Abstract
A capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho (ESC) para progenitores neurais permite o estudo dos mecanismos que controlam especificação neural, bem como a geração de tipos de células neuronais maduros para estudo posterior. Neste protocolo, descrevem um método para a diferenciação de ESC para progenitores neurais utilizando, cultura em monocamada sem soro. O método é escalável, eficiente e resulta num rendimento de ~ 70% de células progenitoras neurais dentro de 4-6 dias. Ele pode ser aplicado a partir de várias estirpes CES cultivadas sob uma variedade de condições. Progenitores neurais podem ser autorizados a diferenciar ainda mais em neurônios funcionais e glia ou analisados por microscopia, técnicas de citometria de fluxo ou moleculares. O processo de diferenciação é passível de microscopia de lapso de tempo e pode ser combinada com o uso de linhas de repórter para monitorizar o processo de especificação neural. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre a preparação de meios e optimização densidade celular para permitir que o processo abe aplicado a maioria das linhas de ESC e uma variedade de recipientes de cultura de célula.
Introduction
As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados 1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (corpos embrióides, EBS) em meio contendo soro suplementado com o ácido retinóico morfogénio 2-4. Uma vez que, em seguida, uma variedade de protocolos têm sido desenvolvidos para permitir a diferenciação neuronal 5. Muitos ainda utilizar agregação, os outros co-cultura com indução de tipos de células e vários envolvem a utilização de meios isentos de soro. Todos os protocolos tem vantagens umand desvantagens e a natureza precisa da neural ou células neuronais produzida também varia de acordo com o protocolo utilizado.
O protocolo ideal seria robusta, escalável e fazer uso de meios totalmente definidos e substratos, ser passíveis de monitorização não invasiva do processo de diferenciação e resultar na geração de populações puras de células progenitoras neurais capazes de ser modelado por sinais externos e para diferenciar em todos os subtipos neuronais e gliais com elevada eficiência e rendimento em relativamente pouco tempo. Nos últimos doze anos, temos vindo a utilizar um método para gerar progenitores neurais e neurônios de rato ESC em uma baixa densidade, cultura monocamada aderente sem soro 6-10. Este protocolo cumpre muitos dos critérios enunciados anteriormente: em nossas mãos a eficiência de diferenciação tem sido bastante consistente ao longo de muitos anos e uma variedade de linhas de células, ele pode ser escalado para cima ou para baixo (que usamos com sucesso navios de placas de 96 poços para 15 cm de diâmetro diela é) e os meios usados são bem definidos. O processo é passível de microscopia Timelapse para o controlo da diferenciação e uma variedade de padrões de sinais pode ser adicionado para induzir a geração de tipos distintos de subtipos neuronais (por exemplo, a Shh e Fgf8 para neurónios dopaminérgicos 6).
No entanto, existem alguns desafios para o sucesso da aplicação deste protocolo. Um dos aspectos fundamentais é uma preparação cuidadosa da mídia. Nós sempre preparar a mídia in-house, apesar da disponibilidade de alternativas comerciais. Um dos suplementos usados (N2; ver Protocol) tem modificações sobre o padrão versões disponíveis no mercado. Finalmente, uma das etapas mais importantes para a aplicação bem sucedida deste método é a densidade celular óptima para o chapeamento. Isto é principalmente devido ao passo que a natureza autócrina de um dos sinais indutores (FGF4 11) requer que as células estão presentes suficientes para permitir viabil óptimadade e diferenciação, em muito altas densidades diferenciação é prejudicada (possivelmente em parte devido à produção autócrina de LIF 12). Portanto, é importante que a preparação ambos os meios e revestimento celular são realizadas com cuidado e de forma consistente para assegurar os melhores resultados.
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Protocol
1. Preparação de mídia
NOTA: O protocolo baseia-se na utilização de uma mistura de dois meios separados: DMEM / F12 suplementado com suplemento N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento B27, tipicamente numa proporção de 1: 1.
- Prepara-se o suplemento N2 modificado por mistura dos componentes num tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtrar este; misturar por inversão do tubo até a solução ficar clara.
- Iniciar pipetando 7,2 ml de DMEM / F12, em seguida adicionar 1 ml de 25 mg / ml de insulina (fez-se em 0,01 M de HCl) e misturar bem por inversão do tubo. É preciso um par de minutos até que a solução é clara.
