Abstract
היכולת להבחין בתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) לאבות עצביים מאפשרת המחקר של מנגנוני שליטה מפרט עצבי, כמו גם את הדור של סוגי תאים עצביים בוגרים למחקר נוסף. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבידול של ESC לאבות עצביים באמצעות, תרבות monolayer סרום ללא. השיטה היא מדרגי, יעילה וגורמת לייצור של תאים עצביים ~ 70% בתוך 4-6 ימים. זה יכול להיות מיושם על ESC מזנים שונים גדלו תחת מגוון רחב של תנאים. יכולים להיות מותר אבות עצביים להבחין נוספת לנוירונים וגליה או ניתח תפקודיים על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה או מולקולרי טכניקות. תהליך ההתמיינות ניתנים למיקרוסקופיה זמן לשגות ויכול להיות משולב עם השימוש בקווי כתב כדי לפקח על תהליך המפרט העצבי. אנו מספקים הוראות מפורטות על הכנת תקשורת וצפיפות תאי אופטימיזציה כדי לאפשר את התהליך לbהדואר חל על רוב קווי ESC ומגוון כלי תרבית תאים.
Introduction
תאי גזע עובריים הם תאי pluripotent נגזרו מהעובר המוקדם עם היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה תוך השמירה על היכולת להתמיין לכל סוגי התאים בוגרים הבאים השבה לעובר בשלב מתאים (על ידי יצירת חזיון תעתועים), הזרקה למארחי syngeneic או מדוכאי חיסון (על ידי יצירת תפלצת) או בנושא המבחנה 1 רמזים מתאימים. הבידול במבחנה של תאי גזע העובריים של עכבר לשושלות עצביות תואר לראשונה בשנת 1995 ומעורב ההיווצרות של אגרגטים השעיה תאיים (גופי embryoid, EBS) בתקשורת סרום המכיל תוספת החומצה רטינואית מורפוגן 2-4. מאז מגוון רחב של פרוטוקולים פותחו כדי לאפשר בידול עצבי 5. רב עדיין לנצל צבירה, אחרים תרבות משותפים עם גרימת סוגי תאים וכמה כרוכים בשימוש בסרום ללא מדיה. כל הפרוטוקולים יתרונותND חסרונות ואת האופי המדויק של עצבי או תאים עצביים המיוצרים גם משתנים בהתאם לפרוטוקול בשימוש.
הפרוטוקול האידיאלי יהיה חזק, ניתן להרחבה ולעשות שימוש באמצעי תקשורת ומצעים מוגדרים באופן מלא, להיות נוח לניטור לא פולשני של תהליך הבידול ולגרום לדור של אוכלוסיות טהורות של אבות עצביים יכול להיות בדוגמת ידי רמזים חיצוניים ולהבדיל לכל תת עצבי וגליה עם יעילות גבוהה ותשואה בזמן קצר יחסית. בעשרות השנים האחרונות שכבר משתמשים בשיטה ליצירת אבות עצביים ותאי עצב מהעכבר ESC בצפיפות נמוכה, תרבות monolayer חסיד סרום ללא 6-10. פרוטוקול זה ממלא רב של הקריטריונים המפורטים לעיל: בידיים שלנו את היעילות של בידול כבר די עקבית לאורך שנים רבות ומגוון של שורות תאים, וניתן לשנות אותו או למטה (אנו משתמשים בהצלחה כלי מ96-גם צלחות ל די קוטר 15 סנטימטריםshes) והתקשורת משמשת הם מוגדר היטב. התהליך ניתנים למיקרוסקופיה בהילוך איטי לניטור של הבידול ומגוון של רמזי דפוסים ניתן להוסיף כדי לגרום לדור של סוגים שונים של תת עצביים (למשל, ששש וFgf8 לנוירונים דופאמין 6).
