Abstract
Silencing af tumor suppressor protein BRCA2 og dets detektion ved konventionelle biokemiske analyser udgør en stor teknisk udfordring på grund af den store størrelse af det humane BRCA2 protein (ca. 390 kDa). Vi rapporterer modifikationer af standard siRNA transfektion og immunoblotting protokoller til at lukke munden på den menneskelige BRCA2 og opdage endogene BRCA2 protein henholdsvis i humane epiteliale cellelinjer. Vigtige skridt omfatter en høj siRNA transfektionsreagens forholdet og to efterfølgende runder af siRNA transfektion inden for samme eksperiment. Under anvendelse af disse og andre ændringer af standardprotokollen vi konsekvent opnå mere end 70% silencing af det humane BRCA2 genet som bedømt ved immunoblotting-analyse med anti-BRCA2 antistoffer. Desuden denaturering af cellelysaterne ved 55 ° C i stedet for den konventionelle 70-100 ° C og andre tekniske optimeringer af immunoblotting procedure muliggøre detektion af intakt protein BRCA2 selv whda meget lave mængder af udgangsmateriale er til rådighed, eller når BRCA2 protein ekspressionsniveauerne er meget lave. Effektiv lyddæmpning af BRCA2 i humane celler tilbyder en værdifuld strategi for at forstyrre BRCA2 funktion i celler med intakt BRCA2, herunder tumorceller, at undersøge nye molekylære veje og cellulære funktioner, der kan blive berørt af patogene BRCA2 mutationer i tumorer. Tilpasning af denne protokol til effektiv lyddæmpning og analyse af andre "store" proteiner som BRCA2 bør være let opnåelige.
Introduction
BRCA2 (brystkræft modtagelighed gen-2) genet koder for et tumor suppressor protein, der spiller en afgørende rolle i at reparere DNA dobbelt-strengsbrud ved at regulere funktionen af rekombinaseenzym Rad51 1. BRCA2 har også været impliceret i moduleringen af transkription og i cellecyklus kontrol 2. Kimcellelinje mutationer i BRCA2 genet inducerer en autosomal dominant modtagelighed for bryst- og ovariecancer hos kvinder og prostatakræft hos mænd, samt prædisposition for andre cancertyper 3,4. Men på trods af den øgede risiko i udviklingen af kræft, BRCA2 mutationer, der undertrykker eller reducerer BRCA2-funktionen kan gøre kræftceller mere sårbare over for kemoterapeutiske stoffer, der forårsager DNA-skader 5-7. Sporadiske kræftformer udviser en lav BRCA2 mutationer (<3%), selvom der er fundet reducerede niveauer af BRCA2 protein i visse kræftformer, tyder på, at BRCA2 proteinkan gå tabt under tumorigenese i sporadiske kræftformer gennem ikke-mutations-afhængige mekanismer 7,8. Det er således vigtigt at forstå BRCA2 funktioner i forbindelse med cancer biologi samt i andre biologiske indstillinger.
Et kraftfuldt værktøj anvendes til at identificere hidtil ukendte funktioner af et gen i mammale celler er at lukke munden dets ekspression. Som et eksempel har silencing BRCA2 ekspression i en række forskellige normale epitelceller nylig førte til identifikation af en hidtil ukendt funktion af BRCA2 som regulator af anoikis modstand, et vigtigt trin under erhvervelse af cancercelle invasive og metastatiske evne 9. Gene silencing kan opnås ved at indføre i cellerne enten små interfererende (si) RNA eller kort hårnål (sh) RNA-molekyler rettet mod specifikt gen. Den høje styrke af siRNA og dens brugervenlighed gør det den præferentielle værktøj til silencing eksperimenter der sigter mod at få ny indsigt i kritiske biologiske processer ennd at identificere nye terapeutiske mål. Imidlertid kan effektivt knockdown af genekspression ikke være let opnåelige for alle gener og kan være meget variabel afhængig af celletype. Fordi et fald i intracellulære proteinniveauer er det mest relevante fænotype, der undersøges, er det afgørende at kvantificere gene silencing ved immunoblotting analyse af genproduktet. Med denne henseende BRCA2 protein udgør en yderligere udfordring: at være et stort protein (ca. 390 kDa), findes tekniske problemer til konventionel biokemisk analyse, herunder immunoblotting.
