Abstract
השתקה של BRCA2 החלבון המדכא הסרטן וגילויה על ידי ניתוח ביוכימי קונבנציונלי מהווה אתגר טכני גדול בגלל הגודל הגדול של חלבון BRCA2 האנושי (כ 390 KDA). אנו מדווחים שינויים של פרוטוקולי transfection וimmunoblotting siRNA סטנדרטיים להשתיק BRCA2 האנושי ולזהות חלבון אנדוגני BRCA2, בהתאמה, בשורות תאי אפיתל אנושיות. צעדים עיקריים כוללים siRNA גבוה יחס מגיב transfection ושני סיבובים הבאים של transfection siRNA בתוך אותו הניסוי. באמצעות שינויים אלה ואחרים לפרוטוקול הסטנדרטי באופן עקבי להשיג השתקה יותר מ -70% מגן BRCA2 האנושי כמו להישפט על ידי immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד BRCA2. בנוסף, denaturation של lysates התא ב 55 מעלות צלזיוס במקום C הקונבנציונלי 70-100 מעלות ואופטימיזציות טכניות אחרות של הליך immunoblotting לאפשר זיהוי חלבון BRCA2 שלם של אפילו ש"שen סכומים נמוכים מאוד של חומר מוצא זמינים או כאשר רמות ביטוי חלבון BRCA2 הן נמוכות מאוד. השתקה יעילה של BRCA2 בתאים אנושיים מציעה אסטרטגיה יקרה להפריע לפעילות של BRCA2 בתאים עם BRCA2 שלם, כוללים תאים סרטניים, לבחון מסלולים מולקולריים חדשים ותפקודים תאיים שעלולים להיות מושפע על ידי מוטציות BRCA2 פתוגניים בגידולים. העיבוד של פרוטוקול זה להשתקה וניתוח של חלבונים אחרים 'גדולים' כמו BRCA2 יעילים צריך להיות בר השגה בקלות.
Introduction
גן BRCA2 (רגישות לסרטן שד גן-2) מקודד לחלבון מדכא גידולים שממלא תפקיד מכריע בתיקון הפסקות פעמיים גדיל DNA על ידי המסדיר את התפקוד של אנזים recombinase 1 Rad51. BRCA2 גם היה מעורב באפנון של שעתוק ובבקרת מחזור תא 2. מוטציות בתאי מין בגן BRCA2 לגרום רגישות אוטוזומלית דומיננטית לסרטן שד ושחלות בנשים וסרטן הערמונית אצל גברים, כמו גם נטייה לסוגי סרטן אחרים 3,4. עם זאת, למרות העלייה בסיכון בהתפתחות סרטן, מוטציות BRCA2 המדכאות או להפחית פונקצית BRCA2 עלול להפוך תאים סרטניים פגיעים יותר לתרופות כימותרפיות הגורמות לניזק לדנ"א 5-7. סרטן סדיר להציג שיעור נמוך של מוטציות BRCA2 (<3%) למרות שרמות מופחתות של חלבון BRCA2 של אותרו בכמה סוגי הסרטן, טוען כי חלבון BRCA2עלול ללכת לאיבוד במהלך tumorigenesis בסרטן סדיר באמצעות מנגנונים שאינן מוטציה תלויה 7,8. לכן, חשוב להבין באופן מלא פונקציות BRCA2 בהקשר של ביולוגיה של הסרטן, כמו גם בהגדרות ביולוגיות אחרות.
כלי רב עוצמה המשמש לזיהוי פונקציות רומן של גן בתאי יונקים הוא להשתיק את ביטויה. כדוגמא, ביטוי BRCA2 השתקה במגוון רחב של תאי האפיתל נורמלים הוביל לאחרונה לזיהוי של תפקוד רומן של BRCA2 כרגולטור של התנגדות anoikis, צעד חשוב ברכישה של תאים סרטניים יכולת פולשנית וגרורתי 9. השתקת גנים יכולה להיות מושגת על ידי החדרת בתאים או RNA הקטן מפריע (si) או מולקולות RNA סיכה קצרה (SH) מיקוד הגן הספציפי. העוצמה הגבוהה של siRNA וקלות שימוש להפוך אותו לכלי המועדף להשתקת ניסויים שמטרתם תובנה חדשות תהליכים ביולוגיים קריטייםND לזהות מטרות טיפוליות חדשניות. עם זאת, מציאה יעילה של ביטוי גנים לא יכולה להיות ברת השגה בקלות לכל הגנים ויכולה להיות מאוד משתנה בהתאם לסוג התא. בגלל ירידה ברמות חלבון תאיות הוא הפנוטיפ הרלוונטי ביותר בחקירה, חשוב לכמת השתקת גנים על ידי immunoblotting ניתוח של מוצר הגן. עם כל כבוד זה, חלבון BRCA2 מציב אתגר נוסף: להיות חלבון גדול (כ 390 KDA), קשיים טכניים קיימים לאנליזה ביוכימית קונבנציונלית, כוללים immunoblotting.