עם זאת, יש כמה אתגרים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. אחד ההיבטים המרכזיים הוא הכנה קפדנית של התקשורת. אנחנו תמיד להכין את התקשורת בבית למרות זמינותן של חלופות מסחריות. יש שינויים על תקן גרסאות זמינות מסחרי, אחד התוספים המשמשים (ראה פרוטוקול N2). לבסוף, אחד הצעדים החשובים ביותר ליישום מוצלח של שיטה זו היא צפיפות התאים האופטימלית בציפוי. זה בעיקר בגלל זמן שטבע autocrine של אחד מאותות התרמה (Fgf4 11) דורש כי תאים מספיקים נוכחים כדי לאפשר viabil האופטימליity ובידול, בבידול צפיפויות גבוהות מדי הנו פגום (אולי בחלק בשל ייצור autocrine של 12 LIF). לכן חשוב שהכנת שתי התקשורת וציפוי תא מבוצעות בזהירות ובעקביות כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה
הערה: הפרוטוקול מסתמך על השימוש בשילוב של שני כלי התקשורת נפרד: DMEM / F12 בתוספת תוסף שונה N2 וNeurobasal השלים עם תוסף B27, בדרך כלל בביחס של 1: 1.
- הכן את תוספת N2 שונה על ידי ערבוב הרכיבים בשפופרת 15 מיליליטר. לא מערבולת או לסנן זה; מערבב על ידי היפוך הצינור עד הפתרון הוא ברור.
- התחל על ידי pipetting 7.2 מיליליטר של DMEM / F12, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של 25 מ"ג / מיליליטר אינסולין (המורכב ב0.01 M HCl) ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך. זה לוקח כמה דקות עד שהפתרון הוא ברור.
- הוסף 1 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר apo-transferrin (מורכב במים), 33 μl של 0.6 מ"ג / מיליליטר progesternone (מורכב באתנול), של 160 מ"ג / מיליליטר (1 מ ') פוטרסין 100 μl (מורכב במים ), 10 μl של 3 מ"מ הסלניום נתרן (מורכבים במים) וμl 666 של 7.5% אלבומין בסרום שור ומערבבים היטב הצינור. Aliquot לתוך 2.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C עד 2 חודשים.
- הכן את התקשורת.
- 250 מיליליטר של DMEM / F12 להוסיף 2.5 מיליליטר של N2. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן.
- 250 מיליליטר של Neurobasal תקשורת להוסיף 5 מיליליטר של תוסף B27. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן.
- מערבבים את התקשורת מ1.2.1 צעדים ו1.2.2 ביחס של 1: 1. בחלק מהמקרים 1: ייתכן שתידרש 3 תערובת (בתוספת כ1: תערובת 1 בצעד 1.2.4).
- לתערובת להוסיף 0.5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 0.2 מ"מ) ושל 3.5 μl של 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי 0.1 מ"מ) ומערבבים היטב בלי ללחוץ. אחסן את המדיה ב- C ° 4 עד 3 שבועות ולהימנע מחשיפה לאור. מיקס סופי זה נקרא N2B27.
- הכן את פתרון ג'לטין.
- הכן פתרון ג'לטין 1% במי ultrapure וחיטוי ב 121 ° C, 15 psi, במשך 15 דקות. חשוב שהבקבוק משמש לכך הוא נקי לחלוטין מחומרי ניקוי או חומרי חיטוי, ולכן מומלץ שבקבוק חדש הואמשמש לזה ואי זה רק לשטוף במי ultrapure בין שימושים. Aliquot פתרון 1% ל -50 aliquots מיליליטר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
- לחמם aliquot של ג'לטין 1% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולהוסיף 500 מיליליטר של תמיסת מלח חם שנאגרו פוספט (PBS). מערבבים היטב וpipet מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של כל טוב או צלחת. לאפשר את הג'לטין למעייל המשטח לפחות 30 דקות.
2. ציפוי התאים
הערה: פרוטוקול זה חל באופן שווה על ESC העכבר גדל בסרום% 10 עם גורם מעכב לוקמיה (LIF), החלפת סרום עם LIF או סרום ללא מדיה עם חלבון LIF והמוךפו"גנטי עצם 4 (BMP4) או מעכבי MEK וGSK3 (תקשורת 2i) עם או בלי LIF. עם זאת, העיתוי והיעילות של הבידול עשוי להשתנות בהתאם לתקשורת ותאים (ראה דיון). לניסויים המוצגים כאן השתמשנו בקו 46C עכבר ESC (שיש לו כתב EGFP דפק לone של אללים Sox1 אנדוגני), גדל בGMEM עם סרום 10% וLIF. לקבלת תוצאות אופטימליות חשוב שהתאים הם ניתקו וreplated בתקשורת N2B27; פשוט המשתנה של תקשורת מGMEM / סרום / LIF לN2B27 תמיד תוצאות ביעילות בידול מופחתת בהשוואה לreplating התאים.