Vi rapporterer her en protokol er optimeret til effektiv dæmpning af BRCA2 i humane epiteliale cellelinjer og for hurtig og vellykket påvisning af BRCA2 protein Knockdown ved immunblotting analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered siRNA-løsninger
- Resuspender 5 nmol scrambled (Ctrl) og 5 nmol BRCA2 siRNA tørrede pellets i 100 ul RNase-frit vand (siRNA koncentration endelig: 50 pm). Dette er den siRNA lager og skal opbevares ved -20 ° C i 10 alikvoter pi.
- Tage en alikvot af 10 pi fra siRNA lager og tilsæt 40 pi RNase-frit vand til opnåelse af 10 pM siRNA arbejdsopløsning. Denne fortynding skal opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
BEMÆRK: siRNA arbejder opløsning bør ikke gennemgå nedfrysning / optøning mere end 3 gange.
2. Podning af humane epitelcellelinier
- Fjern vækstmediet fra humane epiteliale cellelinjer vokser som cellemonolag i vævskulturplader i en befugtet inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Vask cellerne i pladen en gang med RT PBS (10 ml PBS for en 100 mm plade).
- At løsne cellerne fra pladen,tilsættes 2 ml 0,25% trypsin / 0,53 mM EDTA-opløsning og inkuber 3-5 min, afhængigt af celletype.
- Før opsamling af de løsnede celler, neutralisere trypsin ved tilsætning af 2 ml komplet vækstmedium indeholdende 10% føtalt bovint serum.
- Overføre cellerne til et 15 ml rør.
- Centrifuger cellerne ved 320-330 x g i 3 minutter ved 4 ° C i en svingende spand rotor.
- Resuspender cellepelletene i 5 ml antibiotika-frit medium.
- Tæl cellerne under mikroskopet i et Burker kammer eller ved anvendelse af et automatiseret optælling ifølge producentens anvisninger.
- Pode celler i 6-brønds plader til at være omkring 80% sammenflydende efter 24 timer (0,5-1 x10 6 celler i 2 ml medium for hver brønd). Optimale celleantal, der skal podes, kan variere afhængigt af de specifikke cellelinier og vækstraten.
BEMÆRK: Du må ikke tilføje antibiotika i mediet på dette punkt, fordi antibiotika negativt vil forstyrre effektiviteten af overfktion. Det er meget vigtigt, at cellerne er ved lave kultur passager (<10) for at opnå en høj effektivitet i BRCA2 siRNA transfektion.
3. transficerer celler med siRNA
- Fireogtyve timer efter udpladning af cellerne, foretage den første runde af transfektion.
- Fortynd 6 pi lipidbaseret 10 siRNA specifik transfektionsreagens i 130 ul reduceret serum medium.
- Fortynd 3 pi 10 pM siRNA (30 pmol) i 130 ul reduceret serum medium.
- Kombiner den fortyndede siRNA med den fortyndede transfektionsreagens og inkuberes i 5-10 minutter ved stuetemperatur.
- Under inkubation fjernes mediet fra cellerne, og der tilsættes 2 ml frisk medium forvarmet ved 37 ° C (uden antibiotika).
- Tilsættes 250 pi af siRNA-transfektionsreagens komplekser til cellerne (dette beløb er for en enkelt brønd i en 6-brønds plade).
- Inkubér cellerne i en befugtet inkubator ved 3776; C med 5% CO2.
- Efter 24 timer, fortsætte med den anden runde af transfektion ved at gentage trin 3.1.1-3.1.5 med følgende modifikation for trin 3.1.2: fortynd 5 pi 10 pM siRNA (50 pmol) i 130 ul reduceret serum medium.
