Abstract
القدرة على تمييز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى الأسلاف العصبية تسمح دراسة آليات السيطرة على مواصفات العصبية فضلا عن جيل من أنواع الخلايا العصبية الناضجة لمزيد من الدراسة. في هذا البروتوكول وصفنا طريقة لتمايز ESC إلى الأسلاف العصبية باستخدام المصل خالية والثقافة أحادي الطبقة. هذه الطريقة قابلة للوكفاءة ويؤدي إلى إنتاج ~ 70٪ الخلايا الاصلية العصبية داخل 4-6 أيام. ويمكن تطبيقه على ESC من مختلف السلالات التى تزرع في إطار مجموعة من الشروط. يمكن السماح الأسلاف العصبية إلى مزيد من التفريق في الخلايا العصبية الوظيفية والدبقية أو تحليلها بواسطة المجهر، وتدفق تقنيات الخلوي أو الجزيئية. عملية التمايز هو قابل للالوقت الفاصل بين المجهر ويمكن الجمع مع استخدام خطوط مراسل لمراقبة عملية مواصفات العصبية. نحن نقدم تعليمات مفصلة حول إعداد وسائل الاعلام وكثافة الخلايا الأمثل للسماح للعملية بالبريد تطبيقها على معظم خطوط ESC ومجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية هي الخلايا المحفزة المستمدة من الجنين في وقت مبكر لديها القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الكبار بعد إعادة إلى الجنين مرحلة المناسب (خلال تشكيل كايميرا)، والحقن في مسانج أو نقص المناعة المضيفين (من خلال تشكيل مسخي) أو في المختبر تخضع لمنبهات المناسبة 1. وكان أول وصف التمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية في الأنساب العصبية في عام 1995 وشملت تشكيل المجاميع تعليق الخلايا (الهيئات مضغي، EBS) في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل تستكمل مع حمض الريتينويك محدثة التخلق 2-4. ومنذ ذلك الحين تم تطوير مجموعة متنوعة من البروتوكولات للسماح التمايز العصبي 5. لا يزال كثير من الاستفادة من التجميع، شارك في ثقافة الآخرين مع إحداث أنواع الخلايا وعدد تنطوي على استخدام المصل خالية سائل الإعلام. جميع البروتوكولات لديها مزايا علىالثانية عيوب والطبيعة المحددة لالعصبية أو الخلايا العصبية تنتج أيضا يختلف وفقا لبروتوكول المستخدمة.
وأضاف أن البروتوكول المثالي هو أن يكون قويا، للتحجيم والاستفادة من وسائل الإعلام وركائز محددة تماما، تكون قابلة للرصد غير الغازية لعملية التمايز ويؤدي إلى توليد السكان نقية من الأسلاف العصبية قادرة على أن تكون منقوشة بواسطة منبهات الخارجية والتفريق في جميع أنواع فرعية العصبية والدبقية مع الكفاءة العالية والعائد في وقت قصير نسبيا. في اثني عشر عاما الماضية لقد تم استخدام طريقة لتوليد الأسلاف العصبية والخلايا العصبية من الماوس ESC في منخفض الكثافة، والثقافة أحادي الطبقة ملتصقة خالية من المصل 10/06. هذا البروتوكول يحقق العديد من المعايير الواردة أعلاه: في أيدينا فإن كفاءة التمايز يتسق تماما على مدى سنوات عديدة ومتنوعة من خطوط الخلايا، فإنه يمكن زيادتها إلى أعلى أو أسفل (التي نستخدمها بنجاح السفن من لوحات 96-جيدا ل 15 سم القطر ديشيس) وسائل الإعلام المستخدمة هي واضحة المعالم. هذه العملية هي قابلة للالمجهر timelapse لرصد التمايز ومجموعة متنوعة من العظة الزخرفة ويمكن أن يضاف للحث على توليد أنواع متميزة من الأنواع الفرعية العصبية (على سبيل المثال، Shh على وFgf8 عن الخلايا العصبية الدوبامين 6).
