Summary
Comet assay måler DNA pauser, forårsaket av ulike faktorer. Dersom alle faktorene (unntatt oksidativt stress) som forårsaker DNA-skade blir holdt konstant, er mengden av DNA-skade en god indirekte parameter for oksidativt stress. Målet med denne protokollen er å bruke kometmetoden for indirekte måling av oksidativt stress.
Abstract
Høyere eukaryote organismer ikke kan leve uten oksygen; ennå, paradoksalt nok, kan oksygen være skadelig for dem. Den oksygenmolekyl er forholdsvis kjemisk inert fordi den har to uparede elektroner befinner seg i forskjellige pi * anti-bindings orbitaler. Disse to elektroner har parallelle spinn, noe som betyr at de roterer i samme retning om sine egne akser. Dette er grunnen til oksygenmolekylet er ikke svært reaktive. Aktivering av oksygen kan skje ved to forskjellige mekanismer; enten ved reduksjon via en elektron gangen (enverdig reduksjon), eller ved absorpsjon av tilstrekkelig energi for å reversere spinn av en av de uparede elektroner. Dette resulterer i produksjon av reaktive oksidative arter (ROS). Det finnes en rekke måter på hvilke det menneskelige legeme eliminerer ROS i sin fysiologiske tilstand. Hvis ROS produksjon overstiger reparasjonskapasitet, oksidativt stress resultater og skader forskjellige molekyler. Det finnes mange forskjellige metoder som oksidativt stress kan være megasured. Dette manuskriptet fokuserer på en av metodene nevnt celle gelelektroforese, også kjent som "komet assay", som tillater måling av DNA-bryter. Dersom alle faktorer som er kjent for å forårsake DNA-skade, annet enn oksidativt stress holdes konstant, er mengden av DNA-skade målt ved komet assay en god parameter for oksidativt stress. Prinsippet er enkelt og bygger på det faktum at DNA-molekyler som er negativt ladet. Et intakt DNA-molekyl har en så stor størrelse at det ikke migrere under elektroforese. DNA-bryter, men hvis tilstede resultat i mindre fragmenter som beveger seg i det elektriske feltet mot anoden. Mindre fragmenter vandrer raskere. Som fragmentene har forskjellige størrelser det endelige resultat av elektroforese er ikke et distinkt linje, men snarere som en sammenhengende form av en komet. Systemet muliggjør en kvantifisering av den resulterende "Comet", og således av DNA-brudd i cellen.
Introduction
Comet assay ble først utviklet av svenske forskere Ostling og Johanson 1. DNA er en negativt ladet molekyl. Under elektroforese, mindre, skadede DNA-fragmenter reise raskere mot et positivt ladet anode to. Jo mindre DNA-fragmenter, for raskere sin vandring mot anoden danner en typisk "komet" med et "hode" som består av intakt og uskadet DNA og en "hale" som består av skadet DNA-fragmenter tre. Skadet DNA kan repareres ved forskjellige mekanismer i kroppen 4, som holder generering av DNA-bryter ganske balansert 5. Hvis, derimot, er balansen til fordel for DNA-bryter, kan pausene akkumulere og vil til slutt bidra til utviklingen av en sykdom.
Vårt DNA lider ca 0.000165% skade på et gitt tidspunkt 6. Enkelttrådet DNA bryter referere til en feil på en av de to tråder av DNA-dobbeltspiralenmens doble DNA pauser er forårsaket når begge tilnærmingene av DNA dobbeltspiralen er skadet. Det er forskjellige faktorer som kan øke mengden av DNA-bryter på et gitt tidspunkt, slik som i en alder av cellen, sigarettrøyk, forskjellige medikamenter eller oksidativt stress 7-9. Dersom alle faktorer som fører til forbedrede DNA pauser holdes konstant, da kvantifisering av DNA bryter ved hjelp av komet-analysen er en god indirekte parameter for oksidativt stress.