- Inkubér cellerne i 1-2 dage ved 37 ° C inden analyse.
BEMÆRK: To runder af transfektioner og anvendelse af en høj siRNA / transfektionsreagens forholdet i anden runde er afgørende for at få høj effektivitet BRCA2 silencing.
- Inkubér cellerne i 1-2 dage ved 37 ° C inden analyse.
4. Lyser celler til immunoblotting-analyse
- Forberede frisk lyseringsbuffer med PBS (pH 7,4) indeholdende 1% af det ikke-ioniske, ikke-denaturerende detergent octylphenoxypolyethoxyethanol, 5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumorthovanadat, 10 mM natriumfluorid, 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ml leupeptin, 10 ug / ml aprotinin. Hold det på is.
- Fjern mediet fra cellerne og wash dem én gang med kold PBS (2 ml / brønd) i pladen. For at undgå PBS fremførsel, fjerne den helt fra pladen.
- Tilsæt 200 pi lysepuffer til hver brønd.
BEMÆRK: Hvis cellerne skal anvendes også for andre assays, Trypsinisér cellerne som beskrevet i trin 2,1-2,6 og resuspender cellerne i passende buffer / medium ifølge ansøgningen skal anvendes. - Drej forsigtigt pladen til ensartet at fordele lysis buffer og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C på en rotator.
- Opsaml cellelysat i et mikrocentrifugerør på is under anvendelse af en celleskraber.
- Centrifuger ved 17.900 xg i 25 minutter ved 4 ° C, og den ovenstående væske opsamles i et nyt rør.
- Måle proteinkoncentrationen ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt protein assay ifølge producentens anvisninger.
5. BRCA2 immunoblotting analyse
- Forbered løbebufferen ved at fortynde 50 ml 20x Tris-acetat SDS kører buffer (50 mM Tricin, 50 mM Tris-base, 0,1% SDS, pH 8,24) med 950 ml destilleret vand.
- Prøven forberede følgende: tilsættes 15 ug totalt cellelysat, 5 pi 4x prøvepuffer indeholdende lithiumdodecylsulfat ved pH 8,4, 2 pi 10x prøve reduktionsmiddel (0,5 M DTT), og lysis buffer til et slutvolumen på 20 pi.
BEMÆRK: Denne protokol muliggør påvisning af BRCA2 i normale cellelinjer også når du bruger en lavere mængde af totale proteiner (ned til 5 ug). - Denaturere prøver ved 55 ° C i 10 min.
BEMÆRK: Det er afgørende at bruge 55 ° C. Da BRCA2 protein er varmefølsomt 11, højere denaturerende temperaturer resultere i sammenhængende tab af intakt fuldlængde (390 kDa) BRCA2 protein. - Opsætning af elektroforetisk kammer ifølge producentens anvisninger.
- Indlæse prøver og 10 pi høj molekylvægt pre-farvet protein standard på en precasted gel (Tris-Acetat 3-8%) og køre ved 120 V for abud 2 timer 12. Stop elektroforetiske løb før 55 kDa blå markør forlader precasted gel.
- Forberede overførslen puffer med 50 ml 20x transfer buffer, 100 ml 100% methanol og 850 ml vand.
- Aktivere PVDF-membran (0,45 um porestørrelse) ved opblødning i 100% methanol i 5 minutter, skylles med destilleret vand og ækvilibrere i transfer-buffer i det mindste for 5 min. Soak svampene overførsel apparat Transfer buffer den ved 4 ° C indtil anvendelse.
- Når den elektroforetiske løb er overstået, samle sandwich i overførslen stakken i følgende rækkefølge (bottom-up): tre svampe mættet i transfer-buffer, én 3MM kvalitet papirark mættet i transfer-buffer, gelen, aktiveret PVDF-membran, en 3MM kvalitet papirark mættet i transfer-buffer, tre svampe mættet i transfer-buffer 13,14. Placer stakken i apparatet og overføre proteiner ved 350 mA i 4 timer ved 4 ° C eller ved 180 mA natten over ved 4 ° C.
