Abstract
Silence de la protéine suppresseur de tumeur BRCA2 et sa détection par des analyses biochimiques classiques représentent un grand défi technique en raison de la grande taille de la protéine BRCA2 humain (environ 390 kDa). Nous rapportons modifications des protocoles standard de transfection et de réduire au silence immunoblotting siARN BRCA2 humain endogène et détecter la protéine BRCA2, respectivement, dans des lignées cellulaires epitheliales humaines. Les étapes clés comprennent une forte siRNA transfection ratio de réactif et de deux rondes subséquentes de transfection de siRNA dans la même expérience. L'utilisation de ces et d'autres modifications au protocole standard, nous réalisons systématiquement plus de 70% le silençage du gène BRCA2 humain tel que jugé par une analyse immunoblot avec des anticorps anti-BRCA2. En outre, la dénaturation des lysats de cellules à 55 ° C au lieu de la classique de 70 à 100 ° C et d'autres techniques d'optimisation de la procédure d'immuno-empreinte permet la détection de la protéine BRCA2 intact même when très faibles quantités de matière de départ sont disponibles ou lorsque les niveaux d'expression de protéine BRCA2 sont très faibles. Silençage efficace de BRCA2 dans les cellules humaines propose une stratégie utile pour perturber la fonction de BRCA2 dans les cellules avec BRCA2 intacte, y compris les cellules tumorales, à examiner de nouvelles voies moléculaires et les fonctions cellulaires qui peuvent être affectés par des mutations de BRCA2 pathogènes dans les tumeurs. Adaptation de ce protocole pour le silençage et l'analyse d'autres protéines «grands» comme BRCA2 efficace devrait être facilement réalisable.
Introduction
Le gène BRCA2 (BReast susceptibilité au cancer gène-2) code pour une protéine suppresseur de tumeur qui joue un rôle crucial dans la réparation des cassures double-brin par régulation de la fonction de l'enzyme recombinase Rad51 1. BRCA2 a également été impliquée dans la modulation de la transcription dans la cellule et le contrôle du cycle 2. Les mutations germinales dans le gène BRCA2 induisent un mode autosomique dominant la susceptibilité au cancer du sein et le cancer de l'ovaire chez les femmes et le cancer de la prostate chez les hommes, ainsi que la prédisposition à d'autres types de cancer 3,4. Cependant, en dépit de l'augmentation du risque dans le développement de cancers, des mutations de BRCA2 qui suppriment ou réduisent fonction de BRCA2 peut rendre les cellules cancéreuses plus vulnérables aux agents chimiothérapeutiques qui causent des dommages de l'ADN 5-7. Cancers sporadiques présentent un taux de mutations BRCA2 (<3%) bien que des niveaux réduits de protéine BRCA2 ont été détectés dans certains types de cancers faible, ce qui suggère que la protéine BRCA2peut être perdue lors de la tumorigenèse dans les cancers sporadiques à travers des mécanismes non-mutation-dépendantes 7,8. Ainsi, il est important de bien comprendre les fonctions de BRCA2 dans le cadre de la biologie du cancer ainsi que dans d'autres milieux biologiques.
Un outil puissant utilisé pour identifier de nouvelles fonctions d'un gène dans des cellules de mammifères est de réduire au silence l'expression. A titre d'exemple, réduire au silence l'expression de BRCA2 dans une variété de cellules epitheliales normales a récemment conduit à l'identification d'une nouvelle fonction de BRCA2 en tant que régulateur de la résistance de anoikis, une étape importante lors de l'acquisition de cellule cancéreuse capacité invasive et métastatique 9. Gene silencing peut être réalisé en introduisant dans les cellules soit faible interférence (si) ARN court en épingle à cheveux ou (sh) des molécules d'ARN ciblant le gène spécifique. La puissance élevée de siRNA et sa facilité d'utilisation en font un outil privilégié pour faire taire des expériences visant à acquérir de nouvelles connaissances sur les processus biologiques critiques, une pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, knockdown efficace de l'expression génique peut ne pas être facilement réalisable pour tous les gènes et peut être très variable en fonction du type de cellule. Parce qu'une diminution des niveaux de protéines intracellulaires est le phénotype le plus pertinent à l'étude, il est crucial de quantifier l'inactivation génique analyse par immunotransfert du produit de gène. Avec cet égard, la protéine BRCA2 présente une autre difficulté: être d'une grande protéine (environ 390 kDa), des difficultés techniques existent pour l'analyse biochimique classique, y compris immunotransfert.
