Abstract
Locomotief defecten als gevolg van neurodegeneratieve aandoeningen kan een late onset symptoom van de ziekte zijn, na jaren van subklinische degeneratie, en dus de huidige therapeutische behandeling strategieën zijn niet curatief. Door het gebruik van exoom sequencing, een groeiend aantal genen geïdentificeerd die een rol spelen bij menselijke voortbeweging. Ondanks de identificatie van deze genen, is het niet bekend hoe deze genen cruciaal zijn voor normale werking loc. Daarom is een betrouwbare test, die modelorganismen gebruikt om de rol van deze genen te helderen om nieuwe targets te identificeren van therapeutisch belang, is meer dan ooit nodig. We hebben een gesensibiliseerd versie van de negatieve geotaxis test die het mogelijk maakt voor de detectie van mildere gebreken eerder en heeft de mogelijkheid om deze gebreken te evalueren in de tijd gemaakt. De test wordt uitgevoerd in een glazen maatcilinder, die is afgedicht met een was barrièrefilm. Door het verhogen van de drempel afstand te klom naar 17,5 cm en het verhogen van de duur van het experiment tot 2 min hebben we een grotere gevoeligheid bij het opsporen van milde disfuncties mobiliteit waargenomen. De test is kostenbesparend en vereist geen uitgebreide training op zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dit maakt het een uitstekende techniek voor het screenen van kandidaat-medicijnen in Drosophila mutanten met motoriek gebreken.
Introduction
Verwoestende neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofe laterale sclerose, en erfelijke spastische paraplegie worden steeds meer erkend. Helaas zijn de meeste van deze neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds geen behandeling. Het wijdverspreide klinische toepassing van genoom-brede, onpartijdige genetische tests zoals exoom sequencing heeft geleid tot een toenemend aantal genen spelen een rol in humane reumatische ziektes. Ondanks deze vooruitgang, de pathologische voortgang van vroeg tot laat stadium, blijft ongrijpbaar in deze aandoeningen. Drosophila biedt een met de genetische tools voor het bestuderen van gen vereiste in een gecontroleerde ruimtelijke en temporele manier. Daarnaast heeft Drosophila nuttig bij het screenen van drugs voor neurologische aandoeningen zoals Parkinson 1, Alzheimer 2, verstandelijke beperking 3,4- en 5,6 epilepsie oa bewezen. Ons doel was om een rendabele ontwikkelingen betrouwbare test die zou hoge doorvoer analyse die nog steeds gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in de motorische prestaties op te sporen zou zijn mogelijk te maken.
Er zijn verschillende assays gebruikt om de effecten van genetische mutatie en / of milieu vast op Drosophila klimgedrag kwantificeren. Het merendeel van de testen te profiteren van de natuurlijke neiging van vliegen te beklimmen, die bekend staat als negatief geotaxis, of het klimmen test. Benzer 7 voorgesteld in 1967 dat de tegenstroom apparaat voor de studie van phototaxis ook kan worden gebruikt om gravitaxis bestuderen. Sindsdien Ganetsky 8 en vele anderen 9 -12 hebben gebouwd op de eerste test. Het principe is om een bekend aantal vliegen te plaatsen in een flesje en tik het flesje sterk tegen een hard oppervlak, waardoor de vliegen naar de bodem van de flacon te vallen. Aangezien het een aangeboren gedrag, zal de vliegen proberen te klimmen naar de top van de flacon, tegen de zwaartekracht. Deze test is kwantitatief en measures hoeveel vliegen hebben beklommen langs een marker op de flacon tijdens een toegewezen periode. Meting van de snelheid in plaats van het totale aantal vliegen klimmen is een betrouwbare parameter en getoond defecten wanneer het aantal vliegen criteria was niet significant 13.