BEMÆRK: Being BRCA2 en meget stor protein, er det afgørende at forlænge overførslen tid fra 1 time (som foreslået af producenten, og de fleste overførselsprotokoller) til 4 timer eller natten over for at sikre fuldstændig overførsel af høj molekylvægt proteiner. Som følge af den lange overførselstid, er det vigtigt at udføre blotting i et kølerum ved 4 ° C for at minimere overophedning og lette sandwich demontering. Halvtørre transfer systemer er ikke godt for overførsel af store proteiner. - Efter overførsel vaskes membranen med TBS, blokere det i 1 time ved stuetemperatur i TBS-Tween 0,25% (TBS-T) indeholdende 5% fedtfri tørmælk og sonde natten over ved 4 ° C med 30 pi anti-BRCA2 kanin-polyklonalt antistof ( 200 ug / ml), fortyndet i 9 ml TBS-T + 5% fedtfri tørmælk [1: 300 (v / v) Fortynding].
- Vask membranen tre gange (10 min hver) med TBS-T, og derefter inkuberes filteret i 1 time med 1 pi peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin sekundært antistof fortyndet i 10 ml TBS-T + 5% fedtfri tørmælk. Derefter vaskes membranen tre gange (10 min hver) med TBS-T.
- Udføre immunodetektion af ECL at afsløre BRCA2 protein under anvendelse forøget kemiluminescens (ECL) Western Blotting Detection Reagent, ifølge producentens instruktioner. Visualiser immunochemiluminescent bands på høj opløsning ECL film.
- Udfør immunodetektion med et antistof for en husholdning gen, ligesom β-tubulin (55 kDa), på samme filter som ladningskontrol ved anvendelse af et monoklonalt antistof mod β-tubulin fortyndet til 1: 1.000 (10 pi anti-tubulin antistof i 10 ml TBS-T + 5% fedtfri tørmælk) i 1 time ved stuetemperatur. Vaske og inkuberes sekundært antistof som beskrevet for BRCA2 (5,10-5,11), bortset fra anvendelsen af peberrodsperoxidase-konjugeret anti-mus i stedet for anti-kanin sekundært antistof.
- Anskaf et digitalt billede af filmene imponeret med immunochemiluminescent bands og analysere båndintensitet ved dedikerede billedanalyse software (f.eks., ImageJ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du fortsætter med et biologisk / biokemisk analyse for at undersøge effekten af BRCA2 lyddæmpning på cellefunktioner, det første skridt er at bekræfte specificiteten af lyddæmpning ved at bruge en kodet siRNA (ikke-targeting siRNA) side om side med BRCA2 siRNA (figur 1A ). Det er vigtigt at udføre en anden runde af siRNA transfektion med en høj siRNA / transfektion forhold at få en høj effektivitet i BRCA2 silencing. Faktisk udfører kun én runde af siRNA transfektion eller ved hjælp af en lavere siRNA transfektion forholdet i anden runde (25 pmol af siRNA og 6 pi transfektionsreagens) ville resultere i lavere knockdown effektivitet (figur 1B). Det andet skridt er at vurdere den optimale mindste tid til at få det højeste niveau af gendæmpning. Afhængigt af den celletype, kan dette variere mellem 24 og 48 timer efter den anden runde af siRNA transfektion. For eksempel 24 timer er tilstrækkelige til Nthy thyreoideaceller men op til 48time er behov for effektiv BRCA2 knockdown i PNT1A prostataceller (figur 2A). BRCA2 nedregulering er ganske stabil indtil dag 7 efter den anden transfektion cyklus (figur 2B). Af note, denaturering cellelysaterne ved en temperatur over 55 ° C (100 ° C i 5 minutter), resulterer i op til 50% tab af BRCA2 protein (figur 2C), som følge af thermosensitivity af BRCA2 11.