- לגדול התאים בGMEM עם סרום 10%, פירובט נתרן 1 מ"מ, חומצות אמינו לא חיוניות 1x, 0.1 מ '2-mercaptoethanol, ו 100 יחידות / מיליליטר LIF 13. כדי לקבל תרבות subconfluent של העכבר ESC, צלחת 1 x 10 6 תאים לבקבוק תרבות T25 שייקח 2-3 ימים.
- שים לב תאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כאשר התאים subconfluent ומוכנים למעבר, לשטוף אותם פעמים PBS. הוסף 1 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה ולחזור לחממה עבור 2-5 דקות. למרות טריפסין ואנזימים אחרים יכולים לשמש גם לתא דיסוציאציה, הם יכולים להיות השפעה שלילית על קובץ מצורף תא כך צפיפות הציפוי צריכה להיות adjusted.
- ברגע שהתאים מתחילים להרים מהצלחת, הקש על הכלי כדי לסלק אותם להשעית תא בודדת. לאסוף את התאים לסכום כולל של 10 מיליליטר של תקשורת ותא דיסוציאציה מגיב וpipet לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
- ספין התאים ב XG 300 דקות 3 ב RT.
- בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של N2B27 מראש חימם על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. כאשר pipetting ההשעיה למטה, pipet נגד הצד של הצינור, כדי למנוע יצירת בועות. ספירת התאים עם דלפק תא אוטומטי או haemocytometer ולהקליט את הריכוז.
- כן השעיה תא המכילה את המספר הרצוי של תאים ליחידת הנפח להיות מצופה בכל טוב בN2B27 מראש חימם. צפיפות של 10,500 תאים לכל 2 סנטימטר בצלחת 6 היטב (כלומר, 1 x 10 5 תאים לכל גם מנה 6 היטב) הוא אופטימלית. ראה טבלת 1 למספר הציע של תאים לכל 2 סנטימטר וPLAכרכי תקשורת טינג עבור מגוון רחב של כלי תרבית תאים.
- לשאוב ג'לטין מכלי התרבות וצלחת ההשעיה התא לפי הצפיפות הציעה ונפח בטבלה 1. אל מערבולת הצלחות כמו זה להתרכז התאים למרכז. מניחים את התרבויות בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לשנות תקשורת כל 1-2 ימים על ידי החלפת כל התקשורת עם N2B27 הטרי. פיפטה בעדינות כמו שטיפת התאים עשויים להשפיע על צפיפות ולהפחית את יעילות בידול בימים הבאים. איפה כדאיות ראשונית לאחר הציפוי היא עניה, צלחת התאים ב1: 3 שילוב של תקשורת N2 ותוספת-B27 ולשנות את זה לN2B27 אחרי היומיים הראשונים. תאים יתחילו להבחין וצריכה להראות ביטוי Sox1 (גלוי על ידי הקרינה ירוקה של הכתב בקו 46C התא משמש כאן) בתוך 4-6 ימים.
3. Immunofluorescent מכתים
NOTE: הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל סוג כלי. הנפח של כל מגיב מתואר בכל טוב של 6-גם צלחת וניתן לשנותם לכל שטח פנים. Replating אינו מומלץ בשל הכדאיות הנמוכה לאחר מכן.
- הסר בינוני בידול ולתקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של 4% (V / V) paraformaldehyde, להשאיר במשך 15 דקות.
- לשטוף וpermeabilize התאים עם 2 מיליליטר של PBS-T (שנאגרו מלוח פוספט עם 0.5% (V / V) tween-20) פעמיים. יכולים להיות כל הזמן בתאים PBS-T של עד 2 חודשים ב 4 מעלות צלזיוס.
