Abstract
तंत्रिका progenitors करने के लिए माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता (ईएससी) तंत्रिका विशिष्टता के रूप में अच्छी तरह से आगे के अध्ययन के लिए परिपक्व तंत्रिका कोशिका प्रकार की पीढ़ी को नियंत्रित तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में हम सीरम मुक्त, monolayer की संस्कृति का उपयोग कर तंत्रिका progenitors के लिए ईएससी के भेदभाव के लिए एक विधि का वर्णन। विधि कुशल, स्केलेबल है और 4 के भीतर 70% तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं ~ के उत्पादन में परिणाम - 6 दिन। यह स्थितियों की एक किस्म के अधीन हो विभिन्न प्रकारों से ईएससी के लिए लागू किया जा सकता है। तंत्रिका progenitors, माइक्रोस्कोपी द्वारा कार्यात्मक न्यूरॉन्स और glia या विश्लेषण किया में आगे अंतर cytometry या आणविक तकनीक का प्रवाह करने की अनुमति दी जा सकती है। भेदभाव प्रक्रिया समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी है और तंत्रिका विनिर्देश प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए संवाददाता लाइनों के उपयोग के साथ जोड़ा जा सकता है। हम प्रक्रिया ख के लिए अनुमति देने के लिए मीडिया की तैयारी और सेल घनत्व अनुकूलन के बारे में विस्तृत निर्देश प्रदानई सबसे ईएससी लाइनों और सेल संस्कृति वाहिकाओं की एक किस्म के लिए आवेदन किया।
Introduction
भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं syngeneic या प्रतिरक्षा अक्षमता मेजबानों में (एक chimaera के गठन से) के लिए एक उपयुक्त मंच भ्रूण में reintroduction के बाद सभी वयस्क प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता, इंजेक्शन बनाए रखते हुए इन विट्रो में अनिश्चित काल के लिए पैदा करने की क्षमता के साथ जल्दी भ्रूण से ली गई pluripotent कोशिकाओं रहे हैं (एक teratoma के गठन से) या उचित संकेतों 1 करने के लिए इन विट्रो विषय में। तंत्रिका प्रजातियों में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव पहले 1995 में वर्णित है और morphogen retinoic एसिड 2-4 के साथ पूरक सीरम युक्त मीडिया में बहुकोशिकीय निलंबन समुच्चय के गठन (embryoid निकायों, ईबीएस) शामिल किया गया था। तब से प्रोटोकॉल की एक किस्म तंत्रिका भेदभाव 5 अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है। अभी भी एकत्रीकरण का उपयोग कई लोग दूसरों प्रकार की कोशिकाओं उत्प्रेरण के साथ-संस्कृति सीओ और कई सीरम मुक्त मीडिया के इस्तेमाल को शामिल। सभी प्रोटोकॉल फायदे एक हैएन डी नुकसान और तंत्रिका की सटीक प्रकृति या neuronal कोशिकाओं का भी इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के अनुसार बदलता रहता है का उत्पादन किया।
आदर्श प्रोटोकॉल, मजबूत स्केलेबल हो सकता है और पूरी तरह से परिभाषित मीडिया और substrates का इस्तेमाल करते हैं, भेदभाव प्रक्रिया के गैर इनवेसिव निगरानी करने के लिए उत्तरदायी हो सकता है और सक्षम तंत्रिका progenitors के शुद्ध आबादी की पीढ़ी में परिणाम बाहरी संकेतों से और अलग करने के लिए नमूनों के लिए होगा एक अपेक्षाकृत कम समय में उच्च दक्षता और उपज के साथ सभी neuronal और glial उपप्रकारों में। पिछले दर्जन वर्षों में हम एक कम घनत्व, सीरम मुक्त पक्षपाती monolayer की संस्कृति 6-10 में