Nous rapportons ici un protocole optimisé pour une inactivation efficace de BRCA2 dans des lignées cellulaires epitheliales humaines et pour la détection rapide et efficace de la protéine BRCA2 knockdown analyse par immunotransfert.
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Protocol
1. Préparer des solutions siARN
- Remettre en suspension 5 nmol de brouillés (Ctrl) et 5 nmol de pastilles séchées BRCA2 siRNA dans 100 ul d'eau exempte de RNase (concentration finale de siRNA: 50 um). Ceci est le stock siRNA et doit être stocké à -20 ° C en 10 aliquotes.
- Prendre une aliquote de 10 pi de stock siRNA et ajouter 40 ul d'eau sans RNase pour obtenir la solution de travail 10 uM siRNA. Cette dilution doit être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.
NOTE: La solution de travail siRNA ne doivent pas subir de congélation / décongélation plus de 3 fois.
2. Ensemencement des lignées cellulaires épithéliales humaines
- Retirer le moyen de lignées cellulaires epitheliales humaines en croissance sous forme de monocouches de cellules dans des plaques de culture tissulaire dans un incubateur humidifié de croissance à 37 ° C, 5% CO 2.
- Laver les cellules dans la plaque une fois avec du PBS (RT 10 ml de PBS pour une plaque de 100 mm).
- Pour détacher les cellules de la plaque,ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% / solution 0,53 mM d'EDTA et incuber 3-5 min en fonction du type de cellule.
- Avant de collecter les cellules détachées, neutraliser la trypsine par addition de 2 ml de milieu de croissance complet contenant 10% de sérum bovin foetal.
- Transférer les cellules dans un tube de 15 ml.
- Centrifuger les cellules à 320 à 330 g pendant 3 min à 4 ° C dans un rotor à godets oscillants.
- Remettre en suspension les culots cellulaires dans 5 ml de milieu sans antibiotiques.
- Compter les cellules au microscope dans une chambre Burker ou en utilisant un système de comptage automatique selon les instructions du fabricant.
- Ensemencer les cellules dans des plaques de 6 puits à environ 80% de confluence après 24 h (0,5-1 x10 6 cellules dans 2 ml de milieu de chaque puits). Le nombre de cellules optimal à être ensemencée peut varier en fonction des lignées cellulaires spécifiques et le taux de croissance.
NOTE: Ne pas ajouter des antibiotiques dans le milieu à ce point parce que les antibiotiques vont interférer négativement avec l'efficacité de transfection. Il est très important que les cellules sont à passages en culture faible (<10) pour atteindre la haute efficacité de transfection de siRNA BRCA2.
3. transfecter des cellules avec un siRNA
- Vingt-quatre heures après l'étalement des cellules, procéder à la première ronde de la transfection.
- Diluer 6 pi de 10 réactif de transfection de siRNA spécifique à base de lipides dans 130 ul de milieu de sérum réduit.
- Diluer 3 pi de 10 pM de siRNA (30 pmoles) dans 130 ul de milieu de sérum réduit.
- Moissonneuse le siRNA dilué avec le réactif de transfection dilué et incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
- Pendant l'incubation, éliminer le milieu à partir des cellules et ajouter 2 ml de milieu frais préchauffé à 37 ° C (sans antibiotiques).
- Ajouter 250 ul de complexes réactif de transfection-ARNsi aux cellules (cette quantité est d'un seul puits d'une plaque à 6 puits).
- Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C76; C avec 5% de CO 2.
- Après 24 h, passer à la deuxième ronde de la transfection en répétant les étapes 3.1.1-3.1.5 avec la modification suivante pour l'étape 3.1.2: diluer 5 pi de 10 uM siRNA (50 pmol) dans 130 pi de milieu sérique réduite.
- Incuber les cellules pendant 1-2 jours à 37 ° C avant analyse.