אנו מדווחים כאן פרוטוקול מותאם להשתקה יעילה של BRCA2 בשורות תאי אפיתל אדם ולזיהוי מהיר ומוצלח חלבון BRCA2 מציאה ידי immunoblotting ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכן את פתרונות siRNA
- Resuspend 5 nmol של מקושקשת (Ctrl) ו -5 nmol של כדורים מיובשים BRCA2 siRNA במים RNase ללא 100 μl (ריכוז siRNA סופי: 50 מיקרומטר). זהו מניית siRNA וחייבים להיות מאוחסנים ב -20 ° C ב 10 aliquots μl.
- קח aliquot של 10 μl ממניות siRNA ולהוסיף 40 μl מים RNase ללא להשיג הפתרון עובד 10 מיקרומטר siRNA. דילול זה חייב להיות מאוחסן ב -20 ° C עד לשימוש.
הערה: הפתרון עובד siRNA לא צריך לעבור הקפאה / פשרה יותר מ 3 פעמים.
2. זריעה של שורות תאי אפיתל האדם
- הסר את מדיום גידול משורות תאי אפיתל אדם גדלו כמו monolayers תא בצלחות תרבית רקמת חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לשטוף את התאים בצלחת פעם אחת עם RT PBS (10 מיליליטר של PBS לצלחת 100 מ"מ).
- כדי לנתק את התאים מהצלחת,להוסיף 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% / 0.53 פתרון mM EDTA ודגירה 3-5 דקות, תלוי בסוג התא.
- לפני איסוף התאים מנותקים, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום גידול מלא המכיל 10% בסרום שור עוברי.
- להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה התאים ב320-330 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור דלי מתנדנד.
- Resuspend את כדורי תא ב5 מיליליטר של מדיום אנטיביוטיקה-חינם.
- ספירת התאים תחת מיקרוסקופ בתא "שודד גופות או על ידי שימוש במערכת ספירה אוטומטית בהתאם להוראות היצרן.
- זרעי התאים בצלחות 6-גם להיות מחוברים כ -80% לאחר 24 שעות (0.5-1 x10 6 תאים ב 2 מיליליטר של מדיום לכל טוב). מספר תאים אופטימלי לזרע עשוי להשתנות בהתאם לשורות תאים הספציפיות וקצב הצמיחה.
הערה: אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום בשלב זה בגלל אנטיביוטיקה שלילי להפריע ליעילות של transfeסיפורת. זה מאוד חשוב כי התאים במעברים נמוכים תרבות (<10) כדי להשיג יעילות גבוהה של transfection BRCA2 siRNA.
3. תאי Transfect עם siRNA
- עשרים וארבע שעות לאחר ציפוי התאים, להמשיך בסיבוב הראשון של transfection.
- לדלל 6 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס siRNA ספציפי 10 ב -130 μl של מדיום סרום מופחת.
- לדלל 3 μl של 10 מיקרומטר siRNA (30 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת.
- מערבבים את siRNA המדולל עם מגיב transfection המדולל ודגירה של 5-10 דקות ב RT.
- במהלך הדגירה, להסיר את המדיום מן התאים ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום טרי מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס (ללא אנטיביוטיקה).
- הוסף 250 μl של המתחמים מגיב siRNA-transfection לתאים (סכום זה הוא לטוב אחד של צלחת 6-היטב).
- דגירה התאים בחממה humidified ב 3776; C עם 5% CO 2.
- לאחר 24 שעות, להמשיך בסיבוב השני של transfection ידי חזרה על שלבי 3.1.1-3.1.5 עם השינוי הבא לצעד 3.1.2: לדלל 5 μl של 10 מיקרומטר siRNA (50 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת.