माउस ईएससी से तंत्रिका progenitors और न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक विधि का उपयोग किया गया है। इस प्रोटोकॉल के ऊपर निर्धारित मापदंड के कई को पूरा: हमारे हाथ में भेदभाव की क्षमता काफी कई वर्षों से लगातार और सेल लाइनों की एक किस्म के लिए किया गया है, इसे नीचे तक पहुंचा जा सकता है या (हम सफलतापूर्वक करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों से जहाजों का उपयोग 15 सेमी व्यास डिshes) और इस्तेमाल किया मीडिया अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे हैं। प्रक्रिया (डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 6 के लिए उदाहरण के लिए, श्श्श और Fgf8) न्यूरोनल उपप्रकार के विशिष्ट प्रकार की पीढ़ी को प्रेरित करने के लिए जोड़ा जा सकता है भेदभाव की निगरानी और patterning के संकेतों की एक किस्म के लिए timelapse माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी है।
फिर भी, इस प्रोटोकॉल के सफल आवेदन करने के लिए कुछ चुनौतियों का सामना कर रहे हैं। महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक मीडिया से सावधान तैयारी है। हम हमेशा वाणिज्यिक विकल्प की उपलब्धता के बावजूद घर में मीडिया तैयार करते हैं। इस्तेमाल किया की खुराक में से एक (एन 2, प्रोटोकॉल देखें) मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्करणों में संशोधन किया है। अंत में, इस विधि के सफल आवेदन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक चढ़ाना पर इष्टतम सेल घनत्व है। उत्प्रेरण संकेतों में से एक (Fgf4 11) की autocrine प्रकृति की आवश्यकता है, जबकि इसका कारण यह पर्याप्त कोशिकाओं इष्टतम viabil अनुमति देने के लिए मौजूद हैं जो मुख्य रूप से हैबहुत अधिक घनत्व भेदभाव पर अल्पसंख्यक और भेदभाव, (कारण LIF 12 की autocrine उत्पादन करने के लिए संभवतः भाग में) बिगड़ा हुआ है। यह दोनों मीडिया तैयारी और सेल चढ़ाना ध्यान से प्रदर्शन कर रहे हैं और लगातार इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए कि इसलिए महत्वपूर्ण है।
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Protocol
1. मीडिया तैयारी
नोट: 1 के अनुपात: आम तौर पर एक 1 में, B27 पूरक के साथ पूरक संशोधित एन 2 पूरक और Neurobasal के साथ पूरक DMEM / F12: प्रोटोकॉल दो अलग-अलग मीडिया के एक मिश्रण के उपयोग पर निर्भर करता है।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में घटकों के मिश्रण से संशोधित एन 2 पूरक तैयार करें। भंवर या इस फिल्टर नहीं है; समाधान स्पष्ट है जब तक ट्यूब inverting द्वारा मिश्रण।
- तो (0.01 एम एचसीएल में बना हुआ) 25 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन के 1 मिलीलीटर जोड़ने और ट्यूब inverting द्वारा अच्छी तरह मिक्स, DMEM / F12 के 7.2 मिलीलीटर pipetting द्वारा शुरू करो। समाधान स्पष्ट है जब तक यह मिनट के एक जोड़े को ले जाता है।
- (पानी में बना हुआ) 100 मिलीग्राम की 1 मिलीग्राम / एमएल एपीओ-transferrin, एमएल progesternone (इथेनॉल में बना हुआ) / 0.6 मिलीग्राम की 33 μl, 160 मिलीग्राम / एमएल (1 एम) प्यूटर्साइन के 100 μl जोड़ें (पानी में बना हुआ ), 10 पानी में बना हुआ 3 मिमी सोडियम Selenite () और 7.5% गोजातीय सीरम albumin के 666 μl के μl और अच्छी तरह से ट्यूब मिश्रण। -20 डिग्री पर 2.5 मिलीलीटर में विभाज्य और दुकानअप करने के लिए 2 महीने के लिए सी।