REMARQUE: Deux séries de transfections et utilisation d'un rapport de réactif haute siRNA / de transfection au second tour sont essentiels pour obtenir un rendement élevé de BRCA2 silencieux.
- Incuber les cellules pendant 1-2 jours à 37 ° C avant analyse.
4. Lyse des cellules pour l'analyse d'immunotransfert
- Préparer du tampon de lyse douce avec du PBS (pH 7,4) contenant 1% de la non-ioniques, non dénaturant détergent octylphénoxypolyéthoxyéthanol, le pyrophosphate de sodium 5 mM, orthovanadate de sodium 1 mM, fluorure de sodium 10 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 2 mM, 10 ug / ml de leupeptine, 10 ug / ml d'aprotinine. Gardez-le sur la glace.
- Enlever le milieu à partir des cellules et wles cendres une fois avec du PBS froid (2 ml / puits) dans la plaque. Pour éviter tout report PBS, retirer complètement de la plaque.
- Ajouter 200 ul de tampon de lyse dans chaque puits.
REMARQUE: si les cellules doivent être utilisés aussi pour d'autres dosages, trypsiniser les cellules comme décrit dans l'étape 2/1 à 2/6 et remettre en suspension les cellules dans du tampon / milieu approprié selon l'application à utiliser. - Faire tourner doucement la plaque pour distribuer uniformément le tampon de lyse et incuber pendant 15 min à 4 ° C sur un agitateur.
- Recueillir le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse sur de la glace en utilisant un grattoir à cellules.
- Centrifuger à 17 900 g pendant 25 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube.
- Mesurer la concentration de protéine en utilisant un dosage de protéine disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
Analyse d'immunotransfert 5. BRCA2
- Préparer le tampon de migration en diluant 50 ml de 20x Tris-Acétate SDS b couriruffer (mM Tricine 50, 50 mM Tris base, 0,1% de SDS, pH 8,24) avec 950 ml d'eau distillée.
- Préparer l'échantillon comme suit: ajouter 15 pg de lysat de cellules totales, 5 ul de tampon d'échantillon 4x contenant dodécylsulfate de lithium à un pH de 8,4, 2 pl de 10x échantillon agent réducteur (0,5 M DTT), et un tampon de lyse jusqu'à un volume final de 20 ul.
NOTE: Ce protocole permet la détection de BRCA2 dans des lignées cellulaires normales aussi lors de l'utilisation d'une plus faible quantité de protéines totales (en bas à 5 ug). - Dénaturer les échantillons à 55 ° C pendant 10 min.
NOTE: Il est crucial d'utiliser 55 ° C. Depuis protéine BRCA2 est thermosensible 11, la hausse des températures de dénaturation se traduisent par la perte constante de pleine longueur intacte (390 kDa) des protéines BRCA2. - Mettre en place la chambre électrophorétique selon les instructions du fabricant.
- Charger les échantillons et 10 pi de haut poids moléculaire pré-coloré protéine standard sur un gel precasted (Tris-Acétate 3-8%) et de fonctionner à 120 V pour abà 2 h 12. Arrêter la course électrophorétique avant la kDa marqueur bleu 55 laisse le gel precasted.
- Préparer le tampon de transfert avec 50 ml de tampon de transfert 20 fois, 100 ml de methanol à 100% et 850 ml d'eau.
- Activer membrane de PVDF (0,45 um de taille de pore) par trempage dans 100% de methanol pendant 5 minutes, rincer à l'eau distillée et équilibrer dans du tampon de transfert au moins pendant 5 minutes. Faire tremper les éponges de l'appareil de transfert dans un tampon de transfert à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Lorsque la course électrophorétique est terminée, assembler le sandwich dans la pile de transfert dans l'ordre suivant (bottom-up): trois éponges saturées dans un tampon de transfert, un 3MM feuille de papier de qualité saturée dans un tampon de transfert, le gel, la membrane de PVDF activé, un 3MM Note feuille de papier saturée dans un tampon de transfert, trois éponges saturée dans un tampon de transfert 13,14. Placez la pile dans les protéines de l'appareil et de transfert à 350 mA pendant 4 heures à 4 ° C ou à 180 mA pendant une nuit à 4 ° C.