The climbing assay is nuttig gebleken bij het bestuderen van vele neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson 14. Echter, we opgemerkt dat locomotief gebreken niet detecteerbaar kan worden op tijd waar neurodegeneratie al wordt gezien in pathologische studies 14. Aldus kan het gebruik van de traditionele test de mogelijkheid om de vroege stadia van pathogenese te bestuderen beperken. Het uiterlijk van de locomotief defecten tijdens de latere stadia van de pathologie kan een ziekte waarvan de progressie is te geavanceerd voor volledige redding weerspiegelen.
Dit brengt het probleem met de gevoeligheid van de traditionele klimmen assay. De potentiële onvermogen van de tranele klimmen assay milde loc defecten detecteren te wijten aan de hoogte waarop de vliegen moeten klimmen. De traditionele assay 15,16 meet het aantal vliegen met succes klimmen over een hoogte van 2-5 cm in 10-20 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Onderzoek naar Drosophila melanogaster in overeenstemming was met de Universiteit van Alberta onderzoek richtlijnen.
1. Fly Collection
- Verzamel 20 vliegen met behulp van CO 2 (g) verdoving en plaats in een 25 mm x 95 mm verzameling flacon met voedsel.
- Store flesjes met vliegt horizontaal om te voorkomen dat het vangen van vliegen in alle vloeistoffen die kunnen zich ophopen in de bodem van de flacon.
- Incubeer vliegen gedurende ten minste 21 uur bij 22 ° C bij 45% vochtigheid in een incubator gedurende ongeveer 15 uur. Stel de incubator met een 12 uur licht: donker cyclus.
2. Climbing Assay
- De volgende ochtend, transfer 20 vliegt van één ampul in een 250 ml glazen maatcilinder. Markeer de positie van de cilinder te houden constant dagelijks. Gebruik een glazen cilinder per genotype om kruisbesmetting tussen de genotypen voorkomen. Wassen bij elke proef en rotate hen tussen genotypen.
- Het gedrag van de experimenten in omgevingslicht (of rood licht als er een potentieel defect in zicht) bij een temperatuur en vochtigheid van 22 ° C en 40% respectievelijk. Circadiane ritme verwarren voorkomen, altijd experimenten uit te voeren op hetzelfde tijdstip.
- Dicht de bovenste cilinder met een barrièrefilm (waslaag) om het ontsnappen van vliegen te voorkomen (Figuur 2).
- Stel de video camera op een statief. Focus camera op de 190 ml regel van de 250 ml maatcilinder (17,5 cm).
- Tel het aantal dode vliegen op de bodem van de cilinder en in het voedsel flesjes. Noteer dit nummer als de sterfte.
- Zeer licht tik op de cilinder tegen een gesloten cel foam pad herhaaldelijk met genoeg kracht om de vliegen te verplaatsen naar het binnenste onderste oppervlak. Tik 5-10 keer terwijl met de andere hand te drukken record op de camera.
- Druk op de "Record" knop op de camera.
- Start de video camera opnemen en tik op de cilinder zes keer in een uitgesproken niet-ritmisch patroon.
- Voer elke proef gedurende 2 minuten vanaf het moment dat de laatste vliegen worden afgetapt en registreer het aantal vliegen die de hoogte van 17,5 cm (190 ml) op elk tijdstip gekozen (kwantificeren iedere 10 sec). Opmerking: Het ml merkteken op de cilinder varieert van één cilinder model naar het andere afhankelijk van de diameter. Om fouten te voorkomen, meet de hoogte op elke cilinder gebruikt.
- Nadat de proef is beëindigd, gooi vliegen in 95% ethanol.
- Herhaal stap 2,1-2,9 totdat alle replicaten werden getest met verse vliegen elke keer.
Noot: Hoewel 5 replicaten genoeg met een mutatie die een sterk effect op beweging kan zijn, 10 biologische replicaten van 20 vliegen (200 vliegen) aanbevolen om kleinere verschillen te detecteren. - Na voltooiing van het experiment, was de cilinders in het lab vaatwasser en droge O / N te worden hergebruikt.
3. Analyse
- AnalyZe video's van elk vliegen proef. Elke 10 sec, nemen het totale aantal vliegen dat de doellijn passeert.