- मीडिया तैयार करें।
- DMEM / F12 के 250 एमएल एन 2 के 2.5 मिलीलीटर जोड़ने। अच्छी तरह मिक्स लेकिन हिला या फिल्टर नहीं है।
- Neurobasal के 250 एमएल के लिए मीडिया B27 पूरक के 5 मिलीलीटर जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स लेकिन हिला या फिल्टर नहीं है।
- : 1 के अनुपात में एक 1 में दिए चरणों 1.2.1 और 1.2.2 से मीडिया मिलाएं। एक 1 कुछ मामलों में: 3 मिश्रण की आवश्यकता हो सकती है (: चरण 1.2.4 में 1 मिश्रण 1 के रूप में पूरक)।
- मिश्रण करने के लिए एल glutamine (अंतिम एकाग्रता 0.2 मिमी) और 2-mercaptoethanol (अंतिम एकाग्रता 0.1 मिमी) के 3.5 μl के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और मिलाते हुए बिना अच्छी तरह मिला लें। अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया की दुकान और प्रकाश को प्रकाश में लाने से बचें। इस अंतिम मिश्रण N2B27 कहा जाता है।
- जिलेटिन समाधान तैयार है।
- 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई में ultrapure पानी और आटोक्लेव में एक 1% जिलेटिन समाधान तैयार है। यह इस बात के लिए इस्तेमाल किया बोतल डिटर्जेंट या कीटाणुनाशक से पूरी तरह से साफ है कि महत्वपूर्ण है, तो यह एक नई बोतल है कि सिफारिश की हैइस के लिए प्रयोग किया जाता है और केवल कभी उपयोगों के बीच ultrapure पानी में rinsed है। 50 मिलीलीटर aliquots में 1% समाधान विभाज्य और महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
- जब तक भंग एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1% जिलेटिन के एक विभाज्य गर्म और गर्म फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 500 मिलीलीटर जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और अच्छी तरह से या प्लेट प्रत्येक के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त pipet। कम से कम 30 मिनट के लिए कोट करने के लिए जिलेटिन सतह की अनुमति दें।
2. कोशिकाओं चढ़ाना
नोट: इस प्रोटोकॉल ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF), LIF और हड्डी morphogenetic प्रोटीन 4 (BMP4) या खल्क और GSK3 अवरोधक (2i मीडिया) के साथ LIF या सीरम मुक्त मीडिया के साथ सीरम प्रतिस्थापन के साथ 10% सीरम में उगाई माउस ईएससी के लिए समान रूप से लागू होता है के साथ या LIF के बिना। हालांकि, भेदभाव के समय और दक्षता मीडिया और कोशिकाओं (चर्चा देखने) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। यहाँ दिखाए गए प्रयोगों के लिए हम जानते हैं कि एक EGFP संवाददाता ओ में दस्तक दी है (46C माउस ईएससी लाइन का इस्तेमाल किया10% सीरम और lif के साथ GMEM में उगाई अंतर्जात Sox1 alleles की NE)। इष्टतम परिणामों के लिए यह कोशिकाओं अलग और N2B27 मीडिया में replated रहे हैं कि महत्वपूर्ण है; N2B27 हमेशा कोशिकाओं replating की तुलना में एक कम भेदभाव दक्षता में परिणाम के लिए बस GMEM / सीरम / LIF से मीडिया के बदलते।
- 10% सीरम, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1x गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ GMEM में कोशिकाओं को विकसित 0.1 एम 2-mercaptoethanol, और 100 इकाइयों / मिलीलीटर LIF 13। माउस ईएससी, थाली के एक subconfluent संस्कृति प्राप्त करने के लिए 2 ले जाएगा जो एक T25 संस्कृति फ्लास्क में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं - 3 दिन।
- उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। कोशिकाओं को पारित होने के लिए subconfluent और तैयार हैं, पीबीएस में उन्हें दो बार कुल्ला। सेल हदबंदी अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 2 के लिए इनक्यूबेटर करने के लिए वापस - 5 मिनट। Trypsin और अन्य एंजाइमों भी सेल हदबंदी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चढ़ाना घनत्व की आवश्यकता होगी तो, वे adju सेल लगाव पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता हैsted।
- कोशिकाओं की थाली से लिफ्ट करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं, एक बार किसी एकल कक्ष निलंबन में उन्हें बेदखल करने के लिए पोत नल। एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में मीडिया और सेल हदबंदी अभिकर्मक और pipet के 10 मिलीलीटर की कुल में कोशिकाओं को इकट्ठा।
- आरटी पर 3 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और नीचे 3 से ऊपर pipetting और से पूर्व गर्म N2B27 के 10 एमएल में गोली resuspend - 5 बार। नीचे निलंबन pipetting करते हैं, ट्यूब के पक्ष के खिलाफ pipet के बुलबुले बनाने से बचने के लिए। एक स्वचालित सेल काउंटर या एक रुधिरकोशिकामापी के साथ कोशिकाओं की गणना और एकाग्रता रिकॉर्ड है।
- मात्रा का प्रति यूनिट कोशिकाओं की वांछित संख्या से युक्त एक सेल निलंबन पूर्व गर्म N2B27 में अच्छी तरह से प्रति चढ़ाया जा करने के लिए तैयार करते हैं। 6 अच्छी तरह से थाली में 2 सेमी प्रति 10,500 कोशिकाओं के घनत्व (यानी, 6 अच्छी तरह से पकवान के प्रति अच्छी तरह से 1 x 10 5 कोशिकाओं) हो सकता है। 2 सेमी और पीएलए प्रति कोशिकाओं का सुझाव दिया संख्या के लिए 1 टेबल देखेंसेल संस्कृति वाहिकाओं की एक किस्म के लिए ting के मीडिया संस्करणों।
- संस्कृति पोत से जिलेटिन Aspirate और तालिका 1 में सुझाव दिया घनत्व और मात्रा के अनुसार सेल निलंबन प्लेट। इस केंद्र के लिए कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करेंगे के रूप में प्लेटें ज़ुल्फ़ न करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक नम इनक्यूबेटर में संस्कृतियों रखें।
- ताजा N2B27 के साथ सभी मीडिया की जगह से 2 दिन - हर 1 मीडिया बदलें। पिपेट धीरे घनत्व को प्रभावित और बाद के दिनों में भेदभाव दक्षता कम हो सकता है कोशिकाओं निस्तब्धता के रूप में। चढ़ाना के बाद प्रारंभिक व्यवहार्यता गरीब कहां है, एक 1 में कोशिकाओं प्लेट: एन 2 और B27 के पूरक मीडिया के 3 मिश्रण और पहले दो दिनों के बाद N2B27 के लिए यह परिवर्तन। कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू हो जाएगा और 4 के भीतर (यहां इस्तेमाल किया 46C सेल लाइन में पत्रकार की हरी प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाई) Sox1 अभिव्यक्ति दिखाना चाहिए - 6 दिन।
3. immunofluorescent धुंधला
संते: प्रोटोकॉल किसी भी पोत प्रकार से लागू किया जा सकता है। प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से वर्णन किया गया है और किसी भी सतह क्षेत्र के लिए बढ़ाया जा सकता है। Replating बाद में कम व्यवहार्यता की वजह से सिफारिश नहीं है।
