Abstract
Tümör baskılayıcı protein BRCA2 ve konvansiyonel biyokimyasal analizler tarafından tespit susturma insan BRCA2 proteininin (yaklaşık 390 kDa) büyüklüğü sayesinde büyük bir teknik sorun oluşturmaktadır. Biz insan epitel hücre hatlarında sırasıyla endojen BRCA2 proteini, insan BRCA2 susturmak ve tespit etmek için standart siRNA transfeksiyon ve immunoblotting protokolleri değişiklikler rapor. Anahtar adımlar transfeksiyon reaktif oranı yüksek siRNA ve aynı deney içinde siRNA transfeksiyon birbirini takip eden iki mermi bulunmaktadır. Anti-BRCA2 antikorlar ile analiz immün tarafından değerlendirilecek sürekli olarak insan BRCA2 geninin fazla% 70 susturulması elde standart protokole bu ve diğer değişiklikler kullanma. Buna ek olarak, bunun yerine klasik 70-100 ° C ve immunoblotting prosedür diğer teknik iyileştirmeler 55 ° C'de hücre lizatlarının denatürasyon sağlam BRCA2 proteininin tespiti da WH izinbaşlangıç malzemesinin çok düşük miktarlarda en mevcuttur ya da BRCA2 protein ekspresyon seviyesi çok düşük olduğunda. Insan hücrelerinde BRCA2 etkin susturulması, tümör hücreleri de dahil olmak üzere sağlam BRCA2, hücrelerde BRCA2 fonksiyonunu bozmaya yeni moleküler yollar ve tümör patojenik BRCA2 mutasyonu etkilenebilir hücre fonksiyonlarını incelemek için değerli bir strateji vardır. Verimli susturma ve BRCA2 gibi diğer 'büyük' protein analizi için bu protokolün Adaptasyon kolayca ulaşılabilir olmalıdır.
Introduction
BRCA2 (Meme Kanseri yatkınlık geni-2) gen rekombinaz enzimi Rad51 1 işlevini düzenleyen DNA çift iplikli sonları onarımında önemli bir rol oynayan bir tümör baskılayıcı protein kodlayan. BRCA2 aynı zamanda transkripsiyonun modülasyonu ve hücre döngüsü kontrol 2 implike edilmiştir. BRCA2 geninin germline mutasyonlar için diğer kanser türleri 3,4 otozomal dominant erkeklerde meme ve kadınlarda yumurtalık kanseri ve prostat kanseri olan yatkınlığı, hem de yatkınlığı neden olur. Ancak, bastırmak ya da DNA hasarına neden olan 5-7 kemoterapötik ajanların kanser hücrelerinin daha hassas hale getirebilir BRCA2 fonksiyonunu azaltmak kanser, BRCA2 mutasyonları gelişmekte riski rağmen. Sporadik kanserler o BRCA2 protein düşündüren, BRCA2 proteininin azaltılmış düzeylerinin bazı kanser türlerinde tespit edilmiştir rağmen BRCA2 mutasyonları (<% 3) düşük bir oran sergilemektedirolmayan mutasyon bağımlı mekanizmalar 7,8 ile sporadik kanserlerde tümör oluşumu sırasında kaybolmuş olabilir. Bu nedenle, tam Kanser biyolojisinde bağlamında gibi diğer biyolojik ortamlarda BRCA2 fonksiyonlarını anlamak önemlidir.
Memeli hücrelerinde gen yeni işlevleri belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır ifadesini susturma etmektir. Bir örnek olarak, normal epitel hücrelerinin çeşitli susturma BRCA2 sentezleme en son anoikis direnci, kanser hücresi invaziv ve metastatik yeteneği 9 edinilmesi sırasında önemli bir aşama düzenleyici olarak BRCA2 yeni bir fonksiyon belirlenmesine yol açmıştır. Gen susması hücrelerin küçük müdahale (si) RNA ya da özel bir geni hedef alan kısa bir saç tokası (sh) RNA molekülleri ya sokulması ile elde edilebilir. Yüksek siRNA gücü ve kullanım kolaylığı kritik biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar kazanma amaçlı deneyler susturmak için onu tercihli aracı yapmak birnd yeni tedavi hedefleri tespit etmek. Ancak, gen ekspresyonunun etkili bir yok etme tüm genler kolaylıkla elde olmayabilir ve hücre türüne bağımlı olarak oldukça değişken olabilir. Hücre içi protein seviyelerinde bir azalma araştırılmaktadır en uygun fenotip olduğu için, gen ürününün analizi immün gen susmasını ölçmek için son derece önemlidir. Bu bağlamda, BRCA2 proteininin bir başka meydan okuma sunuyor: Büyük bir protein (yaklaşık 390 kDa) olan, teknik zorluklar immunoblotting dahil olmak üzere geleneksel biyokimyasal analiz için mevcut.