- Adicionar 1 ml de 100 mg / ml de apo-transferrina (preparados em água), 33 ul de 0,6 mg / ml progesternone (confeccionados a partir de etanol), 100 uL de 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparados em água ), 10 ul de 3 mM de selenito de sódio (preparados em água) e 666 ul de 7,5% de albumina de soro bovino e misturar bem o tubo. Alíquota em 2,5 ml e armazenar a -20 °C por até 2 meses.
- Prepare a mídia.
- Para 250 ml de meio DMEM / F12 adicionar 2,5 ml de N2. Misture bem, mas não agite ou filtro.
- Para 250 ml de Neurobasal meios adicionar 5 ml de suplemento de B27. Misture bem, mas não agite ou filtro.
- Misture a mídia da passos 1.2.1 e 1.2.2 em uma proporção de 1: 1. Em alguns casos, uma mistura 1: mistura 3 pode ser necessárias (suplementado como o 1: 1 mistura no passo 1.2.4).
- Para a mistura de adicionar 0,5 mL de L-glutamina (concentração final 0,2 mM) e 3,5 ul de 2-mercaptoetanol (concentração final 0,1 mM) e misturar bem, sem agitação. Armazene a mídia a 4 ° C por até 3 semanas e evitar a exposição à luz. Esta mistura final é chamada N2B27.
- Preparar a solução de gelatina.
- Prepara-se uma solução de gelatina a 1% em água ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. É importante que o frasco utilizado para este está completamente limpa de detergentes ou os desinfectantes, então recomenda-se que uma nova garrafa éutilizado para isso e é sempre apenas lavado em água ultrapura entre utilizações. Alíquota da solução a 1% em 50 ml de partes alíquotas e manter a 4 ° C, durante meses.
- Aquece-se uma alíquota de 1% de gelatina em um banho de água a 37 C ° até se dissolver e adicionar a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato quente (PBS). Misturar bem e pipetar suficiente para cobrir o fundo de cada poço ou placa. Permitir que a gelatina para revestir a superfície durante pelo menos 30 min.
2. plaqueamento das células
NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC rato cultivadas em 10% de soro com fator inibidor de leucemia (LIF), a substituição de soro com LIF ou meios livres de soro com proteína LIF e morfogenética óssea 4 (BMP4) ou inibidores de MEK e GSK3 (media 2i) com ou sem LIF. No entanto, o momento ea eficiência da diferenciação pode variar dependendo da mídia e células (ver discussão). Para os experimentos mostrados aqui usamos a linha 46C rato ESC (que tem um repórter EGFP batido om dos alelos Sox1 endógenos), cultivadas em GMEM com 10% de soro e LIF. Para melhores resultados, é importante que as células são dissociadas e replated na mídia N2B27; simplesmente mudando de mídia a partir de GMEM / soro / LIF para N2B27 sempre resulta em uma redução da eficiência de diferenciação em relação ao repique das células.
- Cresça as células em GMEM com 10% de soro, 1 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 0,1 M de 2-mercaptoetanol, e 100 unidades / ml de LIF 13. Para obter uma cultura subconfluentes de rato ESC, placa 1 x 10 6 células em uma cultura frasco T25, que terá 2-3 dias.
- Observar células sob microscópio de campo brilhante. Quando as células são subconfluentes e pronto para passagem, lave-os duas vezes em PBS. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células e retornar para o incubador durante 2-5 min. Embora tripsina e outras enzimas podem também ser usados para dissociação de células, podem ter um impacto negativo sobre a ligação de células de modo que as densidades de plaqueamento terá de ser ajustÃsted.
- Uma vez que as células começam a levantar a partir da placa, toque no vaso para desalojar-los em uma suspensão de células individuais. Recolher as células para um total de 10 ml de meio de dissociação de células e reagente e pipeta para um tubo de centrífuga de 15 ml.
- Rodar as células a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de N2B27 pré-aquecido por pipetagem para cima e para baixo 3-5 vezes. Quando pipetando a suspensão para baixo, da pipeta contra o lado do tubo para evitar a criação de bolhas. Contar as células com um contador de células automatizado ou um hemocitómetro e registar a concentração.