ومع ذلك، هناك بعض التحديات التي تواجه التطبيق الناجح لهذا البروتوكول. أحد الجوانب الرئيسية لإعداد دقيق وسائل الإعلام. نحن دائما بتحضير وسائل الإعلام في المنزل على الرغم من توافر البدائل التجارية. واحدة من المكملات الغذائية المستخدمة (N2؛ انظر البروتوكول) لديها تعديلات على مستوى الإصدارات المتوفرة تجاريا. أخيرا، واحدة من أهم الخطوات لنجاح تطبيق هذا الأسلوب هو كثافة الخلية المثلى في الطلاء. هذا هو السبب الرئيسي في حين تتطلب طبيعة autocrine واحدة من الإشارات المحفزة (Fgf4 11) أن خلايا كافية موجودة للسماح viabil الأمثلهو ضعف إيتي والتمايز، بكثافات عالية جدا التمايز (ربما يرجع ذلك جزئيا إلى إنتاج autocrine من LIF 12). ولذلك فمن المهم أن إعداد كل من وسائل الإعلام وطلاء الخلية تتم بعناية وباستمرار لضمان أفضل النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام
ملاحظة: بروتوكول يعتمد على استخدام مزيج من اثنين منفصلة وسائل الإعلام: DMEM / F12 تستكمل مع تعديل الملحق N2 وNeurobasal تستكمل مع B27 الملحق، وعادة في نسبة 1: 1.
- إعداد N2 ملحق تعديل عن طريق خلط المكونات في أنبوب 15 مل. لا الدوامة أو تصفية هذا؛ مزيج من قبل قلب الأنبوب حتى حل واضح.
- بدء بواسطة pipetting 7.2 مل من DMEM / F12، ثم يضاف 1 مل من 25 ملغ / مل الأنسولين (تتكون في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك) ومزيج جيد من قبل قلب الأنبوب. يستغرق بضع دقائق حتى حل واضح.
- إضافة 1 مل من 100 ملغ / مل APO-ترانسفيرين (تتكون في الماء)، 33 ميكرولتر من 0.6 ملغ / مل progesternone (تتكون في الإيثانول)، و 100 ميكرولتر من 160 ملغ / مل (1 M) بوتريسين (تتكون في الماء )، و 10 ميكرولتر من 3 ملي سيلينات الصوديوم (تتكون في الماء) و 666 ميكرولتر من 7.5٪ ألبومين المصل البقري وتخلط الأنبوب جيدا. قسامة إلى 2.5 مل وتخزينها في -20 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- إعداد وسائل الإعلام.
- 250 مل من DMEM / F12 إضافة 2.5 مل من N2. تخلط جيدا ولكن لا تهزه أو التصفية.
- 250 مل من Neurobasal وسائل الإعلام إضافة 5 مل من B27 الملحق. تخلط جيدا ولكن لا تهزه أو التصفية.
- خلط وسائل الإعلام من خطوات 1.2.1 و 1.2.2 في نسبة 1: 1. في بعض الحالات 1: قد تكون هناك حاجة مزيج 3 (تستكمل مثل 1: مزيج 1 في الخطوة 1.2.4).
- إلى المزيج إضافة 0.5 مل من L-الجلوتامين (تركيز النهائي 0.2 ملم) و 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول (تركيز النهائي 0.1 ملم) وتخلط جيدا دون أن تهتز. تخزين وسائل الإعلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع، وتجنب تعريض للضوء. ويسمى هذا المزيج النهائي N2B27.
- تحضير محلول الجيلاتين.
- إعداد محلول الجيلاتين 1٪ في الماء عالى النقاء والتعقيم في 121 ° C، 15 رطل، لمدة 15 دقيقة. من المهم أن الزجاجة المستخدمة لهذا نظيفة تماما من المنظفات أو المطهرات، لذلك فمن المستحسن أن زجاجة الجديدةتستخدم لهذا وفقط من أي وقت مضى تشطف في الماء عالى النقاء بين الاستخدامات. قسامة الحل 1٪ إلى 50 مل قسامات والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة أشهر.
- تدفئة قسامة من 1٪ الجيلاتين في 37 ° C حمام الماء حتى يذوب وإضافة إلى 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة الدافئة (PBS). تخلط جيدا والماصة بما يكفي لتغطية الجزء السفلي من كل بئر أو لوحة. السماح الجيلاتين إلى معطف السطح لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. طلاء الخلايا
ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الماوس ESC تزرع في 10٪ مصل مع عامل مثبط سرطان الدم (LIF)، واستبدال المصل مع LIF أو وسائل الإعلام خالية من المصل مع LIF ومخلق العظام البروتين 4 (BMP4) أو منظمة مجاهدي خلق وGSK3 مثبطات (وسائل الإعلام 2I) مع أو بدون LIF. ومع ذلك، فإن توقيت وكفاءة التمايز قد تختلف اعتمادا على وسائل الإعلام والخلايا (انظر المناقشة). لالتجارب هو موضح هنا استخدمنا خط 46C الماوس ESC (الذي لديه طرقت مراسل EGFP إلى سشمال شرق من الأليلات Sox1 الذاتية)، ونمت في GMEM مع 10٪ مصل وLIF. لأفضل النتائج من المهم أن الخلايا فصلها وreplated في وسائل الإعلام N2B27. ببساطة تغيير وسائل الإعلام من GMEM / المصل / LIF إلى N2B27 يؤدي دائما في انخفاض الكفاءة التمايز مقارنة replating الخلايا.