Biz burada insan epitel hücre hatlarında BRCA2 verimli susturulması için ve analiz immün demonte BRCA2 proteininin hızlı ve başarılı tespiti için optimize edilmiş bir protokol rapor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. siRNA çözümleri hazırlayın
- (50 uM son konsantrasyon siRNA) RNaz içermeyen su, 100 ul BRCA2 siRNA kurutuldu pelet 5 karıştırılmış (CTRL) nmol ve 5 nmol yeniden süspanse edin. Bu siRNA stok ve 10 ul alikotları -20 ° C'de saklanmalıdır.
- SiRNA stoktan 10 ul bir kısım alın ve 10 uM siRNA çalışma çözeltisi elde etmek için RNaz içermeyen su içinde 40 ul ekle. Bu seyreltme, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklanmalıdır.
NOT: siRNA çalışma çözüm / dondurma geçmesi 3 kat daha fazla çözülme olmamalıdır.
İnsan epitelyal hücre hattı olduğunu 2. Tohum
- 37 ° C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde doku kültürü plakaları içinde hücre mono tabakaları olarak büyüyen insan epitelyal hücre hatları büyüme ortamı çıkarın.
- Bir kez RT PBS ile plaka hücreleri (100 mm tabak için 10 ml PBS) yıkayın.
- Plaka hücreleri ayırmak için,% 0.25 tripsin ve 2 ml / 0.53 mM EDTA çözeltisi ekleme ve hücre tipine bağlı olarak 3-5 dakika inkübe edin.
- Müstakil hücreleri toplamak önce,% 10 fetal sığır serumu içeren tam büyüme ortamı 2 ml eklenerek tripsin nötralize eder.
- 15 ml'lik bir tüpe hücreleri aktarın.
- Sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C'de 3 dakika boyunca 320-330 xg'de hücreleri santrifüjleyin.
- Antibiyotikler-içermeyen ortamdan 5 ml hücre pelletleri yeniden süspanse edin.
- Bir Bürker odasında mikroskop altında ya da imalatçının talimatlarına uygun olarak, otomatik bir sayma sistemi kullanarak hücreleri sayın.
- 6-delikli plakalardaki hücreler 24 saat (de 0.5-1 x 10 her biri için ortam 2 ml 6 hücre) sonra yaklaşık% 80 konfluent olarak tohumu. Optimal hücre sayısı özel hücre çizgileri, büyüme oranına bağlı olarak değişebilir tohumlanır edilmesi.
NOT: antibiyotikler olumsuz transfe verimliliği engel olacak çünkü bu noktada ortamda antibiyotik katmayınction. Bu BRCA2 siRNA transfeksiyon, yüksek verim elde etmek için, düşük bir kültür geçitlerin (<10) en hücreleri olması çok önemlidir.
SiRNA ile 3. Transfect hücreleri
- Yirmi dört saat sonra, hücreler kaplama sonrası, transfeksiyon ilk tur devam edin.
- Indirgenmiş serum ortamı 130 ul lipid bazlı 10 siRNA belirli transfeksiyon reaktif 6 ul sulandırmak.
- Indirgenmiş serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (30 pmol) 3 ul sulandırmak.
- Seyreltildi transfeksiyon reaktifi ile seyreltildi siRNA birleştirin ve oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, hücrelerden orta kaldırmak ve taze ortam (antibiyotiksiz), 37 ° C'de önceden ısıtılmış 2 ml ekleyin.
- Hücrelere siRNA transfeksiyon reaktifi komplekslerinin 250 ul (bu miktar, 6 gözlü bir plakanın tek oyuk için) ekleyin.
- 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe76;% 5 CO2 C.
- 24 saat sonra, adım 3.1.2 şu değişiklikler 3.1.1-3.1.5 adımları tekrarlayarak transfeksiyon ikinci tur devam: düşük serum ortamı 130 ul 10 uM siRNA (50 pmol), 5 ul seyreltilir.
- Analizden önce 37 ° C'de 1-2 gün süreyle inkübe hücreleri.
NOT: transfeksiyonları ve ikinci turda yüksek bir siRNA / transfeksiyon reaktif oranına kullanımının iki tur BRCA2 sessizliğini yüksek verim elde etmek için gereklidir.