- דגירה התאים במשך 1-2 ימים על 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
הערה: שני סבבים של transfections ושימוש ביחס מגיב siRNA / transfection הגבוה בסיבוב השני הם חיוניים כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2.
- דגירה התאים במשך 1-2 ימים על 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
4. תאי Lyse לניתוח immunoblotting
- הכן מאגר תמוגה טרי עם PBS (pH 7.4) המכיל 1% מאינם denaturing octylphenoxypolyethoxyethanol nonionic, חומרי הניקוי, pyrophosphate נתרן 5 מ"מ, orthovanadate נתרן 1 מ"מ, פלואוריד נתרן 10 מ"מ, פלואוריד phenylmethylsulfonyl 2 מ"מ, 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin. שמור את זה על קרח.
- הסר את המדיום מן התאים וwאפרם פעם אחת עם PBS הקר (2 מיליליטר / טוב) בצלחת. כדי למנוע כל שריד PBS, להסיר אותו לחלוטין מהצלחת.
- הוסף 200 μl של חיץ תמוגה היטב כל אחד.
הערה: אם התאים צריכים לשמש גם למבחנים אחרים, trypsinize התאים כמתואר בשלב 2.1-2.6 וresuspend התאים במאגר / בינוני מתאימים בהתאם ליישום לשימוש. - בעדינות לסובב את הצלחת להפיץ באופן אחיד מאגר תמוגה ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על הכתף.
- לאסוף את lysate התא בצינור microcentrifuge על קרח באמצעות מגרד תא.
- צנטריפוגה ב 17900 XG במשך 25 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור חדש.
- למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון זמין מסחרי על פי הוראות היצרן.
ניתוח immunoblotting 5. BRCA2
- הכן את המאגר פועל על ידי דילול 50 מיליליטר של 20x טריס-אצטט SDS ב פועליםuffer (50 מ"מ tricine, 50 מ"מ טריס בסיס, 0.1% SDS, pH 8.24) עם 950 מיליליטר של מים מזוקקים.
- הכן את המדגם באופן הבא: להוסיף 15 מיקרוגרם בסך הכל lysate תא, 5 μl של חיץ מדגם 4x מכיל סולפט dodecyl ליתיום ב- pH 8.4, 2 μl 10x מדגם סוכן צמצום (0.5 M DTT) של, ומאגר תמוגה לנפח סופי של 20 μl.
הערה: פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של BRCA2 בשורות תאים נורמלים גם בעת שימוש בכמות נמוכה יותר של חלבונים כולל (עד 5 מיקרוגרם). - לפגל דגימות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: זה חיוני כדי להשתמש 55 מעלות צלזיוס. מאז חלבון BRCA2 הוא thermosensitive 11, טמפרטורות denaturing גבוהות לגרום לאובדן של באורך מלא בשלמות (390 KDA) חלבון BRCA2 עקבי. - הקים את תא electrophoretic לפי הוראות היצרן.
- טען את הדגימות ו -10 μl לסטנדרטים של חלבון משקל מולקולרי גבוה מראש צבעונית על ג'ל precasted (טריס-אצטט 3-8%) ולהפעיל ב 120 V לabמתוך 2 שעות 12. לעצור את ריצת electrophoretic לפני הסמן הכחול kDa 55 משאיר את הג'ל precasted.
- הכן את חיץ ההעברה עם 50 מיליליטר של 20x חיץ העברה, של מתנול 100% 100 מיליליטר ו -850 מיליליטר מים.