- تنمو الخلايا في GMEM مع المصل 10٪، 1 ملي البيروفات الصوديوم، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1X و 0.1 M 2-المركابتويثانول، و 100 وحدة / مل LIF 13. للحصول على الثقافة subconfluent من الماوس ESC، لوحة 1 × 10 6 الخلايا في قارورة الثقافة T25 والتي سوف تتخذ 2-3 أيام.
- مراقبة الخلايا تحت المجهر مشرق الميدان. عندما كانت الخلايا subconfluent وعلى استعداد للمرور، شطف لهم مرتين في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من خلية تفارق كاشف والعودة إلى الحاضنة لمدة 2-5 دقيقة. على الرغم من التربسين والأنزيمات الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا لتفكك خلية، فإنها يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على مرفق الخلية وبالتالي فإن كثافة الطلاء سوف تحتاج إلى أن تكون adjuSTED.
- وبمجرد أن الخلايا هي بداية لرفع من لوحة، والاستفادة من السفينة إلى إخراجهم إلى تعليق خلية واحدة. جمع الخلايا في ما مجموعه 10 مل من وسائل الإعلام والتفكك خلية الكاشف والماصة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
- تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
- نضح بعناية طاف و resuspend بيليه في 10 مل من قبل تحسنت N2B27 pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. عندما pipetting لتعليق أسفل، الماصة ضد الجانب من الأنبوب لتجنب خلق فقاعات. عد الخلايا مع عداد خلية الآلي أو haemocytometer وتسجيل التركيز.
- إعداد تعليق الخلية التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا لكل وحدة من وحدة التخزين إلى أن مطلي لكل بئر في درجة حرارة ما قبل N2B27. A كثافة 10500 خلية لكل سم 2 في صحن 6 جيدا (أي 1 × 10 5 خلايا لكل بئر من صحن 6 جيدا) هو الأمثل. انظر الجدول رقم 1 لالعدد المقترح من الخلايا لكل سم 2 وجيش التحرير الشعبى الصينىوحدات التخزين وسائل الإعلام تينغ لمجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.
- نضح الجيلاتين من سفينة الثقافة وصفيحة تعليق الخلية وفقا للكثافة المقترحة وحجم في الجدول 1. لا يدوم لوحات حيث سيؤدي ذلك إلى تركيز الخلايا إلى المركز. وضع الثقافات في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- تغيير وسائل الاعلام كل 1-2 أيام عن طريق استبدال جميع وسائل الإعلام مع N2B27 الطازجة. ماصة بلطف كما بيغ الخلايا قد يؤثر على كثافة ويقلل من كفاءة التمايز في الأيام التالية. حيث الجدوى الأولية بعد الطلاء رديئة، لوحة الخلايا في 1: مزيج 3 من N2 و B27 تستكمل وسائل الإعلام وتغيير هذا إلى N2B27 بعد اليومين الأولين. وسوف تبدأ الخلايا للتمييز ويجب أن تظهر التعبير Sox1 (مرئية من قبل مخضر لمراسل في خط الخلية 46C المستخدمة هنا) ضمن 4-6 أيام.
3. مناعي تلطيخ
لاTE: بروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع السفينة. يوصف حجم كل كاشف لكل بئر من لوحة 6 جيدا ويمكن زيادتها إلى أي مساحة السطح. لا ينصح Replating نظرا لقابلية منخفضة بعد ذلك.
- إزالة التمايز المتوسطة وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق، وترك لمدة 15 دقيقة.
- غسل وpermeabilize الخلايا مع 2 مل من PBS-T (الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.5٪ (V / V) توين-20) مرتين. يمكن أن تبقى الخلايا في برنامج تلفزيوني-T لمدة تصل إلى 2 أشهر في 4 ° C.
- استبدال PBS-T مع 1 مل من برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ (V / V) مصل (من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية). احتضان 1 ساعة على الكرسي الهزاز لوحة في RT لمنع أي غير محددة وملزمة.