- Analizden önce 37 ° C'de 1-2 gün süreyle inkübe hücreleri.
Immunoblotting analizi için 4. Hücreleri,
- Iyonik-olmayan, denatüre edici olmayan deterjan oktilfenoksipolietokisetanol% 1, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat, 10 mM sodyum flüorür, 2 mM fenilmetilsülfonil fluorür, 10 ug içeren PBS (pH 7.4), taze liziz tamponu / ml löpeptin, 10 | ig / ml aprotinin. Buz üzerinde tutun.
- Hücreler ve w orta çıkarınlevhanın soğuk PBS (2 ml / oyuk) ile bir kez bunları kül. Herhangi bir PBS taşınmasını önlemek için, tamamen plaka çıkarın.
- Her bir oyuğa liziz tamponu içinde 200 ul ekle.
NOT: hücreler, diğer analizler için de kullanılabilir hücreleri trypsinize aşama 2,1-2,6 tarif edildiği gibi ve uygulamaya göre, uygun tampon / ortam içinde hücreler tekrar süspansiyon gerekir ise kullanılır. - Yavaşça eşit lizis tamponu dağıtma ve bir döndürücüde 4 ° C de 15 dakika inkübe etmek plaka döndürün.
- Bir hücre kazıyıcı kullanılarak buz üzerinde, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre lizat toplayın.
- 4 ° C'de 25 dakika boyunca 17.900 x g'de santrifüje ve yeni bir tüp içinde supernatant toplamak.
- Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilen protein deneyi kullanılarak protein konsantrasyonu ölçümü.
5. BRCA2 immunoblotting analizi
- 20x Tris-Asetat SDS çalışan b 50 ml seyreltilmesi ile çalışan tampon hazırlayınUffer (50 mM Trişin, 50 mM Tris baz,% 0.1 SDS, pH 8.24) damıtılmış su 950 ml.
- Aşağıda örnek hazırlayın: 20 nihai bir hacme kadar 15 toplam hücre lizatı ug, 4x numune tamponu içinde 5 ul pH 8.4 lityum dodesil sülfat içeren, 10x Örnek indirgeyici madde (0.5 M DTT) 2 ul ve lizis tampon eklemek ul.
NOT: Bu protokol, (5 ug kadar), aynı zamanda, toplam proteinlerin daha düşük bir miktarda kullanarak, normal hücre çizgilerinde BRCA2 saptanmasını sağlar. - 10 dakika boyunca 55 ° C'de numune denatüre.
NOT: 55 ° C kullanmak çok önemlidir. BRCA2 proteini ısıya 11 olduğu için, daha yüksek sıcaklıklar, denatüre edici tam boy (390 kDa), BRCA2 proteininin tutarlı bir azalmaya neden olur. - Üreticinin talimatlarına göre elektroforetik bölmeyi ayarlayın.
- Örnekler ve precasted jeli üzerinde yüksek molekül ağırlıklı ön-lekeli protein standardı 10 ul (Tris-Asetat% 3-8) yük ve ab 120 V çalıştırmak2 saat 12. 55 kDa mavi işaretleyici precasted jel ayrılmadan önce elektroforetik akışını durdurur.
- 20x Transfer tamponu, 50 ml% 100 metanol, 100 ml ve 850 ml su ile birlikte Transfer tamponu hazırlayın.
- 5 dakika boyunca% 100 metanol içinde ıslatarak PVDF membranı (0.45 mikron gözenek büyüklüğü) aktive damıtılmış su ile yıkayın ve en az 5 dakika için transfer tamponu içinde dengeye. Kullanılana kadar 4 ° C 'de transfer tampon maddesi transfer cihazının sünger bekletin.
- Elektroforetik çalışma bittiğinde, aşağıdaki sırayla (aşağıdan yukarıya) transfer yığınında sandviç monte: transfer tamponu doymuş üç süngerler, tek 3MM sınıfı kağıt levha transfer tamponu, jel, aktif PVDF membran, tek 3mm doymuş Transfer tamponunda doymuş sınıf kağıt levha, üç süngerler transfer tamponu 13,14 doymuş. 4 ° C'de gece boyunca mA 4 ° C ya da 180 ° C'de 4 saat 350 mA'da cihazı ve aktarım proteinleri içine yığın yerleştirin.