Når optimal lyddæmpning tid er etableret, kan virkningen af tab af BRCA2 protein udnyttes i flere analyser. Da in vivo mutationer, der forårsager tab af funktion af BRCA2 fremme øget følsomhed over for PARP-inhibitorer samt andre kemoterapeutiske lægemidler, der forårsager DNA-ødelæggelse 15-18, en fælles assay er at bestemme følsomheden af BRCA2 -silenced celler til PARP inhibitor rucaparib eller oloparib. I eksperimentet rapporteret i figur 3, PNT1A celler depleteret of BRCA2 protein gennem siRNA er blevet behandlet med 10 pM rucaparib i 24 timer, hvorefter celleproliferation er blevet vurderet af en MTT-baserede celleproliferationsassay. Udtømning af BRCA2 protein resulterer i en tidsafhængig formindskelse i celleproliferation efter rucaparib behandling (figur 3).
Figur 1. To runder af transfektion og høj siRNA transfektionsreagens forhold til at forbedre BRCA2 lyddæmpning. (A) Specificitet af BRCA2 silencing blev bekræftet i Nthy celler ved immunoblotting analyse 24 timer efter den anden runde af transfektion, hjælp scrambled siRNA (Ctrl) som kontrol for sammenligning af BRCA2 protein niveauer. Molekylvægtmarkører rapporteres til venstre. (B) PNT1A celler blev udsat for 1 eller 2 cykler af BRCA2 sIRNA transfektion som beskrevet i protokollen [Cycles (#) 1 og 2], og BRCA2 protein depletering blev kvantificeret ved immunblotting. To cyklusser af transfektion med scrambled siRNA blev anvendt som kontrol (Ctrl). I 2b, blev PNT1A celler underkastet to cyklusser af BRCA2 siRNA transfektion under anvendelse af en lavere siRNA transfektionsreagens forhold til i den anden cyklus som en modifikation (25 pmol siRNA / 6 pi transfektionsreagens). I alle tilfælde blev BRCA2 proteinniveauer analyseret 48 timer efter den anden cyklus. Nederst er kvantificering af BRCA2 protein niveauer rapporteret som BRCA2 / tubulin-forholdet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Optimering af BRCA2 knockdown. (A) Optimal BRCA2 knockdown kan kræve 24 til 48 timer efter den anden siRNA transfektion cyklus. To forskellige cellelinier (PNT1A og Nthy) blev vurderet for BRCA2 knockdown 24 timer og 48 timer efter den anden siRNA transfektion cyklus ved immunblotting analyse. I bunden er BRCA2 proteinniveauer rapporteret som procent af niveauet til tiden 0 timer, fastsat til 100. Dataene repræsenterer middelværdien ± SE af tre uafhængige forsøg. (B) BRCA2 knockdown er stabil i 7 dage. PNT1A celler blev vurderet for BRCA2 knockdown indtil 196 timer efter den anden siRNA transfektion cyklus ved immunoblotting. Forholdet mellem BRCA2 til tubulin signal er rapporteret i bunden. (C) BRCA2 protein er varmefølsomt. Ikke-transficerede PNT1A celler blev opsamlet 24 timer efter udpladning (ca. 70% konfluens) og lyseret ifølge protokollen. To portioner af den samme cellelysat (15 ug totale proteiner) blev denatureret enten ved 55 ° C i 10 minutter eller ved 100 & #176; C i 5 min og BRCA2 proteinniveauer blev vurderet ved immunblotting. Nederst, forholdet mellem BRCA2 til tubulin signal er rapporteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. BRCA2 silencing øger cellens følsomhed over for PARP-inhibitor rucaparib. PNT1A celler enten transficeret med kontrol (Ctrl) eller BRCA2 siRNA blev opsamlet 48 timer efter transfektion og udpladet i 96-brønds plade (2000 celler / brønd). Efter 24 timer blev 10 pM rucaparib tilsat til cellerne i 24 timer, hvorefter cellerne blev holdt i fravær af lægemidlet op til 96 timer. Celleproliferation blev vurderet ved den angivne tid ved hjælp af MTT-assayet ved at måle absorbansen ved 550 til 690 nm. Each tid punkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre brønde fra et repræsentativt eksperiment. Ctrl siRNA, blå