- भेदभाव मध्यम निकालें और 4% की 500 μl (वी / वी) paraformaldehyde जोड़कर कोशिकाओं को ठीक 15 मिनट के लिए छोड़ दें।
- धो और ((वी / वी) बीच 20 0.5% के साथ फॉस्फेट बफर खारा) दो बार पीबीएस टी के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं permeabilize। कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए पीबीएस टी में रखा जा सकता है।
- 10% (माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से) (वी / वी) सीरम के साथ पीबीएस टी के 1 मिलीलीटर के साथ पीबीएस टी बदलें। किसी भी गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक करने के लिए आरटी पर थाली घुमाव पर 1 घंटे सेते हैं।
- 1 घंटे बाद, पीबीएस टी के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें और βIII ट्यूबिलिन के खिलाफ 500 μl माउस आईजीजी में सेते हैं (: 10% सीरम के साथ पीबीएस टी में 1,000 1 पतला)। थाली घुमाव पर रखा, और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन छोड़ दें।
- इस कदम से, हमेशा पोत की रक्षाप्रकाश से। तब (10% सीरम के साथ पीबीएस टी में 2 माइक्रोग्राम / एमएल पतला) प्रतिदीप्ति लेबल विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी के 500 μl जोड़ने के लिए, पीबीएस टी के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। आरटी पर 1 घंटे के लिए थाली घुमाव पर रखो।
- तो DAPI की 500 μl जोड़ने के लिए, पीबीएस टी के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला (पीबीएस टी में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल पतला) और 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
- फिर कोशिकाओं को धो लें और पीबीएस टी में उन्हें रखने के लिए। प्रकोष्ठों फोटो खिंचवाने के लिए तैयार कर रहे हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए रखा जा सकता है। यह तय किया है और जीवित कोशिकाओं के या अलग अलग समय पर तय की कोशिकाओं के GFP तीव्रता तुलना करने के लिए अनुपयुक्त है तो उस GFP संकेत समय के साथ fades ध्यान दें।
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Representative Results
इस प्रयोग में, हम तंत्रिका भेदभाव को ट्रैक करने के लिए, एक अंतर्जात Sox1-GFP संवाददाता के साथ, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं 46C सेल लाइन 14 का इस्तेमाल किया। Sox1, तंत्रिका पूर्वज के लिए एक मार्कर के इस सेल लाइन, अभिव्यक्ति का उपयोग करके, हरी प्रतिदीप्ति से पता लगाया जा सकता है। घनत्व चढ़ाना neuronal भेदभाव को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं / 2 सेमी 10,500 88,500 करने के लिए कोशिकाओं से अलग अलग घनत्व में 6 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया गया। चित्रा 1 ए 6 अच्छी तरह से थाली में विभिन्न चढ़ाना घनत्व के द्वारा प्राप्त भेदभाव क्षमता को दर्शाता है। भेदभाव के 6 दिन, कोशिकाओं 4% paraformaldehyde में तय किया गया और neuronal मार्कर βIII ट्यूबिलिन के लिए दाग। इष्टतम घनत्व (10,500 कोशिकाओं / 2 सेमी) में, कोशिकाओं तंत्रिका progenitors और न्यूरॉन्स को अलग करता है। इस neuronal मार्कर, βIII ट्यूबिलिन के खिलाफ Sox1-GFP रिपोर्टर और Immunofluorescent से हरी