- Prepara-se uma suspensão de células contendo o número desejado de células por unidade de volume a ser plaqueadas por cavidade em N2B27 pré-aquecido. Uma densidade de 10.500 células por cm 2 de um prato de 6 poços (isto é, 1 x 10 5 células por poço de um prato de 6 poços) é o ideal. Ver Tabela 1 para o número de células sugerido por cm 2 e PLAting volumes de suporte para uma variedade de recipientes de cultura de célula.
- Aspirar a gelatina a partir do vaso de cultura e placa a suspensão de células de acordo com a densidade e volume de sugerido na Tabela 1. Não rodar as placas de que este vai concentrar-se as células para o centro. Coloque as culturas numa incubadora húmida a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Mudança de mídia a cada 1-2 dias, a substituição de todos os meios de comunicação com N2B27 fresco. Pipeta suavemente como a lavagem das células pode afetar a densidade e diminuir a eficiência de diferenciação nos dias seguintes. Onde viabilidade inicial após o plaqueamento é pobre, placa as células em uma 1: 3 mistura dos meios de comunicação N2 e B27-suplementados e mudar isso para N2B27 após os dois primeiros dias. As células começam a diferenciar e deve mostrar expressão Sox1 (visível por fluorescência verde do repórter na linha celular utilizada aqui 46C) dentro de 4-6 dias.
3. Immunofluorescent Coloração
NÃOTE: O protocolo pode ser aplicado a qualquer tipo de navio. O volume de cada reagente é descrito por poço da placa de 6 poços e pode ser dimensionada para qualquer área de superfície. Repique não é recomendada devido à viabilidade baixa depois.
- Remover meio de diferenciação e fixar as células por adição de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldeído, deixar durante 15 min.
- Lavar e permeabilizar as células com 2 ml de PBS-T (solução salina tamponada com fosfato com 0,5% (v / v) de Tween-20) por duas vezes. As células podem ser mantidas em PBS-T, durante até 2 meses a 4 ° C.
- Substituir PBS-T com 1 ml de PBS-T com 10% (v / v) de soro (a partir da mesma espécie que o anticorpo secundário). Incubar 1 hora sobre o roqueiro placa à temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação não específica.
- Após 1 h, lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS-T, e incuba-se 500 ul de IgG de ratinho contra βIII-tubulina (diluída 1: 1000 em PBS-T, com 10% de soro). Colocar no prato oscilante, e deixar O / N a 4 ° C.
- A partir deste passo, sempre proteger o vasoda luz. Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 ul de anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com fluorescência (diluída a 2 ug / ml em PBS-T, com 10% de soro). Colocá-lo sobre a placa oscilante durante 1 h à TA.
- Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 mL de DAPI (diluído para 0,5 ug / ml em PBS-T) e deixar durante 5 min.
- Lavam-se as células novamente e mantê-las em PBS-T. As células estão prontas para ser fotografado e pode ser mantido por até 2 semanas a 4 ° C. Note que o sinal GFP desaparece ao longo do tempo, por isso é inadequado para comparar a intensidade GFP de células fixas e ao vivo ou de células fixadas em momentos diferentes.
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Representative Results
Nesta experiência, utilizou-se a linha de células de 14 46C, células estaminais embrionárias de ratinho com um endógeno Sox1-repórter GFP, para controlar a diferenciação neuronal. Utilizando esta linha celular, expressão de Sox1, um marcador para células progenitoras neurais, pode ser detectado por fluorescência verde. Chapeamento de densidade é um fator crítico para alcançar a diferenciação neuronal. Células estaminais embrionárias de ratinho foram plaqueadas em placas de 6 poços em diferentes densidades variando de 10.500 a 88.500 células / cm2. A Figura 1A mostra a eficiência de diferenciação obtidos por diferentes densidades de plaqueamento em uma placa de 6 poços. No dia 6 de diferenciação, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas para o marcador neuronal βIII-tubulina. No densidade óptima (10.500 células / cm2), as células diferenciadas para progenitores neuronais e neurónios. Isso foi observado pelo sinal verde fluorescente de repórter Sox1-GFP e imunofluorescência contra o marcador neuronal, βIII-tubulina. A lower densidade de plaqueamento levado a morte de células dentro de 3 dias. No entanto, plaqueamento a muito alta densidade (> 36.500 células / cm2) resultou numa diminuição da proporção de células verdes e células positivas βIII-tubulina. A Figura 1B mostra um experimento realizado numa placa de 96 poços que levou cerca de 10 vezes mais elevada densidade celular para atingir o óptimo (155.000 células / cm2) e o muito confluente (362.500 células / cm 2) nível.