NOT: yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin tam transferini sağlamak üzere 4 saat veya gece için (üretici ve çoğu aktarım protokolleri tarafından önerilen) olmak BRCA2 çok büyük bir protein o 1 saat transfer süresini uzatmak için çok önemlidir. Buna ek olarak, uzun bir aktarım zaman, bu aşırı ısınmayı en aza indirmek ve sandviç Sökme kolaylaştırmak için 4 ° C 'de soğuk bir odada blotting işleminin gerçekleştirilmesi için çok önemlidir. Yarı kuru transfer sistemleri büyük proteinlerin aktarımı için iyi değildir. - Aktarma işleminden sonra (30 ul anti-BRCA2 tavşan poliklonal antikoru ile 4 ° C'de bir gece boyunca% 5 yağsız kuru süt ve probu içeren TBS-Tween% 0.25 içinde oda sıcaklığında 1 saat (TBS-T) için bloke TBS ile zarın yıkanması [: 300 (h / h) sulandırma 1] 9 ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt içinde seyreltilmiş 200 ng / ml).
- Daha sonra TBS 10 ml seyreltilmiş bayır turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru ile 1 ul, 1 saat boyunca filtre inkübe, TBS-T ile, membran üç defa (10 dk) yıkayın-T +% 5 yağsız kuru süt. Bundan sonra, TBS-T ile membranı üç defa (10 dk) yıkayın.
- Gelişmiş kemilüminesans (ECL) Western Blot saptama reaktif maddesi kullanılarak, üretici talimatlarına göre BRCA2 proteini ortaya çıkarmak için ECL tarafından immunodeteksiyon gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü ECL filmlerinde immunochemiluminescent bantları gözünüzde canlandırın.
- 10 anti-tubulin antikoru 1000 (10 ul: β-tubulin bir monoklonal antikor kullanılarak 1 seyreltilmiş göre yükleme kontrolü olarak, aynı filtre üzerinde, β-tubulin (55 kDa) gibi bir ev bakıcısı geni için bir antikor ile immunodeteksiyon gerçekleştirme oda sıcaklığında 1 saat ml TBS-T +% 5 yağsız kuru süt). Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare yerine anti-tavşan sekonder antikor kullanılması haricinde, yıkama ve BRCA2 (5,10-5,11) için tarif edildiği gibi sekonder antikoru inkübe edin.
- (Immunochemiluminescent bantları ile etkilendim filmlerin dijital görüntü elde ve özel görüntü analiz yazılımı tarafından bant yoğunluğunu analiz, örneğin., ImageJ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre fonksiyonları üzerine BRCA2 susturma etkisini incelemek üzere bir biyolojik / biyokimyasal tahlil geçmeden önce, ilk adım bir şifreli siRNA (siRNA olmayan hedefleme) BRCA2 siRNA ile yan yana (Şekil 1A kullanarak susturma özgünlüğünü doğrulamak için ). Bu BRCA2 susturma yüksek verim elde etmek için yüksek bir siRNA / transfeksiyon oranı ile siRNA transfeksiyon ikinci tur gerçekleştirmek için önemlidir. Gerçekten de, siRNA transfeksiyon tek aşama performans ya da daha düşük, yok etme etkisi (Şekil 1B) neden olur ikinci turda (siRNA 25 pmol ve transfeksiyon reaktifi 6 ul) transfeksiyon oranı için daha düşük bir siRNA kullanılarak. İkinci adım gen susturma en üst düzeyde elde etmek için en uygun minimum zaman değerlendirmektir. Hücre tipine bağlı olarak, bu siRNA transfeksiyon ikinci tur sonra 24 ila 48 saat değişebilir. Örneğin, 24 saat Nthy tiroit hücreleri için yeterli olan, ancak en fazla 48HR PNT1A prostat hücrelerinde en verimli BRCA2 demonte (Şekil 2A) için gereklidir. BRCA2 susturma, ikinci transfeksiyon döngüsü (Şekil 2B) sonraki 7. günde kadar oldukça stabildir. Dikkat çekici bir şekilde, 55 ° C'de (5 dakika için 100 ° C) üstünde bir sıcaklıkta, hücre lizatları denatüre nedeniyle BRCA2 11 ısısal için BRCA2 protein (Şekil 2C), en fazla% 50 kayıp ile sonuçlanır.