फ्लोरोसेंट संकेत से मनाया गया। एक लोwer चढ़ाना घनत्व 3 दिन के भीतर कोशिका मृत्यु का कारण बना। हालांकि, बहुत उच्च घनत्व पर चढ़ाना (> 36,500 कोशिकाओं / 2 सेमी) हरी कोशिकाओं और βIII ट्यूबिलिन सकारात्मक कोशिकाओं की कमी आई अनुपात में हुई। चित्रा 1 बी के बारे में 10 गुना ज्यादा सेल घनत्व की आवश्यकता है जो एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रदर्शन एक प्रयोग से पता चलता है इष्टतम (155,000 कोशिकाओं / सेमी 2) और (362,500 कोशिकाओं / 2 सेमी) का स्तर भी मिला हुआ पहुँचने।
इष्टतम घनत्व मीडिया की तैयारी, मीडिया घटक और सेल बैचों, सेल प्रकार, या पिछले संस्कृति की स्थिति के बीच अलग-अलग हो सकता है। यह एक प्रयोग के लिए चढ़ाना घनत्व अनुकूलन करने के लिए सिफारिश की है। तालिका 1 अनुकूलन चरण में शामिल किया जाना चाहिए कि विभिन्न प्लेटफार्मों में प्रभावी चढ़ाना घनत्व की श्रेणियों प्रदान करता है। 6 दिन - इस सीमा के भीतर, यह 4 के भीतर एक अच्छा भेदभाव दक्षता देता है एक घनत्व प्राप्त करने के लिए संभव होना चाहिए।
भेदभाव ई के दौरानधीरे-धीरे। उनकी आकृति विज्ञान बदलने चित्रा 2 अनुसूचित जाति 10,500 कोशिकाओं / 2 सेमी में 6 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाना के बाद 6 दिन के लिए 1 दिन से सेल और कॉलोनी आकृति विज्ञान से पता चलता है। प्रकोष्ठों भेदभाव की स्थिति में सुसंस्कृत थे और हर दिन फोटो खिंचवाने। कारण यह संस्कृति हालत में चरम परिवर्तन करने के पहले कुछ दिनों पर महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु को देखने के लिए असामान्य नहीं है। हालांकि, शेष कोशिकाओं को अभी भी अंतर करने में सक्षम हैं। 4 दिन पर, कोशिकाओं को सबसे पहले दिखाई दिया Sox1-GFP संवाददाता से हरी फ्लोरोसेंट संकेत के रूप में तंत्रिका progenitors बनने के लिए शुरू कर दिया। हालांकि, यहां तक 6 दिन पर, नहीं सभी कोशिकाओं Sox1 पॉजिटिव हैं। कुछ गैर-तंत्रिका कोशिकाओं के अस्तित्व बहरहाल, उचित परिस्थितियों में, कोशिकाओं के बहुमत तंत्रिका हो जाएगा, उम्मीद है।
चित्रा 1. भेदभाव दक्षता पर चढ़ाना घनत्व का प्रभाव है। दो अलग अलगSox1-GFP संवाददाता कोशिकाओं (46C) के घनत्व 6 दिनों के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार चढ़ाया और भेदभाव कर रहे थे। 6 अच्छी तरह से थाली में (ए) भेदभाव। एक 96 अच्छी तरह से थाली में (बी) के भेदभाव। स्केल बार:। 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान चित्रा 2. सेल morphologies। 46C ईएससी 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में 2 सेमी प्रति 10,500 कोशिकाओं में भेदभाव और सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन का पालन करने के लिए दैनिक फोटो खींच रहे थे। स्केल बार:। 300 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मंच | प्रभावी घनत्व की रेंज (कोशिकाओं / 2 सेमी) | सेल नंबर की रेंज थाली करने के लिए | सुझाव प्रारंभिक मीडिया मात्रा (μl) | दिन 1 (μl) के बाद सुझाव मीडिया मात्रा |
| 6 अच्छी तरह से थाली | 10,500 - 36,500 | 99,750 - 346,750 | 1,000 | 2,000 |
| 24 अच्छी तरह से थाली | 15,600 - 46,800 | 29,640 - 88,920 | 500 | 1,000 |
| 96 अच्छी तरह से थाली | 103,500 - 260,000 | 33,120 - 83,200 | 100 | 200 |