- Als een vlieg klimt terug naar beneden of daalt, record dat vliegen als -1 en tel de volgende vlieg op de doellijn te steken als het hetzelfde nummer als de vlieg die weer naar beneden geklommen of gedaald. Als bijvoorbeeld de 15 ste fly beneden de doellijn, de volgende vliegen de lijn (de 16 ste fly) wordt beschouwd als de 15 ste vliegen en niet de 16 ste steken.
- Trek de sterfte van het totale aantal vliegen (20) om het aantal vliegen die nog in het proces te verkrijgen. Op elk tijdstip, verkrijgen de fractie vliegen boven de doellijn.
- Plot elk percentage op elk tijdstip (zie figuur 3).
- Analyseer de prestaties op de 120 sec gegevenspunt en het uitvoeren student t-test bij 2 groepen aanwezig zijn of ANOVA en post-test voor meervoudige vergelijkingen (met Bonferroni aanpassing van geplande en ongeplande Tukey comparisons). De Kolmogorov-Smirnov test 17 wordt ook uitgevoerd om normaliteit en gelijke verdeling bepalen maar ook om de verdelingen van de mutant groep te vergelijken met de controle.
- Om data over veroudering presenteren plot het percentage vliegen klimmen bij 120 sec met vliegen van verschillende leeftijden (2 dagen, 1 week, 2 weken) om te zien of er een progressieve tekort (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klimmen is een sterke en reproduceerbaar gedrag. Inderdaad, een dag oud wild-type vliegt bereikt de doelgroep afstand klimmen prestaties snel (25 - 30 sec). Mutant vliegen presenteren een reeks van prestaties van mild (of vertraagd) onvermogen te klimmen naar het doel te voltooien. We illustreren dit hier met twee verschillende mutante allelen. De eerste is een ernstig allel van het gen spastin veroorzaakt door een deletie van het volledige spastin gen (spa 5,75) 18. In deze lijn (spas 5.75 met TM6b) een dag oude vliegen niet WT klimmen prestaties te bereiken, zelfs na 2 min. Deze mutant lijn presenteert met ernstige gebreken, zelfs bij gebruik van de flacon-methode (Figuur 1A, B). Het voordeel van de hier voorgestelde werkwijze wordt groter als het bestuderen van een mutant van hetzelfde gen, maar met een onvolledige verwijdering uitgegeven door dezelfde groep (spa 17-7 met TM3) 18. Dan prestaties tot 8 dagen normaal (Figuur 1C-F (Figuur 3) of genetische interactie. Voor verder bewijs bevatten redding van de gedragsfenotype met de expressie van een wild-type eiwit voor het onderzochte gen. Voor interactie studies, vergelijken vliegen die heterozygoot voor zowel mutaties van belang met vliegen, dat slechts één mutatie van belang zijn. De test maakt het ook mogelijk om de voortgang van het klimmen defect tijd een belangrijk aspect bij het modelleren progressive locomotorische stoornissen (figuur 4) te volgen. Bovendien, 2 min mogelijk maken beter te zien de progressie van het klimmen in ernstige mutanten.