Optimal susturma süresi belirlendikten sonra, BRCA2 protein kaybının etkileri, pek çok tayinde yararlanılabilir. DNA hasarı, 15-18 neden olan diğer kemoterapötik ilaçlara gibi PARP önleyicileri duyarlılığı arttıran BRCA2 fonksiyonunun kaybına yol in vivo mutasyonu için, ortak bir deney PARP önleyicisi rucaparib için BRCA2 -silenced hücrelerinin duyarlılığını tespit etmektir veya oloparib. Şekil 3'te belirtilen deneyde, PNT1A hücreler o tükenmişsiRNA ile ön BRCA2 protein hücre proliferasyonu MTT-bazlı hücre proliferasyon deneyi ile değerlendirilmiştir sonra 24 saat boyunca 10 uM rucaparib ile muamele edilmiştir. Rucaparib tedavisi (Şekil 3) sonra hücre çoğalması, zamana bağlı bir azalmaya BRCA2 proteini sonuçları tükenmesi.
Şekil 1. transfeksiyon reaktif oranı transfeksiyon ve yüksek siRNA'nın iki tur BRCA2 susturulması geliştirmek. (A) BRCA2 susturma Özgünlük BRCA2 protein düzeylerinin karşılaştırılması için bir kontrol olarak karıştırılmış siRNA (CTRL) kullanılarak transfeksiyon ikinci turu sonrasında analizi 24 saat immün Nthy hücrelerinde doğrulandı. Moleküler ağırlık belirteçleri sol tarafta rapor edilir. (B) PNT1A hücreleri BRCA2 s 1 ya da 2 döngüsüne tabi tutulmuşturprotokol açıklanan [Döngüler (#) 1 ve 2] ve BRCA2 protein tükenmesi immunoblotting tarafından ölçüldü olarak IRNA transfeksiyonu. Karıştırılmış siRNA ile transfeksiyon iki döngü Kontrol (CTRL) olarak kullanılmıştır. 2b'de, PNT1A hücreleri modifikasyon (25 pmol siRNA / 6 ul transfeksiyon reaktifi) ikinci çevrimde transfeksiyon reaktifi oranı için daha düşük bir siRNA kullanılarak BRCA2 siRNA transfeksiyon, iki döngüsüne tabi tutulmuştur. Tüm durumlarda, BRCA2 protein düzeyleri, ikinci döngüden sonra 48 saat analiz edildi. En altta, BRCA2 protein seviyelerinin ölçümü BRCA2 / tubulin oranı olarak bildirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
BRCA2 demonte 2. Optimizasyon Şekil. (A) Optimal BRCA2 demonte ikinci siRNA transfeksiyon devrinden sonra 24 ila 48 saat gerektirebilir. İki farklı hücre hatları (PNT1A ve Nthy) BRCA2 demonte 24 saat karıştırıldı ve analiz immün ikinci siRNA transfeksiyon döngüsünden sonra 48 saat boyunca değerlendirilmiştir. Alt kısımda, BRCA2 protein seviyeleri 100 Veriler, üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil etmektedir ± SE olarak belirlenmiştir, zaman 0 saat sonra seviyelerinin yüzdesi olarak rapor edilmiştir. (B) BRCA2 demonte 7 gün boyunca stabildir. PNT1A hücreleri immunoblotting tarafından ikinci siRNA transfeksiyon döngüsünden sonra 196 saat kadar BRCA2 demonte açısından değerlendirildi. Tübülin sinyaline BRCA2 oranı dibinde bildirilmiştir. (C) BRCA2 protein termosensitif olduğunu. Sigara transfekte PNT1A hücreleri protokole göre (yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa) kaplama 24 saat sonra toplandı ve lize edilmiştir. Aynı hücre lizatı (15 ug toplam protein), iki alikotları, 10 dakika boyunca, 100 ve # 55 ° C 'de, ya denatüre edilmiştir176; 5 dakika ve BRCA2 protein düzeyleri Cı immunoblotting ile değerlendirildi. En altta, tubulin sinyali BRCA2 oranı bildirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. BRCA2 susturma PARP önleyicisi rucaparib hücre hassasiyetini arttırmaktadır. PNT1A hücreler ya Kontrol (CTRL) ya da BRCA2 siRNA ile transfekte transfeksiyondan sonra 48 saat toplandı ve 96-çukurlu plaka içinde kaplandı (2000 hücre / oyuk). 24 saat sonra, 10 uM rucaparib hücreleri 96 saat kadar, ilacın yokluğunda tutulmuş, sonra 24 saat için hücrelere ilave edildi. 