- بعد 1 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من PBS-T، واحتضان في 500 ميكرولتر الماوس مفتش ضد βIII تويولين (المخفف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ مصل). وضعت على لوحة الروك، وترك O / N عند 4 درجات مئوية.
- من هذه الخطوة، دائما حماية السفينةبعيدا عن الضوء. غسل الخلايا مرتين مع PBS-T، ثم يضاف 500 ميكرولتر من المسمى مضان المضادة للماوس مفتش الأضداد (مخفف إلى 2 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ مصل). وضعه على لوحة الروك لمدة 1 ساعة على RT.
- شطف الخلايا مرتين مع PBS-T، ثم يضاف 500 ميكرولتر من دابي (مخفف إلى 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-T) ويترك لمدة 5 دقائق.
- غسل الخلايا مرة أخرى والاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني-T. الخلايا جاهزة لتصويرها، ويمكن أن تبقى لمدة تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية. لاحظ أن يتلاشى إشارة GFP مع مرور الوقت لذلك فإنه من غير المناسب مقارنة كثافة GFP الخلايا الثابتة والحية أو الخلايا الثابتة في أوقات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التجربة، استخدمنا خط خلية 46C 14، الخلايا الجذعية الجنينية مع مراسل Sox1-GFP الذاتية، لتعقب التمايز العصبي. باستخدام هذا الخط الخلية، تعبيرا عن Sox1، وهي علامة للحصول على السلف العصبي، ويمكن الكشف عنها بواسطة مخضر. تصفيح كثافة يشكل عاملا حاسما لتحقيق تمايز الخلايا العصبية. كانت مطلية الخلايا الجذعية الجنينية في لوحة 6 جيدا بكثافات مختلفة تتراوح بين 10500 إلى 88500 خلية / سم 2. ويبين الشكل 1A الكفاءة التمايز التي كتبها كثافة الطلاء المختلفة التي تحققت في لوحة 6 جيدا. في يوم 6 من التمايز، تم إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق وملطخة للالخلايا العصبية علامة βIII تويولين. في الكثافة المثلى (10500 خلية / سم 2)، وخلايا متمايزة لالأسلاف العصبية والخلايا العصبية. وقد لوحظ ذلك من خلال الخضراء إشارة الفلورسنت من مراسل Sox1 GFP ومناعي ضد علامة الخلايا العصبية، βIII تويولين. A لوأدت ور كثافة الطلاء إلى موت الخلايا في غضون 3 أيام. ومع ذلك، والطلاء في عالية جدا كثافة أسفرت (> 36500 خلية / سم 2) في نسبة تناقص الخلايا الخضراء وخلايا إيجابية βIII تويولين. ويبين الشكل 1B تجربة أجريت في لوحة 96-جيدا الأمر الذي يتطلب حوالي 10 أضعاف كثافة الخلية ل وصول إلى المستوى الأمثل (155000 خلية / سم 2) ومتموجة جدا (362500 خلية / سم 2) المستوى.
الكثافة المثلى يمكن أن تكون مختلفة بين التحضيرات وسائل الإعلام، مكون الإعلام ودفعات الخلية، أنواع الخلايا، أو ظروف التربية السابقة. فمن المستحسن لتحسين كثافة الطلاء لكل تجربة. ويقدم الجدول 1 نطاقات كثافة الطلاء فعالة في مختلف المنصات التي ينبغي إدراجها في الخطوة الأمثل. ضمن هذا النطاق، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن الحصول على الكثافة الذي يعطي كفاءة التمايز جيدة في غضون 4-6 أيام.
خلال التمايز ESC تغيير تدريجيا التشكل. يبين الشكل 2 خلية ومستعمرة التشكل من يوم 1 إلى يوم 6 بعد الطلاء في لوحة 6 جيدا في 10500 خلية / سم 2. وكانت الخلايا المستزرعة في ظروف التمايز وصورت كل يوم. ليس من غير المألوف أن نرى موت الخلايا كبيرا في الأيام القليلة الأولى بسبب التغير الشديد في حالة الثقافة. ومع ذلك، فإن الخلايا المتبقية لا تزال قادرة على التفريق. في يوم 4، بدأت الخلايا لتصبح الأسلاف العصبية كما إشارة الفلورية الخضراء من مراسل Sox1-GFP ظهرت أولا. ولكن، حتى في يوم 6، وليس كل الخلايا-Sox1 إيجابية. ومن المتوقع وجود بعض الخلايا غير العصبية، مع ذلك، في الظروف المناسبة، فإن الغالبية العظمى من الخلايا العصبية تكون.