NOTE: Etre BRCA2 une très grosse protéine, il est crucial d'étendre le temps de transfert de 1 h (comme suggéré par le fabricant et la plupart des protocoles de transfert) à 4 h ou toute la nuit pour assurer le transfert complet des protéines de haut poids moléculaire. En outre, en raison de la longue période de transfert, il est essentiel d'effectuer le buvard dans une chambre froide à 4 ° C pour minimiser la surchauffe et de faciliter le démontage en sandwich. Systèmes de transfert semi-sèches ne sont pas bonnes pour transférer de grandes protéines. - Après le transfert, laver la membrane avec le SCT, bloquer pendant 1 heure à température ambiante dans du TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contenant du lait en poudre de 5% sans matières grasses et de la sonde pendant la nuit à 4 ° C avec un anticorps polyclonal de lapin 30 pi anti-BRCA2 ( 200 ug / ml), dilué dans 9 ml de TBS-T + 5% de lait écrémé sec [1: 300 (v / v)] dilution.
- Laver la membrane trois fois (10 minutes à chaque fois) avec du TBS-T, puis incuber le filtre pendant 1 heure avec 1 pi d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort anti-lapin dilué dans 10 ml de TBS-T + 5% de lait écrémé sec. Par la suite, laver la membrane trois fois (10 minutes chacun) avec TBS-T.
- Effectuer immunodétection par ECL pour révéler la protéine BRCA2 utilisant la chimioluminescence amplifiée (ECL) Western Blot réactif de détection, en suivant les instructions du fabricant. Visualiser les bandes immunochemiluminescent sur haute résolution ECL films.
- Effectuer immunodétection avec un anticorps pour un gène de ménage, comme β-tubuline (55 kDa), sur le même filtre que le contrôle de chargement en utilisant un anticorps monoclonal à β-tubuline dilué à 1: 1000 (10 ul d'anticorps anti-tubuline en 10 ml TBS-T + 5% de lait sec non gras) pendant 1 heure à température ambiante. Laver et incuber l'anticorps secondaire tel que décrit pour BRCA2 (5.10 à 5.11), à l'exception de l'utilisation de la peroxydase de raifort anti-souris conjuguée à la place de l'anticorps secondaire anti-lapin.
- Acquérir une image numérique de films impressionnés par bandes de immunochemiluminescent et analyser l'intensité de la bande par un logiciel d'analyse d'image spécialisé (par exemple,., ImageJ).
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Representative Results
Avant de procéder à un dosage biologique / biochimique pour examiner l'effet de BRCA2 silence sur les fonctions des cellules, la première étape consiste à vérifier la spécificité de l'inactivation à l'aide d'un ARNsi crypté (non-ciblage siRNA) côte à côte avec BRCA2 siRNA (figure 1A ). Il est important d'effectuer un deuxième tour de transfection de siRNA avec un ratio élevé siRNA / transfection pour obtenir un rendement élevé de BRCA2 silencieux. En effet, effectuer un seul tour de transfection de siRNA ou en utilisant un siRNA inférieur au rapport de transfection au second tour (25 pmol de siRNA et 6 pi de réactif de transfection) entraînerait une efficacité plus faible de knockdown (figure 1B). La deuxième étape consiste à évaluer le temps minimum optimal pour obtenir le plus haut niveau de silençage génique. Selon le type de cellule, cela peut varier entre 24 et 48 heures après le second tour de transfection de siRNA. Par exemple, 24 heures sont suffisantes pour les cellules de la thyroïde Nthy mais jusqu'à 48h sont nécessaires pour réaliser knockdown BRCA2 efficace dans les cellules de la prostate PNT1A (Figure 2A). BRCA2 silence est tout à fait stable jusqu'à sept jours après le deuxième cycle de transfection (figure 2B). Il faut noter que la dénaturation des lysats de cellules à une température supérieure à 55 ° C (100 ° C pendant 5 min), a pour résultat de 50% de perte de protéine BRCA2 (figure 2C), en raison de la thermosensibilité de BRCA2 11.