690 nm - Hücre proliferasyonu 550 nm'de absorbans ölçülerek MTT tahlili kullanılarak, belirtilen zamanda değerlendirildi. Each zaman noktası, bir temsili deneyden üç kuyu ortalama ± SD'sini gösterir. Ctrl siRNA, mavi çizgi, BRCA2 siRNA, kırmızı çizgi. Üst kısmında, BRCA2 siRNA transfekte hücrelerde BRCA2 protein profili bildirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kadın ve erkek meme kanseri, yumurtalık kanseri, prostat kanseri, pankreas kanseri ve melanom 3,4 dahil olmak üzere birçok kanser türleri, risk artışına BRCA2 geni kurşun germline mutasyonlar, çok sayıda çalışma biyolojik işlevini anlamak için yapılmıştır Çünkü BRCA2 protein. Bu çalışmaların çoğu nedeniyle BRCA2 gibi dev bir protein analiz teknik zorluklar genetik temelli çoğunlukla. BRCA2 protein ekspresyonu susturma ve analiz edilmesi için burada tarif edilen metot, biyolojik tahliller, geniş bir spektrum içinde BRCA2 tümör baskılayıcı gen işlevlerini araştırılması için etkili bir araç sağlar. susturma protokol henüz BRCA2 başarılı ve tutarlı demonte birkaç önemli değişiklikler yanı sıra ipuçları içerir, standart siRNA transfeksiyon prosedürleri dayanmaktadır. siRNA transfeksiyon protokolü genellikle len kullanan shRNA, farklı, güvenli, hızlı ve verimli veantiviral vektörler, belirli biyogüvenlik prosedürleri gerekmez ve kolayca hücre kültürü tesisi ile donatılmış herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Benzer şekilde, immunoblotting protokolü BRCA2 gibi büyük bir proteinin etkin bir şekilde tespiti için optimize edilmiştir. immunoblotting protokolü de heterolog maya hücreleri 9 eksprese edilen rekombinant insan BRCA2 proteinin tespit edilmesi için onaylanmıştır.
SiRNA verimli verme için çeşitli önemli faktörler burada rapor edilmektedir. Özellikle ikinci çevrim iki transfeksiyonun döngüleri ve transfeksiyon reaktifi oranı yüksek bir siRNA içerir. Transfeksiyon prosedürü önce antibiyotik ve sırasında yokluğu başka önemli faktördür. Ancak bu işlem bakteriyel kontaminasyon riski kültür hücreleri ortaya; Böylece ekstra önlemler tüm adımlarda sterilite yüksek bir standart garanti alınmalıdır. Belirtilmelidir, hücre tipine bağlı olarak, etkili bir gen knockdo buwn tipik ikinci döngüden sonra 24-48 saat gerektirir. Geçerli yöntem, en azından gün 7 ikinci transfeksiyon döngüsü sonrasına kadar oldukça istikrarlı susturulması geni tutma avantajına sahiptir. Bu, farklı kemoterapötik ilaçlara hücresel yanıt da dahil olmak üzere, biyolojik tahliller, çeşitli demonte BRCA2 etkilerinin çalışma sağlar. Bununla birlikte, bu tekniğin bir sınırlama eksojen siRNA molekülleri genomuna entegre değildir gerçeği ile temsil edilir, gen ekspresyonu ve böylece stabil bir yok etme elde edilemez. Seçenek olarak ise, sabit bir demonte elde etmek için, shRNA lentiviral enfeksiyonu laboratuar ilave biyo-güvenlik gereksinimleri (BSL-2 standartları, NIH talimatlarına göre) için hazırlanmış olması şartıyla, gerçekleştirilebilir. Transfeksiyon, belirli bir hücre türü, gen fonksiyonunu incelemek için (örn., T lenfositler) uygulanabilir bir yaklaşım değildir Buna ek olarak, hücre spesifik koşullu BRCA2 knockout farelerde kullanımı, sadece altern kalır19 ative.
Bu yöntem aynı zamanda rapor immünoblotlama ile bir yüksek molekül ağırlıklı protein başarılı bir şekilde saptanması için çeşitli ipucu ve yüksek ve düşük bolluk proteinleri hem de uygundur. Nedeniyle BRCA2 protein ısısal, özellikle de, bir düşük denatüre sıcaklığı önceki bir çalışmada 11 ile uyumlu olarak, optimal tespiti için kritik önem taşır. Bu teknik trick ', standart bağışıklık beneklenme protokolleri ile algılama başarısız ispatlanmış olan diğer proteinler için yararlı olabilir. Biz bu yöntem susturulması ve diğer pek çok zorlu proteinlerin saptanmasını kolaylaştırabilir ve böylece genel geçerlilik ipuçları içerir ve öngörmekteyiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