الشكل 1. تأثير كثافة الطلاء على كفاءة التمايز. مختلفين كانت مطلية كثافة الخلايا مراسل Sox1 GFP (46C) وتختلف وفقا لبروتوكول لمدة 6 أيام. (A) التمايز في لوحة 6 جيدا. (B) التمايز في لوحة 96-جيدا. شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم التفريق بين الشكل 2. الأشكال التضاريسية الخلية أثناء عملية التمايز. 46C ESC على 10500 خلية لكل سم 2 في لوحة الثقافة 6 جيدا وتصويرها يوميا لمراقبة التغيرات في شكل الخلية. شريط مقياس: 300 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| منصة | مجموعة من كثافة فعالة (خلية / سم 2) | مجموعة من عدد الخلايا لوحة و | اقترح حجم وسائل الاعلام الأولي (ميكرولتر) | حجم وسائل الاعلام اقترح بعد يوم 1 (ميكرولتر) |
| لوحة 6 جيدا | 10500 - 36500 | 99750 - 346750 | 1000 | 2000 |
| 24 لوحة جيدا | 15600 - 46800 | 29640 - 88920 | 500 | 1000 |
| لوحة 96-جيدا | 103500 - 260000 | 33120 - 83200 | 100 | 200 |
واقترح الجدول 1. الطلاء الكثافة وأحجام وسائل الاعلام لأحجام السفن المختلفة. وتم تحديد كثافة الطلاء في هذا الجدول باستخدام خط الخلية 46C. لأفضل النتائج قد يكون لها كثافة الطلاء كل سطر الفردية لتكون صفةusted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان بروتوكول التمايز العصبي أحادي الطبقة في استخدام لأكثر من عقد 6. البروتوكول هو ذات كفاءة عالية، ويتألف من متوسطة محددة، وذلك في ظل نظام أحادي الطبقة مما يجعل النظام أكثر قابلية للتطبيق لما قبل السريرية (على سبيل المثال، فحص المخدرات) يستخدم. ومع ذلك، هناك بعض العوامل الحاسمة التي تحدد كفاءة التمايز. وتشير هذه المادة من تلك العوامل والحل لكل عقبة.
كثافة الخلايا بعد الطلاء في حالة التمايز وربما كان العامل الأكثر أهمية. طلاء الخلايا في كثافة عالية جدا يقلل من كفاءة التمايز، بينما طلي بأسعار منخفضة جدا كثافة يؤدي إلى موت الخلايا. هذه الظاهرة هي على الأرجح بسبب autocrine عامل النمو الإشارات. Fgf4 هو عامل النمو autocrine الذي ينشط شلال MAPK ويدفع ESC التفريق 11. LIF هو خلوى أخرى تنتجها ESC. كما أنه ينشط مسار STAT3 وتشجع التجديد الذاتي <سوب> 15. هذا البروتوكول يجعل من استخدام N2B27 لجعل الخلايا العصبية. N2B27 يحتوي على العوامل المختلفة التي تسمح ببقاء ESC ويعزز نمو الخلايا العصبية، ولا تحتوي على أي LIF أو BMP4 التي تحول دون تمايز العصبية 6. في الكثافة المناسبة، والمحافظة على توازن مناسب من Fgf4 وLIF الإشارات التي تسمح ESC للتمييز. في كثافة عالية، وكمية كبيرة من LIF autocrine وBMP تمنع التمايز. في المقابل، انخفضت قيمته الخلايا في كثافة منخفضة للغاية البقاء على قيد الحياة في هذه الوسائط الحد الأدنى إلى حد ما. وهكذا، عندما تظهر أعداد كبيرة من الخلايا دون تمايز ينبغي خفض عدد الطلاء، في حين يلزم زيادة في عدد الخلايا الطلاء إذا لوحظ موت الخلايا كبيرة.