तालिका 1. विभिन्न पोत आकार के लिए घनत्व और मीडिया संस्करणों चढ़ाना का सुझाव दिया। इस तालिका में चढ़ाना घनत्व 46C सेल लाइन का उपयोग कर निर्धारित किया गया है। इष्टतम परिणामों के लिए प्रत्येक व्यक्ति की रेखा के चढ़ाना घनत्व adj होना पड़ सकता हैusted।
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Discussion
monolayer के तंत्रिका भेदभाव प्रोटोकॉल एक दशक से अधिक 6 के लिए उपयोग में किया गया है। प्रोटोकॉल परिभाषित मध्यम से बना है, और preclinical के लिए प्रणाली को और अधिक लागू करता है जो एक monolayer प्रणाली में किया, अत्यधिक कुशल है (उदाहरण के लिए, दवा स्क्रीनिंग) का उपयोग करता है। हालांकि, भेदभाव दक्षता का निर्धारण कि कुछ महत्वपूर्ण कारक हैं। यह लेख उन कारकों और प्रत्येक बाधा के लिए समाधान बताते हैं।
भेदभाव हालत में चढ़ाना के बाद कोशिकाओं के घनत्व शायद सबसे महत्वपूर्ण कारक है। बहुत कम घनत्व पर चढ़ाना मौत सेल की ओर जाता है, जबकि बहुत अधिक घनत्व में कोशिकाओं चढ़ाना, भेदभाव दक्षता कम कर देता है। इस घटना की वजह से autocrine वृद्धि कारक सिगनल की संभावना है। Fgf4 MAPK झरना सक्रिय है और ईएससी भेदभाव 11 को चलाने वाली एक autocrine वृद्धि कारक है। LIF ईएससी द्वारा उत्पादित एक और साइटोकाइन है। यह <STAT3 मार्ग सक्रिय है और आत्म नवीकरण को बढ़ावा देता हैसमर्थन> 15। इस प्रोटोकॉल N2B27 के उपयोग के तंत्रिका कोशिकाओं को बनाने के लिए बनाता है। N2B27 ईएससी अस्तित्व की अनुमति है, जो विभिन्न कारकों में शामिल है और तंत्रिका कोशिकाओं की वृद्धि को बढ़ावा देता है, और तंत्रिका भेदभाव 6 रोकना जो LIF या BMP4 या तो शामिल नहीं है। उचित घनत्व कम, Fgf4 और lif संकेतन का एक उपयुक्त संतुलन ईएससी अंतर करने के लिए अनुमति देता है कि बनाए रखा है। उच्च घनत्व, autocrine LIF और बीएमपी रोकना भेदभाव की अतिरिक्त राशि है। इसके विपरीत, बहुत कम घनत्व में कोशिकाओं ये काफी कम से कम मीडिया में अस्तित्व बिगड़ा है। भेदभाव के बिना कोशिकाओं की बड़ी संख्या में दिखाई देते हैं जब महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु मनाया जाता है चढ़ाना सेल नंबर की वृद्धि की आवश्यकता होती है, जबकि इस प्रकार, चढ़ाना संख्या, कम किया जाना चाहिए।
सेल नंबर के अलावा अप्रत्यक्ष रूप से चढ़ाना घनत्व को प्रभावित करने वाले कुछ अन्य कारक हैं। पहली कारक समान रूप से सतह पर कोशिकाओं को वितरित करने के लिए इस्तेमाल तकनीक पर निर्भर स्थानीय सेल एकाग्रता है,क्षेत्र। हम यह अच्छी तरह से केंद्र के लिए कोशिकाओं ध्यान केंद्रित है और परिधि में घनत्व बहुत कम हो जाता है, जबकि बहुत अधिक केंद्र में घनत्व बनाता है के बाद से अच्छी तरह घूमता, आदर्श नहीं है कि पाया। चढ़ाना, या थाली की ओर से पक्ष कमाल से पहले कोशिकाओं के साथ मीडिया के मिश्रण उदाहरण के लिए अन्य मिश्रण तकनीक, सिफारिश कर रहे हैं। इसके अलावा, एक पोत इनक्यूबेटर में रखा जाता है, मध्यम के असमान हीटिंग एक गाढ़ा अंगूठी पैटर्न में कोशिकाओं का वितरण, जिसके परिणामस्वरूप में अच्छी तरह से केंद्र के लिए कोशिकाओं को खींचता है कि एक संवहन बल का कारण बनता है। चढ़ाना दिन पर एक कम मीडिया मात्रा इस प्रभाव को कम करने के लिए सिफारिश की है। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर बाहर थाली छोड़कर कोशिकाओं को भी एक सजातीय चढ़ाना घनत्व हासिल करने में मदद कर सकते हैं मिश्रण से पहले मध्यम वार्मिंग, साथ ही साथ देते हैं करने के लिए।