- החלף PBS-T עם 1 מיליליטר של PBS-T עם 10% (V / V) בסרום (מאותו המין כמו נוגדנים משני). דגירה שעה 1 בנדנדת הצלחת ב RT לחסום כל מחייב שאינו ספציפית.
- אחרי שעה 1, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מיליליטר של PBS-T, והדגירה בIgG עכבר 500 μl נגד βIII טובולין (בדילול 1: 1,000 ב PBS-T עם סרום 10%). לשים על הנדנדה הצלחת, ולהשאיר O / N ב 4 ° C.
- מהצעד הזה, תמיד להגן על כלי השיטמהאור. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של נוגדן שכותרת הקרינה אנטי העכבר IgG (בדילול 2 מיקרוגרם / מיליליטר PBS-T עם סרום 10%). שים את זה על הנדנדה הצלחת עבור שעה 1 ב RT.
- יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של DAPI (בדילול 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ב PBS-T) ולהשאיר למשך 5 דקות.
- לשטוף את התאים שוב ולשמור אותם בPBS-T. תאים מוכנים להצטלם ויכולים להישמר לתקופה של עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס. שים לב שאות ה- GFP מתעמעמת עם זמן, כך אין זה ראוי להשוות את עוצמת ה- GFP של תאים קבועים וחיים או של תאים קבועים בזמנים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי זה, השתמשנו בקו תא 46C 14, תאי גזע עובריים של עכבר עם כתב Sox1-GFP אנדוגני, כדי לעקוב אחר בידול עצבי. באמצעות קו זה תא, ביטוי של Sox1, סמן עצבי, יכול להיות מזוהה על ידי הקרינה ירוקה. ציפוי צפיפות מהווה גורם קריטי להשגת בידול עצבי. תאי גזע עוברי של עכבר היו מצופים בצלחת 6-גם בצפיפויות שונות משתנות מ10,500 ל88,500 תאים / 2 סנטימטר. איור 1 א מציג את יעילות בידול מושגת על ידי צפיפות ציפוי שונה בצלחת 6 היטב. ביום 6 של בידול, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4% ומוכתמים לβIII טובולין הסמן העצבי. בצפיפות האופטימלית (10,500 תאים / 2 סנטימטר), תאים מובחנים לאבות והנוירונים עצביים. זו נצפתה על ידי אות ניאון ירוקה מכתב Sox1-GFP וimmunofluorescent נגד הסמן העצבי, βIII טובולין. Loצפיפות ציפוי wer הובילה למוות של תאים בתוך 3 ימים. עם זאת, ציפוי בצפיפות גבוהה מדי (> 36,500 תאים / 2 סנטימטר) הביאו בפרופורציה ירידה בתאים ירוקים ותאים חיוביים βIII טובולין. איור 1 מציג ניסוי שבוצע בצלחת 96-היטב שנדרשה על פי 10 צפיפות תאים גבוהה יותר ל להגיע האופטימלי (155,000 תאים / 2 סנטימטר) ומחוברות מדי (362500 תאים / 2 סנטימטר) רמה.
צפיפות אופטימלית יכולה להיות שונה בין הכנות תקשורת, רכיב תקשורת וקבוצות תא, סוגי תאים, או תנאי תרבות קודמים. מומלץ לבצע אופטימיזציה של צפיפות ציפוי עבור כל ניסוי. טבלת 1 מספקת טווחים של צפיפות ציפוי יעילה בפלטפורמות שונות שיש לכלול בשלב אופטימיזציה. בטווח זה, זה צריך להיות אפשרי כדי לקבל צפיפות שנותנת יעילות בידול טובה בתוך 4-6 ימים.
במהלך E הבידולSC לשנות בהדרגה המורפולוגיה שלהם. איור 2 מראה תא ומורפולוגיה מושבה מיום 1 ליום 6 לאחר ציפוי בצלחת 6-גם ב10,500 תאים / 2 סנטימטר. תאים היו בתרבית בתנאי בידול וצילמו כל יום. אין זה יוצא דופן לראות מוות של תאים משמעותיים בימים הראשונים בשל שינוי קיצוני במצב התרבות. עם זאת, התאים שנותרו עדיין מסוגלים להבחין. ביום 4, תאים התחילו להיות אבות עצביים כאות ניאון ירוקה מכתב Sox1-GFP הופיעו קודם. עם זאת, גם ביום 6, לא כל התאים Sox1-חיובי. קיומם של כמה תאים לא עצביים צפוי, בכל זאת, בתנאים הנכונים, רוב התאים יהיה עצביים.