Metoden for kometmetoden brukes stadig mer i dag i medisin inkludert oftalmologi. En grunn til dette er at oksidativt stress er mer og mer anerkjent som en patogenetisk mekanisme for ulike sykdommer 8-11 og kometmetoden er en metode som oksidativt stress kan indirekte kvantifiseres.
Protocol
Studier av kometen analysen utført ved universitetet i Basel, ble Department of Ophthalmology godkjent av lokale etiske komité Basel
1. Utarbeidelse av reagenser
- Forbered Dulbeccos fosfatbufret saltvann (PBS) (Ca ++, Mg ++ gratis) løsning ved å legge PBS (1 L pakke) og 990 ml dH 2 O til media. Juster pH til 7,4. Oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered lysende løsning: For å fremstille 1000 ml legge 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) og 10 mM Trizma base (1,2 g) i dH 2 O.
- Forbered elektroforese buffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) ved tilsetning av 30 ml 10 M NaOH og 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs til 1500 ml dH 2 O og bland godt. Totalvolumet er avhengig av gelboks kapasitet. Før bruk måle pH i buffer for å sikre en pH-verdi på> 13.
- Forbered nøytralisering buffer inneholdende 0,4 M Tris (48,5 g tilsatt til ~ 800 ml dH 2 O, justere pH til 7,5), konsentrert (& #62; 10 M HCl) i 1000 ml med dH 2 O. Oppbevar løsningen ved RT.
- Forbered fargeløsning. Å Etidiumbromid (EtBr, 10x Stock, 20 mikrogram / ml) tilsett 10 mg EtBr i 50 ml dH 2 O og oppbevar ved RT. For 1x Stock - bland 1 ml med 9 ml dH 2 O. Forsiktig! Håndtak EtBr med tilstrekkelig forholdsregler som det er en kjent kreftfremkallende.
2. Isolering av Leukocytter
- Skaff humane blodprøver (20 ml) med anti-koagulant som heparin ved hjelp av venepunksjon.
- Separer lymfocytter ved hjelp av en densitetsgradient celleseparator som Histopaque.
- I korthet fortynne blodet i forholdet 1: 1 med PBS eller RPMI (uten FBS) og lag over 600 ul celle-separator væske.
- Sentrifuger 1800 x g i 20 min ved 4 ° C. Aspirer "buffy" pels i 3-5 ml PBS / RPMI og sentrifugert ved 300 xg i 10 minutter for å pelletere lymfocyttene.
- Hente lymfocytter fra like over grensen mellom PBS (RPMI) Og celle-separator væske, ved hjelp av en pipette. Fjern de leukocytt-båndene fra grenseflaten mellom plasma og diafragmaet væskesjikt i hvert rør og samles opp i en 50 ml tube.
- Bringe det totale volum til 50 ml med kald Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM). Vask cellesuspensjonen tre ganger med DMEM ved 300 xg i 10 min.
- Telle det totale antall celler ved hjelp av en hemocytometer. Suspendere cellene i PBS og aliquote inn mikrosentrifugerør på 10 7 celler / tube.
- Pipetter 0,4 ml av cellene inn i en 5 ml engangs plastrøret. Tilsett 1,2 ml 1% lav-geleringstemperatur-agarose ved 40 ° C. Bland og raskt og pipettér 1,2 ml cellesuspensjon på agarose-dekket overflaten av en pre-belagt lysbilde. Unngå produsere bobler.
- La agarose til gel i ca. 2 min. Vær konsekvent med tid og temperatur som brukes for geling, og sørge for at agarose er fullt innstilt før nedsenke i lyseringsløsning. Etter fullt set, senk i lysende løsning på ~ 4 ºC.
3. Lysis og elektroforese
MERK: Prosedyren er beskrevet er for elektroforese henhold pH> 13 alkaliske forhold.