Figuur 1. Vergelijking van verschillende assays klimmen. Voor ernstige mutaties verschillende mate klimmen defect blijkt op verschillende manieren, maar milder mutaties kunnen niet worden gedetecteerd met een aantal assays. Om dit aan te tonen gebruikten we twee gepubliceerde mutantlijnen voor het gen spastin. Spastin 5-75 die een volledige deletie van het gen en spastin spastin 17-7 die een gedeeltelijke deletie van de spastin-gen bevat (A) Ten eerste wordt climbing beoordeeld door het hebben van vliegen klim naar de top van een lege voedsel flacon. Het aantal vliegen aan de bovenkant na 18 seconden opgenomen. Met dit protocol significante afwijking wordt waargenomen in Spast 5-75 / TM6b in vergelijking met wild-type controles (N = 10, p <0,001). (B) Vervolgens Stijgvermogen wordt bepaald volgens de hieronder beschreven werkwijze. Klimmen is ook d efective in hetzelfde genotype Spast 5-75 / TM6b. Het verschil in uitvoering is zeer significant (N = 5, p <0,001), maar het verschil in prestaties groter. Voor mutaties aangetoond dat minder effect hebben gedacht (bijv Spast 17-7 bevat een gedeeltelijke verwijdering van spastin gen), de cilinder methode hier gepresenteerde kunnen meer gevoelig zijn. (C) Geen significante defect wordt waargenomen met 3 dagen oud spast 17-7 / TM3 de flacon methode (N = 5). (D) geen significante afwijking wordt waargenomen met 3 dagen oud spast 17-7 / TM3 de cilinder methode (N = 5). (E) een niet-statistische trend wordt genoteerd met 8 dagen oud spast 17-7 / TM3 vliegt (N = 5). (F) Maar betekenis wordt waargenomen voor 8 dagen oud spast 17-7 / TM3 getest met de cilinder werkwijze voorgesteld voor hetzelfde aantal herhalingen (N = 5, p <0,001).rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische weergave van de experimentele opstelling. 20 vliegen worden ingebracht in een glazen cilinder en vervolgens afgedekt met een was barrièrefilm. De vliegen worden dan getapt naar de bodem en het aantal vliegen het oversteken van de middellijn wordt opgenomen met een camera voor 120 sec. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten van het klimmen experiment. Het percentage vliegen geslaagd de drempel lijn wordt vertegenwoordigd elke 10 seconden over de duratieen van de assay. In dit experiment, 3 genetisch passende controles (wild-type, UAS spa -RNAi / +, Elav-GAL4 / +) worden vergeleken met transgene vliegen die zowel UAS en Gal4 componenten (Elav-GAL4 / UAS spa -RNAi). De UAS spa-RNAi is vanaf VDRC # 108.739. Deze voorstelling maakt voor de beoordeling van de snelheid van het klimmen voor elk genotype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve grafiek voor verouderingsprofiel. Aangezien veel reumatische ziektes progressief zijn, is het belangrijk om de ontwikkeling te beelden in de tijd. In deze grafiek wordt vergeleken met WT vliegen heterozygote mutanten (spa / WT) en trans-heterozygote mutanten (spast5-75 / spast17-7) en 2 dagen (A) en 8 dagen (B)(N = 10, p <0.001). Resultaten worden ook afgebeeld in de tijd voor 120 sec. tijdstip (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila reeds bewezen een uitstekend model van de ziekte 14 en andere neurodegeneratieve aandoeningen Parkinson 1,2 zijn. Naast de genetische gereedschap in Drosophila, is het genoom in hoge mate geconserveerde genen die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen 19. De komst van genoomwijde genetische screening methoden (met inbegrip van exoom sequencing) is waarschijnlijk blijven een grotere lijst van kandidaat-genen geassocieerd met menselijke bewegingsstoornissen bieden. Het ontwikkelen van behandelingen voor deze aandoeningen wordt diermodellen vereisen ons begrip van de pathologie die betrokken zijn bij de vroege stadia van neurodegeneratie verhogen. Het gebruik van Drosophila en negatieve geotaxis test verschaft een goedkope en betrouwbare methode om genen betrokken bij loc afwijkingen te laten en vervolgens screenen kandidaat geneesmiddelen op fenotype te redden. Dit draagt bij aan de moleculaire, elektrofysiologische en imaging bewijzen thoed kan ook worden verkregen in hetzelfde diermodel. Met behulp van de klimmen assay, anderen hebben succes motor defecten in vliegen gemuteerde genen gereproduceerd voor het verstoren van de menselijke motoriek. Toch heeft eerder onderzoek aangetoond dat pathologische veranderingen het opsporen van defecten locomotief kon voorafgaan door een aantal dagen 14. Dit verschijnsel wordt ook waargenomen in humane neurodegeneratieve aandoeningen waarbij er sprake van subklinische veranderingen. Wij geloven dat door het begrijpen en behandelen van deze subklinische veranderingen, ziekte modificatie worden sterk verbeterd.