- הפעל קרום PVDF (גודל נקבובית 0.45 מיקרומטר) על ידי השרייה במתנול 100% במשך 5 דקות, לשטוף עם מים מזוקקים ולאזן במאגר העברה לפחות במשך 5 דקות. משרים את ספוגים של מנגנון ההעברה בהעברת חיץ על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- כאשר electrophoretic הריצה נגמרה, להרכיב את הכריך בערימת ההעברה בהזמנה (מלמטה למעלה) הבאה: שלושה ספוגים רוויים במאגר העברה, גיליון נייר כיתה 3 מ"מ אחד רווי במאגר העברה, ג'ל, קרום PVDF הופעל, אחד 3 מ"מ גיליון נייר כיתה רווי במאגר העברה, שלושה ספוגים רוויים במאגר העברת 13,14. הנח את המחסנית לתוך חלבוני המנגנון והעברה ב 350 מילי-אמפר לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס או 180 מילי-אמפר הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: להיות BRCA2 חלבון גדול מאוד, זה הוא חיוני כדי להאריך את זמן העברה מהשעה 1 (כפי שהוצע על ידי היצרן ורוב פרוטוקולי העברה) 4 שעות או לילה על מנת להבטיח העברה של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים מלאה. בנוסף, בשל הזמן ארוך העברה, זה הכרחי כדי לבצע את סופג בחדר קר ב 4 ° C כדי למזער התחממות יתר ולהקל פירוק כריך. מערכות העברת חצי יבשות הן לא טובות להעברת חלבונים גדולים. - לאחר העברה, לשטוף את הממברנה עם כפות, לחסום אותו במשך שעה 1 ב RT ב0.25% TBS-Tween (TBS-T) המכילה חלב ללא שומן 5% יבשים ובדיקת הלילה ב 4 ° C עם נוגדן הארנב polyclonal 30 μl אנטי-BRCA2 ( 200 מיקרוגרם / מיליליטר), בדילול מלא 9 מיליליטר TBS-T + 5% שומן חלב יבש [1: 300 (V / V) דילול].
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T, אז דגירה המסנן עבור שעה 1 עם 1 μl של נוגדן נגד ארנב חזרת peroxidase מצומדות המשני מדולל ב 10 מיליליטר של TBS-T + 5% שומן חלב יבש. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T.
- בצע immunodetection ידי ECL לחשוף חלבון BRCA2 באמצעות chemiluminescence המשופרת (ECL) מערבית סופג איתור מגיב, הבאים להוראות היצרן. דמיינו להקות immunochemiluminescent בסרטים ברזולוציה גבוהה ECL.
- בצע immunodetection עם נוגדן לגן משק, כמו β-טובולין (55 KDA), באותו המסנן בקרת טעינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים לβ-טובולין בדילול של 1: 1,000 (10 μl של נוגדן אנטי-טובולין ב 10 מיליליטר TBS-T + 5% חלב יבש ללא שומן) במשך שעה 1 ב RT. לשטוף דגירה נוגדנים משני כמתואר עבור BRCA2 (5.10-5.11), פרט לשימוש בחזרת אנטי עכבר peroxidase מצומדות במקום נוגדנים משני נגד ארנב.
- לרכוש תמונה דיגיטלית של הסרטים הרשימו עם להקות immunochemiluminescent ולנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (לדוגמא., ImageJ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני שתמשיך עם assay ביולוגי / ביוכימי לבחון את ההשפעה של השתקת BRCA2 על פונקציות תא, הצעד הראשון הוא לאשר את הספציפיות של ההשתקה באמצעות siRNA מקושקשת (ללא מיקוד siRNA) זה לצד זה עם BRCA2 siRNA (איור 1 א ). חשוב לבצע סיבוב של transfection siRNA שני עם יחס גבוה siRNA / transfection כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2. ואכן, ביצוע רק סיבוב אחד של transfection siRNA או באמצעות siRNA נמוך יחס transfection בסיבוב השני (25 pmol של siRNA ו -6 μl של מגיב transfection) יביא ליעילות מציאה תחתונה (איור 1). הצעד השני הוא להעריך את הזמן המינימאלי האופטימלי כדי לקבל את הרמה הגבוהה ביותר של השתקת גנים. בהתאם לסוג התא, עשויים להשתנות בין 24 ו -48 שעות לאחר הסיבוב של transfection siRNA השני. לדוגמא, 24 שעות מספיקות לתאי בלוטת התריס Nthy אבל עד 48שעות דרושות למציאה יעילה BRCA2 בתאי ערמונית PNT1A (איור 2 א). השתקת BRCA2 היא יציבה למדי, עד שהיום 7 אחרי מחזור transfection השני (איור 2). ראוי לציין, denaturing lysates התא בטמפרטורה מעל 55 מעלות צלזיוס (100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות), תוצאות בעד 50% אובדן חלבון BRCA2 (איור 2 ג), של עקב thermosensitivity של BRCA2 11.