Densidade ideal pode ser diferente entre os preparativos da mídia, componente de mídia e lotes de células, tipos de células, ou condições de cultura anteriores. Recomenda-se para optimizar a densidade de revestimento para cada experiência. A Tabela 1 apresenta gamas de densidades de plaqueamento eficazes em diversas plataformas que devem ser incluídos no passo de optimização. Dentro desta gama, deve ser possível obter uma densidade que dá uma boa eficiência de diferenciação dentro de 4-6 dias.
Durante a diferenciação ESC gradualmente mudar sua morfologia. A Figura 2 mostra células e de colônias morfologia do dia 1 ao dia 6 após o plaqueamento em 6 bem-placa em 10.500 células / cm 2. As células foram cultivadas em condições de diferenciação e fotografou todos os dias. Não é incomum ver a morte celular significativa nos primeiros dias, devido à extrema mudança na condição de cultura. No entanto, as células restantes são ainda capazes de se diferenciarem. No dia 4, as células começaram a tornar-se progenitores neurais como sinal fluorescente verde de Sox1-GFP repórter apareceram em primeiro lugar. No entanto, mesmo no dia 6, nem todas as células são Sox1-positiva. A existência de algumas células não-neuronais é esperado, no entanto, em condições apropriadas, a maioria das células será neural.
Figura 1. O efeito da densidade de revestimento sobre a eficiência de diferenciação. Dois diferentedensidades de células repórter Sox1-GFP (46C) foram semeadas e diferenciadas de acordo com o protocolo durante 6 dias. (A) A diferenciação em uma placa de 6 poços. (B) A diferenciação numa placa de 96 poços. Barra de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. morfologias celular durante o processo de diferenciação. 46C CES foram diferenciadas em 10.500 células por cm2 numa placa de cultura de 6 poços e fotografado diariamente para observação de mudanças na morfologia celular. Barra de escala:. 300 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Plataforma | Gama de densidade efectiva (células / cm2) | Faixa do número de células até ao prato | Volume de mídia inicial sugerido (ul) | Sugestão de volume de mídia após o dia 1 (ul) |
| 6-poços | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1000 | 2000 |
| Placa de 24 poços | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1000 |
| Placa de 96 poços | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |
Tabela 1. sugestão de chapeamento de densidades e volumes de mídia para diferentes tamanhos de vasos. As densidades de revestimento desta tabela foram determinados utilizando a linha de células 46C. Para melhores resultados, a densidade de revestimento de cada linha individual pode ter que ser adjusted.
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Discussion
O protocolo de diferenciação neural monocamada tem sido usado por mais de uma década 6. O protocolo é altamente eficiente, composto de meio definido, e feito de um sistema de monocamada que torna o sistema mais aplicável para pré-clínica (por exemplo, o rastreio de fármacos) usa. No entanto, existem alguns factores críticos que determinam a eficiência de diferenciação. Este artigo aponta esses fatores ea solução para cada obstáculo.
Densidade das células após o plaqueamento, no estado de diferenciação é, talvez, o factor mais crítico. Plaqueamento das células em demasiado alta densidade reduz a eficiência de diferenciação, enquanto que o plaqueamento em muito baixa densidade leva à morte celular. Este fenómeno é provavelmente devido à sinalização do factor de crescimento autócrino. FGF4 é um factor de crescimento autócrino que ativa a cascata de MAPK e dirige ESC diferenciação 11. LIF é outra citocina produzida por ESC. Ele ativa a via STAT3 e promove a auto-renovação <sup> 15. Este protocolo faz uso de N2B27 para fazer células neurais. N2B27 contém vários factores que permitem a sobrevivência ESC e promove o crescimento de células neurais, e não contém ou LIF ou BMP4 que inibem a diferenciação neural 6. No densidade adequada, um equilíbrio adequado de FGF4 e LIF de sinalização que permite que seja mantida ESC para diferenciar. Em alta densidade, quantidade excessiva de LIF autocrine e BMP diferenciação de inibição. Em contraste, as células em muito baixa densidade ter prejudicado a sobrevivência nestes meios mínimos. Assim, quando um grande número de células sem diferenciação aparecer o número de chapeamento deve ser reduzida, enquanto que é necessário um aumento do número de células chapeamento se morte celular significativa é observada.