We stellen hier een model dat de detectie van milde voortbeweging defecten die kunnen helpen bij het begrijpen van de overgang van "presymptomatische symptomatische" neurodegeneratieve pathologie met een Drosophila model maakt. Veel groepen hebben een korte klimmen afstand (5-10 cm) gebruikt, maar, we verhoogde de afstand tot 17,5 cm als in Palladino et al. 20. Hoewel dit verschiltussen climbing hoogten lijkt gering, de lengtetoename beoogde de assay moeilijkheid verhogen, waardoor wordt bijgedragen aan de identificatie van de betrekkelijk kleine klimmen gebreken. Ook sommige werkwijzen ervoor gekozen om de bovenkant van de cilinder met een fiber-optic lamp verlichten, om te profiteren van de phototaxic respons van volwassen Drosophila. Echter, kan de lichtbron lichtreflectie in de cilinder veroorzaken; Aldus wordt een diffuus overhead TL-lichtbron in plaats daarvan gebruikt. Bovendien kunnen mutaties in genen die betrokken zijn bij neurodegeneratie ogen functie beïnvloeden en derhalve vertekening van de resultaten. De toename van de steekproefomvang 10-20 vliegen verhoogt het onderscheidingsvermogen van elke proef. Aanvankelijk, verhoogden we dit aantal oplopen tot 30 vliegen, maar werd vervolgens om de overbezetting en interactie-effecten tussen vliegen minimaliseren verminderd. De monsters worden na eenmalig gebruik weggegooid, in plaats loopt vier herhaalde proeven per monster, de p eliminerenossibility van leren of vermoeidheid. Door vliegen met extreem slechte Stijgvermogen was contraproductief om de tijd die nodig is voor 50% van de vliegen de doellijn overschrijden opnemen kan het een aanzienlijke tijd duren voordat dit criterium is voldaan. Eerder werden vliegt krijgt een looptijd van 2 minuten naar de doellijn te steken. Het aantal vliegen over de streep werd opgenomen en weggegooid in stappen van 10 sec en de resulterende waarde in procenten.
Deze omstandigheden maken, zijn een gevoeligere beoordeling van een volwassen vlieg klimmen mogelijkheden. Terwijl andere ontwerpen van de test zijn nog steeds nuttig, kan dit paradigma worden overwogen in gevallen waarin milde vroeg afwijkingen worden onderzocht. Daarnaast kan deze test te detecteren kleinere veranderingen in de context van geneesmiddelenonderzoek.
Een belangrijk punt is dat het negatieve geotaxis gedrag gebaseerd op de vliegen wordt onttrokken aan de bodem van de cylinder. Het is thereferts het belangrijk om andere vormen van beweging, zoals op een vlakke ondergrond of vlucht te beoordelen. Andere aspecten als motivatie en sociale interactie moeten worden beschouwd als potentiële verwarren. Een ander nadeel is dat de test gepresenteerd kan slechts één op de motoriek evalueren bij volwassen vliegen. Dit beperkt de mogelijkheid om neuropathologische correlaten voor het gedrag waargenomen dat zeer belangrijk begrip van de pathogenese van een ziekte in aanmerking. Inderdaad, de meeste neuroimaging werk gedaan bij de larve neuromusculaire junctie dusver in Drosophila. Het verkrijgen van motoriek gedrag in larve kan een belangrijke stap om de directe correlatie tussen gedrag en pathologische veranderingen te trekken.
Het is heel belangrijk om de temperatuur en vochtigheid waarbij de vliegen worden verhoogd en getest controleren. Naast het effect op vlieg ontwikkelen, deze factoren hebben een belangrijke invloed op het klimvermogen vliegen verhoogd en opgeslagen in een niet-ideale omstandigheden. In de presence van verhoogde statische elektriciteit of vocht, heb vliegen niet optimaal presteren. Dit effect was niet gelijk zijn voor alle genotypes, mutant vliegen gewoonlijk wordt sterker beïnvloed door factoren dan controles. Bovendien moeten cilinders worden gewassen en droog zijn tussen elk experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| Computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point. |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).