ברגע שזמן השתקה אופטימלי היא הוקם, את ההשפעות של אובדן חלבון BRCA2 של עלולות להיות מנוצלות בכמה מבחני. מאז מוטציות in vivo הגורמים לאובדן התפקוד של BRCA2 לקדם רגישות מוגברת למעכבי PARP, כמו גם לתרופות כימותרפיות אחרות הגורמות לניזק לדנ"א 15-18, assay נפוץ הוא לקבוע את הרגישות של תאי -silenced BRCA2 לrucaparib מעכב PARP או oloparib. בניסוי דיווח באיור 3, תאי PNT1A מדולדלים oטופל חלבון BRCA2 ו באמצעות siRNA עם 10 מיקרומטר rucaparib למשך 24 שעות, לאחר שהתפשטות תאים כבר העריכה ידי assay התפשטות תאים מבוסס MTT. דלדול של תוצאות חלבון BRCA2 בירידה תלויה זמן בהתפשטות תאים לאחר טיפול rucaparib (איור 3).
איור 1. שני סיבובים של transfection והגבוה siRNA ליחס מגיב transfection לשפר השתקת BRCA2. ספציפי של השתקת BRCA2 () אושר בתאי Nthy ידי immunoblotting ניתוח 24 שעות לאחר הסיבוב של transfection השני, באמצעות siRNA המקושקשת (Ctrl) כשליטה להשוואה של רמות חלבון BRCA2. סמני משקל מולקולריים מדווחים על השמאל. תאים (B) PNT1A היו נתונים למחזורים 1 או 2 של BRCA2 שלtransfection אירנ"א, כמתואר בפרוטוקול [מחזורים (#) 1 ו- 2] וחלבון BRCA2 דלדול היה לכמת על ידי immunoblotting. שני מחזורים של transfection עם siRNA המקושקשת שמשו כבקרה (Ctrl). ב2b, תאי PNT1A היו נתונים לשני מחזורים של transfection BRCA2 siRNA באמצעות siRNA נמוך יחס מגיב transfection במחזור השני כשינוי (25 pmol / 6 מגיב transfection μl siRNA). בכל המקרים, רמות חלבון BRCA2 נותחו 48 שעות לאחר המחזור השני. בתחתית, כימות של רמות חלבון BRCA2 היא כפי שדווחה יחס BRCA2 / טובולין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אופטימיזציה של מציאה BRCA2. Optim ()מציאה BRCA2 אל עשויה לדרוש 24 עד 48 שעות לאחר מחזור transfection siRNA השני. שני קווים שונים תא (PNT1A וNthy) הוערכו לBRCA2 מציאה 24 שעות ו -48 שעות לאחר מחזור transfection siRNA השני על ידי immunoblotting ניתוח. בתחתית, רמות חלבון BRCA2 המדווחים כאחוז מהרמות בזמן 0 שעה, נקבעו על 100. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SE של שלושה ניסויים בלתי תלויים. מציאה (ב) BRCA2 היא יציבה למשך 7 ימים. תאי PNT1A הוערכו למציאת BRCA2 עד 196 שעות לאחר מחזור transfection siRNA השני על ידי immunoblotting. היחס של BRCA2 לאות טובולין דיווח בתחתית. חלבון (C) BRCA2 הוא thermosensitive. תאי PNT1A transfected-ללא נאספו 24 שעות לאחר ציפוי (confluency כ -70%) וlysed על פי הפרוטוקול. שני aliquots של אותו lysate התא (15 מיקרוגרם חלבוני סך הכל) היה מפוגל או על 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או ב 100 & #176; צלזיוס למשך 5 דקות ורמות חלבון BRCA2 הוערכה על ידי immunoblotting. בתחתית, היחס של BRCA2 לאות טובולין דווח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. השתקת BRCA2 מגבירה את רגישות התאים לrucaparib מעכב PARP. תאי PNT1A או transfected עם שליטה (Ctrl) או BRCA2 siRNA נאספו 48 שעות לאחר transfection ומצופים ב96-גם צלחת (2000 תאים / טוב). לאחר 24 שעות, 10 rucaparib מיקרומטר התווסף לתאים למשך 24 שעות, לאחר שהתאים הוחזקו בהעדר התרופה עד 96 שעות. התפשטות תאים הוערכה בזמן המצוין באמצעות assay MTT על ידי מדידת הספיגה ב 550-690 