- Etter minst 2 timer på ~ 4 ºC, forsiktig fjerne lysbilder fra Lysing Solution. Sted glir siden av hverandre på den horisontale gelen boksen nær den ene ende, å skyve dem så nær hverandre som mulig.
- Fyll buffer reservoarer med rykende fersk pH> 13 elektroforese buffer inntil væskenivået dekker helt lysbilder (unngå bobler over agarose).
- La glir sitte i alkalisk buffer i 20 min for å tillate avvikling av DNA og ekspresjon av alkali-labil skade.
- Slå på strømmen til 25 volt (~ 0,75 V / cm) og justere gjeldende til 300 milliampere ved å heve eller senke buffernivå. Electrophorese lysbildene i 30 min.
- Slå av strømmen. Løft forsiktig lysbildene fra buffer og psnøre på en renne skuffen. Slipp klok frakk lysbildene med nøytralisering Buffer. Tillat lysbildene å sitte i minst 5 min. Renne lysbilder og gjenta to ganger til.
- Flekk lysbildene med 80 mL 1x Etidiumbromid (EtBr) og la stå i 5 min og deretter dukkert i kjølt destillert vann for å fjerne overflødig flekken. Deretter plasserer en dekkglass over raset og lagre dem umiddelbart. Butikken glir i en måned ved RT under tørre forhold.
MERK: Andre DNA-flekker (f.eks SYBR-grønn) kan også anvendes. Forsiktig! Bruk vernehansker som de fleste fargestoffer er mutagene.
4. Kvantifisering av DNA Breaks
- For å visualisere DNA-skader, observere EtBr-farget DNA skyve under en 40X objektiv fluorescerende mikroskop.
- Vurdere DNA-skade kvantitativt i cellene ved å måle lengden på DNA-migrasjon, og prosentandelen av migrerte DNA (figur 1A). Kvantifisere DNA-skader (figur 1B) ved Tail øyeblikket og Olive-moment. Definisjoner av Tail-Moment og Olive -Moment har tidligere fått 8-10.
MERK: Etter vår erfaring er det nok til å holde fast ved en av parametrene. Cellene er fotografert ved å sette automatisert verktøy som skanner gjennom mikroskop lysbilde og fotografier celler. Kvantifisering av DNA pauser kan gjøres ved bildeanalyse programvarepakker. Det finnes flere forskjellige programvarepakker som er spesiallaget for å ta bildet av cellene og kvantifisere DNA-skader. Vi anbefaler at du bruker den samme programvarepakken gjennom hele forsøket. Laboratoriet tekniker identifiserer intakt celle eller komet å bli scoret på datamaskinen, og klikk med musen på den. Kometen eller intakt celle blir deretter automatisk scoret.
Representative Results
Selv om fremgangsmåten for komet assay gjengir reproduserbare resultater, kan det være påvirket av en rekke faktorer. En slik faktor er hvorvidt eller ikke leukocyttene cryopreserveres før lysis og gel-elektroforese, eller om dette trinnet er utført på nylagede leukocytter. Figur 2 viser at i gruppe 2, hvor leukocytter ble oppbevart før lysering og gelelektroforese SS- DNA pausene var betydelig høyere enn i gruppe 1 der lyse og gel -electrophoresis ble gjort på nylagde celler.
Målingen kan også brukes til indirekte å vurdere systemisk oksidativt stress. Tabell 1 viser beskrivende statistikk for Tail øyeblikk og oliven øyeblikk i røykere og friske personer. Dataene viser at røyking en halv pakke sigaretter daglig mer enn dobler ssDNA pauser i de sirkulerende leukocytter 9.
Figur 1. (A) viser mikroskop brukes under kometmetoden analyse. (B) Δ viser en typisk "komet" med en lys hode og hale (skadet mindre DNA-fragmenter). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. ssDNA pausene var signifikant høyere når leukocytter ble oppbevart (gruppe 2) enn når nylagde leukocytter ble brukt før lyse og gel-elektroforese.