Une fois que le temps optimal de silence est établie, les effets de la perte de protéine BRCA2 peuvent être exploités dans plusieurs dosages. Etant donné que les mutations in vivo qui provoquent une perte de la fonction de BRCA2 favorisent l'augmentation de la sensibilité à des inhibiteurs de PARP ainsi que d'autres médicaments chimiothérapeutiques qui causent des dommages à l'ADN 15 à 18, un dosage commun est de déterminer la sensibilité des cellules -silenced BRCA2 au rucaparib inhibiteur de PARP ou oloparib. Dans l'expérience rapportée dans la figure 3, les cellules épuisées o PNT1Af protéine BRCA2 par siRNA ont été traitées avec 10 uM rucaparib à 24 h, après quoi la prolifération cellulaire a été évaluée par un test de prolifération cellulaire basé MTT. L'épuisement des résultats de protéine BRCA2 une diminution en fonction du temps de la prolifération cellulaire après traitement rucaparib (figure 3).
Figure 1. Deux séries de transfection et de haute siRNA à la transfection ratio de réactif améliorer BRCA2 silencieux. (A) Spécificité de BRCA2 silencing a été confirmé dans les cellules Nthy par immuno-analyse de 24 heures après le second tour de la transfection, en utilisant siRNA brouillés (Ctrl) en tant que témoin pour la comparaison des niveaux de protéine BRCA2. Marqueurs de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche. (B) les cellules ont été soumises à PNT1A 1 ou 2 cycles de BRCA2 sARNi transfection comme décrit dans le protocole [Cycles (#) 1 et 2] et la protéine BRCA2 épuisement a été quantifiée par immuno-empreinte. Deux cycles de transfection avec le siRNA brouillés ont été utilisés comme contrôle (Ctrl). Dans 2b, PNT1A cellules ont été soumises à deux cycles de transfection de siRNA BRCA2 en utilisant un ARNsi inférieur au rapport de réactif de transfection dans le second cycle comme une modification (25 pmol siRNA / 6 ul de réactif de transfection). Dans tous les cas, les taux de protéine BRCA2 ont été analysées 48 heures après le deuxième cycle. Au fond, la quantification des niveaux de protéine BRCA2 est signalé comme rapport BRCA2 / tubuline. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Optimisation de BRCA2 knockdown. (A) Optimal BRCA2 effet de choc peut exiger de 24 à 48 heures après le deuxième cycle de transfection de siRNA. Deux lignées cellulaires différentes (PNT1A Nthy) et ont été évalués pour BRCA2 knockdown 24 h et 48 h après le deuxième cycle de transfection de siRNA analyse par immunotransfert. En bas, les niveaux de protéine BRCA2 sont rapportés en pourcentage des niveaux au temps 0 h, fixées à 100. Les données représentent la moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. (B) BRCA2 effet de choc est stable pendant 7 jours. PNT1A cellules ont été évalués pour BRCA2 effet de choc jusqu'à 196 heures après le deuxième cycle de transfection de siRNA par immunotransfert. Le rapport du signal de BRCA2 de la tubuline est rapporté à la base. (C) protéine BRCA2 est thermosensible. PNT1A cellules non transfectées ont été recueillis 24 h après étalement (environ 70% de confluence) et lysées selon le protocole. Deux parties aliquotes de la même lysat de cellules (15 pg de protéines totales) ont été dénaturés soit à 55 ° C pendant 10 minutes ou à 100 & #176; C pendant 5 min et les niveaux de protéine BRCA2 ont été évalués par immunotransfert. Au fond, le rapport de BRCA2 au signal de la tubuline est rapporté. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. BRCA2 silencing augmente la sensibilité des cellules à la rucaparib inhibiteur de la PARP. PNT1A cellules transfectées soit avec le contrôle (Ctrl) ou BRCA2 siRNA ont été recueillies 48 h après la transfection et étalées en plaque de 96 puits (2000 cellules / puits). Après 24 h, 10 uM rucaparib a été ajouté aux cellules pendant 24 heures, après quoi les cellules ont été maintenues en l'absence du médicament allant jusqu'à 96 heures. La prolifération cellulaire a été évaluée à l'heure indiquée en utilisant le test au MTT en mesurant l'absorbance à 550-690 nm. EacPoint h de temps représente la moyenne ± SD de trois puits à partir d'une expérience représentative. Ctrl siRNA, ligne bleue; BRCA2 siRNA, ligne rouge. Au sommet, BRCA2 profil de protéines dans les cellules transfectées BRCA2 siRNA est rapporté. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Parce que les mutations de la lignée germinale de la sonde du gène BRCA2 à un risque accru de plusieurs types de cancer, notamment le cancer femelle et mâle du sein, du cancer de l'ovaire, le cancer de la prostate, le cancer du pancréas et le mélanome 3,4, un certain nombre d'études ont été entreprises pour comprendre la fonction biologique de la protéine BRCA2. La plupart de ces études sont d'origine génétique basée principalement en raison de difficultés techniques dans l'analyse d'une protéine géant comme BRCA2. Le procédé décrit ici pour réduire au silence et l'analyse de l'expression de protéine BRCA2 fournit un outil efficace pour étudier les fonctions du gène suppresseur de tumeur BRCA2 dans une large gamme de dosages biologiques. Le protocole de silence est basée sur des procédures standard de transfection siARN encore contient plusieurs modifications cruciales ainsi que des conseils pour knockdown efficace et cohérente de BRCA2. Le protocole de transfection de siRNA est sûre, rapide et efficace et, différemment de shRNA, qui utilise habituellement lenvecteurs tiviral, n'a pas besoin de procédures de biosécurité spécifiques et peuvent être facilement effectués dans un laboratoire équipé d'une installation de culture de cellules. De même, le protocole d'immuno-empreinte a été optimisé pour la détection efficace d'une protéine de grande taille comme BRCA2. Le protocole d'immuno-empreinte a été également validée pour la détection de la protéine BRCA2 humain recombinant exprimé de manière hétérologue dans des cellules de levure 9.
Plusieurs facteurs importants pour la prestation efficace de siRNA sont rapportés ici. Ils comprennent deux cycles de transfection et un haut siRNA ratio de réactifs de transfection, en particulier dans le deuxième cycle. L'absence d'antibiotiques avant et pendant la procédure de transfection est un autre facteur critique. Toutefois, cette procédure expose des cellules en culture à un risque accru de contamination bactérienne; donc des précautions supplémentaires devraient être prises pour garantir un niveau élevé de stérilité à toutes les étapes. Il convient de noter que, selon le type de cellule, le gène efficace knockdoWN typiquement exiger 24-48 h après le deuxième cycle. Le procédé actuel a l'avantage de maintenir silençage génique très stable au moins jusqu'à 7 jours après le deuxième cycle de transfection. Ceci permet l'étude des effets de l'effet de choc dans BRCA2 une variété de dosages biologiques, y compris la réponse cellulaire à divers médicaments chimiothérapeutiques. Toutefois, une limitation de la présente technique est représenté par le fait que les molécules de siARN exogènes ne sont pas intégrés dans le génome, ainsi knock-down stable de l'expression du gène ne peut pas être atteint. Sinon, pour obtenir knockdown stable, shRNA infection lentiviral peut être effectuée, à condition que le laboratoire est préparé pour les besoins en matière de biosécurité supplémentaires (BSL-2 normes selon les directives du NIH). En outre, lorsque la transfection est une approche pas applicable pour étudier la fonction de gènes dans un type cellulaire particulier (par exemple., Les lymphocytes T), l'utilisation de souris knock-out conditionnel Brca2 spécifiques des cellules reste le seul alternAtive 19.
Cette méthode rapports aussi plusieurs conseils pour détection réussie d'une protéine de poids moléculaire élevé par immuno et il est approprié pour les deux protéines de haute et de faible abondance. En particulier, en raison de la thermosensibilité de la protéine BRCA2, une température inférieure dénaturation est critique pour sa détection optimale, en accord avec une étude précédente 11. Ce «truc» technique peut également être utile pour d'autres protéines pour lesquelles la détection par des protocoles standards d'immuno-empreinte a été révélées inefficaces. Nous prévoyons que cette méthode contient des conseils de validité général et peuvent donc faciliter silence et la détection de nombreuses autres protéines difficiles.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