ננומטר. EACנקודת זמן h מייצגת את ממוצע ± סטיית תקן של שלוש בארות מניסוי נציג. Ctrl siRNA, קו כחול; BRCA2 siRNA, קו אדום. בחלק העליון, פרופיל חלבון BRCA2 בתאי transfected-siRNA BRCA2 דווח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בגלל מוטציות בתאי מין של עופרת גן BRCA2 לעלייה בסיכון למספר סוגי הסרטן, כוללים סרטן נשי וגברי השד, סרטן השחלות, סרטן הערמונית, סרטן לבלב, ולנומה 3,4, מספר מחקרים נעשו על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של חלבון BRCA2. רוב המחקרים האלה הם בעיקר מבוסס גנטיים בשל קשיים טכניים בניתוח חלבון ענק כמו BRCA2. השיטה המתוארת כאן להשתקה וניתוח ביטוי חלבון BRCA2 מספקת כלי יעיל כדי לחקור את הפונקציות של הגן המדכא גידולי BRCA2 בקשת רחבה של מבחני ביולוגיים. פרוטוקול ההשתקה מבוסס על נהלי transfection siRNA סטנדרטיים עדיין מכיל כמה שינויים חיוניים כמו גם טיפים למציאה מוצלחת ועקבית של BRCA2. פרוטוקול transfection siRNA הוא בטוח, מהיר ויעיל ו, שונה מshRNA, אשר בדרך כלל עושה שימוש בlenוקטורי tiviral, לא צריכים נהלי בטיחות ביולוגית ספציפיים ויכולים להתבצע בקלות בכל מעבדה מצוידת במתקן תרבית תאים. כמו כן, פרוטוקול immunoblotting כבר מותאם לזיהוי יעיל של חלבון גדול כמו BRCA2. פרוטוקול immunoblotting כבר גם תוקף לגילוי חלבון BRCA2 האנושי רקומביננטי הביע heterologously בתאי שמרים 9.
מספר גורמים חשובים לאספקה יעילה של siRNA מדווחים כאן. הם כוללים שני מחזורים של transfections וsiRNA גבוה יחס מגיב transfection, במיוחד במחזור השני. היעדר אנטיביוטיקה לפני ובמהלך הליך transfection הוא עוד גורם קריטי. עם זאת, הליך זה חושף תאים בתרבית לעלייה בסיכון לזיהום חיידקים; כך יש לנקוט באמצעי זהירות נוספת כדי להבטיח רמת סטריליות גבוהה בכל השלבים. יצוין כי, בהתאם לסוג התא, knockdo גן יעילwn בדרך כלל ידרוש 24-48 שעות לאחר המחזור השני. יש השיטה הנוכחית יש את היתרון של שמירה על גן ההשתקה יציב למדי, לפחות עד יום 7 אחרי מחזור transfection השני. זה מאפשר לחקר ההשפעות של BRCA2 מציאה במגוון רחב של מבחני ביולוגיים, כוללים התגובה התאית לתרופות כימותרפיות שונות. עם זאת, הגבלה של הטכניקה הנוכחית מיוצגת על ידי העובדה שמולקולות siRNA אקסוגניים אינן משולבות בגנום, מציאה יציבה כך של ביטוי גנים לא ניתן להשיג. לחלופין, כדי לקבל מציאה יציבה, זיהום lentiviral shRNA עשויה להתבצע, ובלבד שהמעבדה מוכנה לדרישות נוספות בטיחות ביולוגית (2 מנהלת הליגה סטנדרטים על פי הנחיות NIH). בנוסף, כאשר transfection הוא לא גישה ישימה ללמוד תפקוד הגן בסוג תא מסוים (לדוגמא., לימפוציטים מסוג T), שימוש בעכברי נוקאאוט BRCA2 המותנה תא ספציפי נשאר רק alternיצירתי 19.
דיווחי שיטה זו גם כמה טיפים לזיהוי מוצלח של חלבון משקל מולקולרי גבוה על ידי immunoblotting וזה מתאים לשני חלבוני שפע גבוהים ונמוכים. בפרט, בשל thermosensitivity של חלבון BRCA2, טמפרטורת denaturing נמוך היא קריטית לזיהוי האופטימלי שלה, בהסכם עם מחקר קודם 11. 'טריק' זה טכני עשוי להיות שימושי גם לחלבונים אחרים שזיהוי על ידי פרוטוקולי immunoblotting סטנדרטיים הוכח לא מוצלח. אנו צופים כי בשיטה זו מכילה טיפים תוקף כללי ובכך עשוי להקל על השתקה וזיהוי של חלבונים רבים מאתגרים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