איור 1. ההשפעה של צפיפות ציפוי על יעילות בידול. שני שונים צפיפות של תאי Sox1-GFP כתב (46C) היו מצופה ומובחנת על פי הפרוטוקול במשך 6 ימים. בידול () בצלחת 6 היטב. בידול (ב ') בצלחת 96-היטב. בר סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מורפולוגיות תא בתהליך הבידול. 46C ESC הובדלו ב10,500 תאים לכל 2 סנטימטר בצלחת תרבות 6 היטב וצילמו יומי לצפות לשינויים במורפולוגיה תא. בר סולם:. 300 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פלטפורמה | טווח של צפיפות אפקטיבית (תאים / 2 סנטימטר) | טווח של מספר תא לצלחת | הצעתי ראשוני נפח תקשורת (μl) | הצעתי תקשורת נפח לאחר יום 1 (μl) |
| 6-גם צלחת | 10,500 - 36,500 | 99750 - 346750 | 1,000 | 2,000 |
| צלחת 24 גם | 15,600 - 46800 | 29,640 - 88920 | 500 | 1,000 |
| צלחת 96-היטב | 103500 - 260,000 | 33120 - 83200 | 100 | 200 |
טבלה 1. מוצעת ציפוי צפיפויות וכרכי תקשורת לגדלים שונים כלי. צפיפות הציפוי בטבלה זו נקבעה באמצעות שורת תאי 46C. לקבלת תוצאות אופטימליות צפיפות הציפוי של כל שורת פרט עשויה להיות adjusted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הבידול העצבי monolayer כבר בשימוש במשך יותר מעשור 6. הפרוטוקול הוא יעיל ביותר, מורכב מבינוני מוגדרים, ונעשה במערכת monolayer מה שהופך את המערכת מתאימה יותר לפרה-קליני (למשל, הקרנת סמים) משתמשת. עם זאת, ישנם כמה גורמים קריטיים הקובעים את יעילות בידול. מאמר זה מצביע על גורמים אלה והפתרון לכל מכשול.
צפיפות של התאים לאחר ציפוי במצב הבידול היא אולי הגורם הקריטי ביותר. ציפוי התאים בצפיפות גבוהה מדי מפחית את יעילות בידול, ואילו ציפוי בצפיפות נמוכה מדי גורם למוות של תאים. תופעה זו היא כנראה עקב איתות גורם גדילת autocrine. Fgf4 הוא גורם גדילת autocrine שמפעיל את מפל MAPK ומניע את בידול ESC 11. LIF הוא ציטוקינים אחר המיוצרים על ידי ESC. היא מפעילה את מסלול STAT3 ומקדמת התחדשות עצמית <sup> 15. פרוטוקול זה עושה שימוש בN2B27 כדי להפוך לתאים עצביים. N2B27 מכיל גורמים שונים המאפשרים הישרדות ESC ומקדם צמיחת תאים עצבית, ואינו מכיל או LIF או BMP4 אשר מעכב בידול עצבי 6. בצפיפות הנכונה, איזון מתאים של איתות Fgf4 וLIF נשמר המאפשר ESC כדי להבדיל. בצפיפות גבוהה, כמות עודפת של LIF autocrine ובידול לעכב BMP. לעומת זאת, התאים בצפיפות נמוכה מדי לקויים הישרדות בתקשורת די מינימאלית אלה. לכן, כאשר מספר גדול של תאים ללא הבחנה מופיע מספר הציפוי צריך להיות מופחת, ואילו נדרש גידול של מספר תאי ציפוי אם המוות של תאים משמעותיים הוא ציין.