بالإضافة إلى عدد الخلايا هناك بعض العوامل الأخرى التي تؤثر بشكل غير مباشر كثافة الطلاء. العامل الأول هو تركيز الخلية المحلية، التي تعتمد على التقنية المستخدمة لتوزيع بالتساوي الخلايا على سطحمنطقة. وجدنا أن يحوم البئر ليست مثالية، لأنه يركز على الخلايا إلى مركز البئر ويجعل الكثافة في مركز عالية جدا، بينما في محيط كثافة تصبح منخفضة جدا. ينصح تقنيات خلط الأخرى، على سبيل المثال، خلط وسائل الإعلام مع الخلايا قبل الطلاء، أو تعصف جنبا إلى جنب لوحة. وعلاوة على ذلك، عندما يتم وضع سفينة في الحاضنة والتدفئة متفاوتة من متوسطة يؤدي إلى قوة الحمل الحراري التي توجه الخلايا إلى وسط البئر، مما أدى إلى توزيع الخلايا في نمط حلقة متحدة المركز. ينصح حجم وسائل الإعلام أقل في اليوم الطلاء للحد من هذا التأثير. ترك لوحة خارج الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا نعلق، فضلا عن ارتفاع درجة حرارة تصل المتوسط قبل الاختلاط يمكن أن يساعد أيضا تحقيق كثافة الطلاء متجانسة.
ثانيا، ونوع السفينة يؤثر أيضا على طلاء الكثافة. الشكل رقم 1 يبين بوضوح أن عدد خلايا / جيد لا يمكن أن يكون خطيا هيئة السلع التموينيةأدى إلى المساحة السطحية للسفن مختلفة (وبعبارة أخرى، فإن نفس العدد من الخلايا / مساحة لا يمكن تطبيقها على كل نوع السفينة). يتأثر سفينة صغيرة (مع نسبة أكبر حجم / منطقة) أكثر من التوتر السطحي وسائل الإعلام مما يجعل سطح مقعر من المتوسط، ويسمى الغضروف المفصلي. التوتر السطحي يدفع الخلايا إلى حافة البئر ويقلل كثافة في المركز. بالإضافة إلى ذلك، منذ حجم وسائل الإعلام في سفينة صغيرة منخفضة، وسائل الإعلام الاحماء بسرعة، مما يقلل من قوة الحمل الحراري. لذلك، فإن الخلايا في وعاء صغير انتقال إلى حافة طريق التأثير في الغضروف المفصلي، ولن تنتقل إلى مركز من قبل قوات الحراري. وبالتالي، فإن أصغر السفينة، وارتفاع كثافة الطلاء المطلوبة للحصول على الكثافة المثلى في المركز.
ثالثا، وحالة الخلايا قبل الطلاء أيضا تؤثر بشكل غير مباشر كثافة الطلاء وكفاءة التمايز. وجدنا الاختلاف في الكثافة المثلى في بعض التجارب. تجارب معحاجة أعلى معدل وفيات في اليوم الأول أعلى كثافة للتمايز كفاءة. وتتكون الثقافات ESC في مصل الدم وLIF من السكان غير متجانسة من الخلايا المحفزة ساذجة، والخلايا المحفزة معبي، وحتى عدد قليل من الخلايا المتمايزة 16. خلايا من هذه الأنواع لها قدرة مختلفة من أجل البقاء وتفرق في ظل ظروف التمايز. لأن البروتوكول يفرض على العدد، ولكن ليس الدولة للخلايا، وبعض التجارب قد تبدأ مع المزيد من الخلايا المتمايزة التي سوف يموت في الأيام القليلة الأولى، مما أدى إلى كثافة أقل مما كان متوقعا. لتجنب هذا الاختلاف، مطلوب ثقافة متسقة من ESC للتأكد من أن نسبة ثابتة بين كل دولة والحفاظ عليها.
وبصرف النظر عن كثافة، والتوقيت هو عامل آخر لتحقيق التمايز كفاءة. في هذا المنشور، وصفنا توليد الأسلاف العصبية في غضون 6 أيام. ومع ذلك، لا يمكن للوقت تكون مختلفة اعتمادا على حالةثقافة ESC البدء. كما هو موضح أعلاه، الثقافات ESC هي المختلطة السكان التي يمكن أن تستجيب بشكل مختلف للحالة التمايز. سوف تتأثر ليس فقط بقاء الخلية ولكن أيضا توقيت التمايز من تكوين ثقافة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لمعظم ESC الظروف والثقافة على سبيل المثال، في وسائل الإعلام N2B27 تحتوي على LIF وBMP4، أو 2I وLIF. ومع ذلك، إذا كان هناك المزيد من الخلايا الساذجة في الثقافة، قد تكون هناك حاجة إلى فترة أطول للتمايز كفاءة. وذلك لأن خلايا ساذجة سوف تحتاج إلى مزيد من الوقت للتحول إلى دولة معبي ثم تفرق إلى الأسلاف العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