linje, BRCA2 siRNA, røde linje. På toppen, BRCA2 protein profil i BRCA2 siRNA-transficerede celler er rapporteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi germline mutationer af BRCA2 genet fører til øget risiko for flere kræfttyper, herunder kvindelige og mandlige brystcancer, ovariecancer, prostatacancer, pancreascancer, og melanom 3,4, har en række undersøgelser blevet udført for at forstå den biologiske funktion af BRCA2-proteinet. De fleste af disse undersøgelser er genetisk baseret primært på grund af tekniske vanskeligheder i at analysere en kæmpe protein ligesom BRCA2. Fremgangsmåden beskrevet her for lyddæmpning og analyse BRCA2 proteinekspression fremgangsmåde tilvejebringer et effektivt værktøj til at undersøge funktionerne i BRCA2 tumorsuppressorgen i et bredt spektrum af biologiske assays. Den lyddæmpning protokollen er baseret på standard siRNA transfektion procedurer endnu indeholder flere vigtige ændringer samt tips til en vellykket og konsekvent knockdown af BRCA2. SiRNA transfektionsprotokol er sikker, hurtig og effektiv, og anderledes end shRNA, som normalt gør brug af LENtiviral vektorer, ikke behøver særlige biosikkerhed procedurer og let kan udføres i enhver laboratorium udstyret med en cellekultur facilitet. Tilsvarende har immunoblotting-protokollen er optimeret til effektiv påvisning af et stort protein som BRCA2. Immunoblotting protokol er blevet valideret også til påvisning af rekombinant humant BRCA2-protein heterologt udtrykt i gærceller 9.
Flere vigtige faktorer for effektiv levering af siRNA er rapporteret her. De omfatter to cykler af transfektioner og en høj siRNA transfektionsreagens forhold til, især i den anden cyklus. Fravær af antibiotika før og under transfektion procedure er en anden kritisk faktor. Men denne procedure udsætter celler i kultur til øget risiko for bakteriel forurening; derfor bør tages ekstra forholdsregler for at sikre en høj standard for sterilitet på alle trin. Det skal bemærkes, at, afhængigt af den celletype, effektiv gen knockdown vil typisk kræve 24-48 timer efter den anden cyklus. Den nuværende metode har den fordel, at holde gen silencing ret stabile i det mindste indtil dag 7 efter den anden transfektion cyklus. Dette tillader studiet af virkningerne af BRCA2 knockdown i en række biologiske assays, herunder cellulære respons på forskellige kemoterapeutiske lægemidler. Imidlertid er en begrænsning af den foreliggende teknik består i, at eksogene siRNA-molekyler ikke er integreret i genomet, kan således stabil knockdown af genekspression ikke opnås. Alternativt, for at få en stabil knockdown, shRNA lentiviral infektion kan udføres, forudsat at laboratoriet er forberedt til yderligere biosikkerhed krav (BSL-2 standarder i henhold til de NIH retningslinjer). Hertil kommer, når transfektion er ikke en anvendelig metode til at undersøge genfunktion i en specifik celletype (f.eks., T-lymfocytter), anvendelse af cellespecifikke betinget BRCA2-knockout-mus er den eneste alterntiv 19.
Denne metode rapporter også flere tips til en vellykket påvisning af en høj molekylvægt protein ved immunoblotting og det er hensigtsmæssigt for både høj og lav hyppighed proteiner. Især på grund af thermosensitivity af BRCA2 protein, et lavere denatureringstemperatur er kritisk for dets optimale afsløring, efter aftale med en tidligere undersøgelse 11. Denne tekniske "trick" kan også være nyttige for andre proteiner, for hvilke detektering ved standard immunoblotting protokoller er blevet bevist forgæves. Vi forventer, at denne metode indeholder tips af almen gyldighed og dermed kan fremme lyddæmpning og opdagelse af mange andre udfordrende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