בנוסף למספר התאים שיש כמה גורמים אחרים שמשפיעים בעקיפין צפיפות ציפוי. הגורם הראשון הוא ריכוז התא המקומי, תלוי בטכניקה המשמשת להפצה באופן שווה על פני התאיםאזור. מצאנו שמתערבלים גם הוא לא אידיאלי, שכן הוא מתרכז תאים למרכז היטב והופך את הצפיפות במרכז הגבוה מדי, ואילו בפריפרית הצפיפות נמוכה מדי. טכניקות אחרות ערבוב, למשל, ערבוב התקשורת עם התאים לפני ציפוי, או נדנדה מצד לצד הצלחת מומלצות. יתר על כן, כאשר כלי ממוקם בחממה, חימום לא אחיד של המדיום גורם כוח הסעה שמושך את התאים למרכז גם, וכתוצאה מכך חלוקת התאים בדפוס צלצול קונצנטריים. תקשורת נפח נמוך ביום הציפוי מומלץ להפחית את האפקט הזה. עוזב את הצלחת מחוץ לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף, כמו גם מתחמם הבינוני לפני הערבוב יכול גם לסייע בהשגת צפיפות ציפוי הומוגנית.
שנית, סוג הכלי משפיע גם על ציפוי צפיפות. איור 1 ניתן לראות בבירור כי מספר התאים / גם לא יכול להיות באופן ליניארי SCAהוביל לשטח הפנים של כלי שונים (במילים אחרות, אותו מספר תאים / שטח פנים לא יכול להיות מיושם על כל סוגי כלי). כלי קטן יותר (עם יחס גדול יותר נפח / אזור) מושפע יותר על ידי מתח פן התקשורת שהופך את משטח קעור של מדיום, המניסקוס שנקרא. מתח הפנים דוחף את התאים לקצה של הבאר ופוחת צפיפות במרכז. בנוסף, מאז מדיה נפח בכלי הקטן הוא נמוך, התקשורת להתחמם מהר, צמצום כוח ההסעה. לכן, התאים בספינה קטנה יעברו לקצה על ידי השפעת המניסקוס, ולא לעבור למרכז על ידי כוחות הסעה. לפיכך, קטן הכלי, גבוה יותר צפיפות הציפוי הנדרשת כדי לקבל את הצפיפות האופטימלית במרכז.
שלישית, המצב של התאים לפני הציפוי גם בעקיפין משפיע צפיפות ציפוי ויעילות בידול. מצאנו וריאציה של הצפיפות האופטימלית בכמה ניסויים. הניסויים עםשיעור תמותה גבוהה יותר ביום הראשון דרוש צפיפות גבוהה יותר לבידול יעיל. תרבויות ESC בסרום וLIF מורכבות מאוכלוסייה הטרוגנית של תאי pluripotent נאיביים, תאי pluripotent דרוכים, ואפילו מספר קטן של תאים מובחנים 16. יש תאים מסוגים אלה יכולת שונה כדי לשרוד ולהבדיל בתנאי בידול. מאז הפרוטוקול מכתיב במספר, אבל לא המדינה של התאים, כמה ניסויים עלולים להתחיל עם תאים מובחנים יותר שימותו בימים הראשונים, שהוביל לצפיפות נמוכה מהצפוי. כדי להימנע מוריאציה זו, תרבות של ESC עקבי נדרשת לוודא כי השיעור הקבוע בין כל מדינה נשמר.
מלבד צפיפות, עיתוי הוא גורם נוסף כדי להשיג בידול יעיל. בפרסום זה, אנו מתארים את הדור של אבות עצביים בתוך 6 ימים. עם זאת, הזמן יכול להיות שונה בהתאם למצב שלתרבות ESC מתחילה. כפי שתואר לעיל, תרבויות ESC הן אוכלוסיות מעורבות שיכול להגיב באופן שונה למצב הבידול. לא רק הישרדות התא, אלא גם את העיתוי של בידול תושפע הרכב התרבות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רוב למשל תנאי תרבות ESC, בתקשורת N2B27 מכילה LIF וBMP4, או 2i וLIF. עם זאת, אם יש תאים נאיביים יותר בתרבות, תקופה ארוכה יותר עשויה להידרש לבידול יעיל. זאת, משום שתאים נאיביים יצטרכו יותר זמן כדי לעבור למצב דרוך ולאחר מכן להבדיל לאבות עצביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