Discussion
Svenske forskere Ostling og Johanson var den første i sitt felt å bruke komet analyse for å kvantifisere DNA-skader i celler 1. De nøytrale betingelser at de to forskerne anvendes imidlertid bare tillot påvisning av dobbelttrådete DNA pauser. Singh et al. Senere tilpasset analysen for bruk under alkaliske betingelser, som produserte en sensitiv versjon som kunne vurdere dobbelt- og enkelt-trådete DNA-bryter og detektere alkali-labile områder 12. Siden den første utvikling, er analysen blitt modifisert på forskjellige trinn for å gjøre det egnet for å vurdere typer DNA-skade i forskjellige celletyper 13-15.
Som med alle teknikker, betaler strenge oppmerksomhet til tekniske detaljer er viktig å få nøyaktige resultater 16. Basert på vår erfaring, best resultat oppnås hvis alle metodisk steg fra løsning forberedelse til kometen kvantifisering-er utført av ekspert laboratorium technicians. Bruken av fersk og riktig forberedt media, tilstrekkelig pipettering teknikker, presis timing og (som tidligere nevnt i resultatene delen) bruk av nylagede leukocytter er avgjørende for lysering og gel elektroforese å oppnå nøyaktige resultater 17.
Alle de individuelle trinnene i denne analysen er like viktige for å oppnå pålitelige resultater. 16 Generelt er de beste resultater oppnås dersom hver enkelt metodiske trinn fra fremstillingen inntil oppløsningen komet kvantifisering er utført av ekspert lab technicians.Important synes bruk av friske og riktig forberedt media , tilstrekkelig pipettering teknikker, presis timing og som allerede nevnt i resultatene delen bruk av nylagede leukocytter for lysering og gel-elektroforese for å oppnå tilfredsstillende resultater fra analysen 17.
Som gjør andre metoder, har kometen analyseteknikken sin fortrinntages og ulemper. Å være en følsom metode, er analysen sårbare for faktorer (for eksempel UV lys) som kan utfylle DNA pauser og dermed påvirke resultatene. Enhver faktor som kan forsterke oksidativt stress, bortsett fra at det som blir undersøkt, bør unngås. Stressfaktorer kan øke nivået av oksidativt stress, ikke bare i leukocytter, men også i alle andre blod medier og lymfocytter. Som nevnt tidligere er det mange forskjellige og mer direkte måter å måle oksidativt stress 18,19. Kometen analysen er en av mange metoder som har visse fordeler. Disse inkluderer den relative lave kostnader, små antall celler som kreves (<10 000 celler), og dermed de små blodprøver som kreves per pasient, den relative kort tid som kreves for å kvantifisere DNA-skade i celler (ca. 3 dager), dets følsomhet og dens utbredt anvendbarhet til asses DNA-skader i ulike celletyper. I det siste velger vi å jobbe med leukocytter siden vi hadde erfaring med dennecelle-type, og det var anvendelig for den bestemte undersøkelsen planlagt. En annen fordel med kometmetoden er at den kan brukes til å detektere forskjellige typer og nivåer av DNA-skade, og kan således anvendes på forskjellige andre områder av undersøkelser i tillegg til oksidativt stress slik som DNA-reparasjons studier, kosttilskudd forsøk eller genotoksisitetsstudier.
Oksidativt stress er nå anerkjent som å spille en avgjørende rolle i patogenesen av flere sykdommer. Den kometanalysemetoden, mens en av mange måter å måle oksidativt stress 18,19, er relativt enkel, allsidig og billig. Når mestret, kan denne metoden brukes i alle områder av medisin der oksidativt stress spiller rollen 8-10,20,21.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke LHW Stiftung, i Triesen Liechtenstein, for økonomisk støtte til vår forskning på oksidativt stress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).
- Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).
- Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).
- Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).
- Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).
- Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
- Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).
- Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
- Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. , (2014).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
- Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
- Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).
- Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).
- Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
- Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
- Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. , 157-547 (2013).
- Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
- Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
- Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).