दूसरे, पोत प्रकार का भी स्पष्ट रूप से चढ़ाना घनत्व। चित्रा 1 को प्रभावित करता है / अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या रैखिक एससीए नहीं किया जा सकता है कि पता चलता हैविभिन्न जहाजों की सतह क्षेत्र के लिए नेतृत्व (दूसरे शब्दों में, कोशिकाओं / सतह क्षेत्र की एक ही नंबर हर पोत प्रकार से लागू नहीं किया जा सकता है)। (अधिक से अधिक मात्रा / क्षेत्र अनुपात) के साथ एक छोटे पोत मध्यम, तथाकथित meniscus के एक अवतल सतह बनाता है जो मीडिया सतह तनाव से अधिक प्रभावित होता है। सतह तनाव में अच्छी तरह से किनारे करने के लिए कोशिकाओं को धक्का और केंद्र में घनत्व कम हो जाती है। छोटे पोत में मीडिया की मात्रा कम है, क्योंकि इसके अलावा, मीडिया संवहन बल को कम करने, तेजी से गर्म है। इसलिए, एक छोटे पोत में कोशिकाओं meniscus के प्रभाव से किनारे करने के लिए कदम होगा, और संवहन बलों द्वारा केंद्र के लिए कदम नहीं होगा। केंद्र में इष्टतम घनत्व पाने के लिए आवश्यक चढ़ाना घनत्व अधिक है, पोत प्रकार, छोटे।
तीसरा, कोशिकाओं की हालत चढ़ाना के लिए पहले भी परोक्ष रूप से चढ़ाना घनत्व और भेदभाव दक्षता प्रभावित करता है। हम कुछ प्रयोगों में इष्टतम घनत्व के विभिन्नता पाया। प्रयोगों के साथपहले दिन पर उच्च मृत्यु दर कुशल भेदभाव के लिए उच्च घनत्व की जरूरत है। सीरम और lif में ईएससी संस्कृतियों एक भोले pluripotent कोशिकाओं की विषम जनसंख्या, primed pluripotent कोशिकाओं, और विभेदित कोशिकाओं 16 की भी एक छोटी संख्या से बना रहे हैं। इन प्रकार की कोशिकाओं को जीवित और भेदभाव की शर्तों के तहत अंतर करने के लिए अलग-अलग क्षमता है। प्रोटोकॉल संख्या है, लेकिन नहीं कोशिकाओं की स्थिति पर पैदा करती है के बाद से, कुछ प्रयोगों की उम्मीद की तुलना में कम घनत्व के लिए अग्रणी, पहले कुछ दिनों पर मर जाएगा, जो अधिक विभेदित कोशिकाओं के साथ शुरू हो सकता है। इस बदलाव से बचने के लिए, ईएससी के अनुरूप संस्कृति प्रत्येक राज्य के बीच लगातार अनुपात को बनाए रखा जाता है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
इसके अलावा घनत्व से, समय कुशल भेदभाव को प्राप्त करने के लिए एक और पहलू है। इस प्रकाशन में, हम 6 दिनों के भीतर तंत्रिका progenitors की पीढ़ी का वर्णन है। बहरहाल, समय की स्थिति पर निर्भर करता है अलग अलग हो सकता हैशुरू करने ईएससी संस्कृति। ऊपर वर्णित है, ईएससी संस्कृतियों भेदभाव हालत के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया कर सकते हैं कि मिश्रित आबादी हैं। सेल अस्तित्व लेकिन यह भी भेदभाव के समय न केवल संस्कृति रचना से प्रभावित हो जाएगा। इस प्रोटोकॉल LIF और BMP4, या 2i और lif युक्त N2B27 मीडिया में, सबसे ईएससी संस्कृति की स्थिति जैसे करने के लिए लागू किया जा सकता है। अधिक भोले कोशिकाओं संस्कृति में कर रहे हैं हालांकि, अगर एक लंबी अवधि के कुशल भेदभाव के लिए आवश्यक हो सकता है। भोले कोशिकाओं को एक primed राज्य के लिए स्विच करने के लिए और अधिक समय की जरूरत है और फिर तंत्रिका progenitors के लिए अलग होगा क्योंकि है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
