambios pequeños en el contexto de los ensayos de medicamentos.
Una cuestión importante es que el comportamiento negativo geotaxis se basa en las moscas están aprovechando a la parte inferior del cilindro. Es therefmineral importante evaluar otras formas de locomoción, como en una superficie plana o de vuelo. Deben ser considerados como potenciales confundir Otros aspectos como la motivación y la interacción social. Otra advertencia es que el ensayo presentado solamente permite evaluar la locomoción en moscas adultas. Esto limita la capacidad para obtener correlatos neuropatológicos para el comportamiento observado que es muy importante en la comprensión de la patogénesis de una enfermedad. De hecho, la mayoría del trabajo de neuroimagen se ha hecho en la unión neuromuscular larva hasta ahora en Drosophila. La obtención de la conducta en la locomoción larva puede ser un paso importante con el fin de llamar la correlación directa entre el comportamiento y cambios patológicos.
Es muy importante para controlar la temperatura y la humedad a la que las moscas se crían y probados. Además del efecto sobre el desarrollo de la mosca, estos factores tenían un efecto importante en la capacidad de escalada de moscas planteadas y almacenados en condiciones no ideales. En el presencia de un aumento de la electricidad estática o la humedad, las moscas no realizó de manera óptima. Este efecto no fue igual para todos los genotipos, moscas mutantes generalmente está más afectada por factores tales que los controles. Además, los cilindros tienen que ser lavada y secada correctamente entre cada experimento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
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