Além do número de células, existem alguns outros factores que afectam indirectamente densidade de plaqueamento. O primeiro factor é a concentração celular local, dependente da técnica usada para distribuir uniformemente as células sobre a superfícieárea. Descobrimos que roda o poço não é o ideal, uma vez que concentra as células para o centro do poço, e faz com que a densidade no centro demasiado elevado, enquanto que na periferia da densidade torna-se demasiado baixo. Outras técnicas de mistura, por exemplo, misturando os meios de comunicação com as células antes do plaqueamento, ou balançar o lado-a-lado prato são recomendados. Além disso, quando um recipiente é colocado na incubadora, aquecimento irregular do meio provoca uma força de convecção que atrai as células para o centro do poço, resultando na distribuição das células num padrão de anéis concêntricos. Um volume de suporte inferior no dia chapeamento é recomendada para reduzir este efeito. Deixando a placa fora da incubadora durante 30 minutos para permitir que as células fixar, assim como aquecer o meio antes da mistura também pode ajudar a conseguir uma densidade de revestimento homogénea.
Em segundo lugar, o tipo de navio também afecta chapeamento de densidade. A Figura 1 mostra claramente que o número de células / poço pode ser não linearmente scaconduzido para a área de superfície de diferentes vasos (em outras palavras, o mesmo número de células / área de superfície não pode ser aplicada a cada tipo de navio). Um recipiente mais pequeno (com maior proporção de volume / área) é mais afectado pela tensão superficial meios de comunicação que faz com que uma superfície côncava de forma, o chamado menisco. A tensão superficial empurra as pilhas para a borda do poço e diminui a densidade no centro. Além disso, desde que o volume de mídia na pequena embarcação é baixa, media aquecer rapidamente, reduzindo a força de convecção. Portanto, as células em uma pequena embarcação passará para a borda pelo efeito menisco, e não irá se mover para o centro por forças de convecção. Assim, quanto menor for o recipiente, mais elevada a densidade de revestimento necessária para obter a densidade óptima no centro.
Em terceiro lugar, a condição de as células antes do plaqueamento também afecta indirectamente densidade de plaqueamento e eficiência de diferenciação. Encontrámos uma variação da densidade óptima em algumas experiências. As experiências commaior taxa de mortalidade no primeiro dia necessária maior densidade de diferenciação eficiente. Culturas ESC no soro e LIF são compostas de uma população heterogênea de células pluripotentes virgens, células pluripotentes imunizadas, e até mesmo um pequeno número de células diferenciadas 16. As células deste tipo tem capacidade para sobreviver diferente e diferenciar sob condições de diferenciação. Uma vez que o protocolo dita no número, mas não o estado das células, algumas experiências pode começar com as células mais diferenciadas que morrem nos primeiros dias, levando a uma densidade mais baixa do que o esperado. Para evitar essa variação, cultura consistente de ESC é necessário para se certificar de que a proporção constante entre cada estado é mantida.
Além de densidade, o tempo é outro fator para alcançar a diferenciação eficiente. Nesta publicação, descreve-se a geração de células progenitoras neurais dentro de 6 dias. No entanto, o tempo pode ser diferente, dependendo do estado dea cultura de partida ESC. Como descrito acima, as culturas são ESC populações mistas que podem responder de forma diferente para a condição de diferenciação. Não só a sobrevivência de células, mas também o momento de diferenciação vai ser afectada pela composição cultura. Este protocolo pode ser aplicado a mais condições de cultura CES por exemplo, em meio contendo LIF N2B27 e BMP4, ou 2i e LIF. No entanto, se houver mais células naive em cultura, um período mais longo pode ser necessária para a diferenciação eficiente. Isso ocorre porque as células naïve vai precisar de mais tempo para mudar para um estado preparado e, em seguida, para diferenciar progenitores neurais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
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