Summary
Цель образца ориентации Tag (SPOT), чтобы функционировать в качестве инструмента ориентации, чтобы помочь в идентификации личности ткани в нескольких парафиновых блоков тканей. Эти протоколы показывают, как легко построены из общих, недорогих материалов и гистологии служит надежным визуальным маркером, в парафиновых блоков и секций.
Abstract
Мульти-ткани парафиновые блоки обеспечивают высокую пропускную способность анализ с повышенной эффективностью, экспериментальной единообразия и уменьшения времени и стоимости. Тканевые микрочипы составляют большинство мульти-ткани парафиновых блоков, но и все чаще исследователи с использованием не-облеченные блоки, содержащие большие тканей из нескольких лиц, которые могут обеспечить многие преимущества тканевых микрочипов без значительных инвестиций в планировании и оборудования. Важным компонентом любого анализа мульти-ткани является метод ориентации, используемый для идентификации каждого отдельного ткани. Хотя существуют методы для поддержания правильной ориентации и идентификации тканей в нескольких тканевых блоков, большинство не очень хорошо подходит для не-облеченные блоков, может потреблять драгоценное пространство в массиве и / или трудно производить в стандартной гистологии лаборатории. Образец Ориентация тегов (спот) простой, низкая стоимость ориентации инструмента, что отчетливо видно в парафиновые блоки и всех срезов FOг надежная идентификация образцов в выстроенных и не выстроились макеты. Месте обеспечивает преимущества по сравнению с существующими методами ориентации для не-выстроены блоков, как это не требует какого-либо прямого модификации ткани и обеспечивает гибкость в расположении тканевых частей.
Introduction
Возможность вставлять образцы тканей из нескольких лиц в одном парафинового блока позволяет легко бок о бок сравнение между лечения и физических лиц, устраняет вариабельность между слайдами, а также снижает стоимость и объем работы секционирования и окрашивания образцов. Эти многофункциональные блоки ткани обычно получают либо в виде тканевых микрочипов (TMA) или парафиновых блоков, содержащих ткани из нескольких индивидуумов в макете не-массива. Обслуживание идентичности образца имеет решающее значение для успеха любого анализа нескольких тканей. Исследователи использовали ТМА, так как их развитие с целью повышения эффективности анализа, снизить вариацию между слайдами, ценные ресурсы ткани, и сократить время и стоимость экспериментов 1. Правильное положение ТМА может быть достигнуто с помощью различных методов, в том числе пустых пространств, строк или столбцов между ядрами ткани 2-4, асимметричным расположением основных групп 3, 5 (например, Controл против лечения), "маяка" ядра 6, и назначенные ядра ориентации, находящиеся за пределами матрицы ТМА 3. Хотя эти методы хорошо работают для ТМА, наиболее отнимают основную ТМА пространство и TMAS с пробелов и пробелов в идентификаторы могут стать запутанным, как сердечники ткани исчерпаны в течение долгого времени. Кроме того, эти методы не подходят для использования в нескольких тканевых блоков без формате массива, потому что они полагаются на аномалии в плотно упорядоченной структуре единых микрочипов ядер, как идентификаторы. Большинство блоков не-облеченные нескольких тканей должны учитывать неоднородные ткани и, по определению, не отображать структурированную сетку массив, который делает эти аберрации выделяются в качестве ориентиров.
Хотя существует много преимуществ в использовании ТМА, один из самых больших недостатков является небольшой размер сердечников, которые не всегда представитель в основном гетерогенной ткани 1. Номера выстроенные блоки мульти-ткани обеспечивают многие из тон приносит пользу из ТМА, но содержат большие образцы ткани или целые органы из исследований на животных. Тканевые микрочипы, использующие один сердечники имеют различные согласование с участками цельной ткани на основе белка, представляющего интерес, и многие требуют несколько ядер для повышения согласованности 7-11. Из-за сложности и гетерогенной природы некоторых биомаркеров фенотипов, ТМА, используя даже большое число ядер (> 10) по-прежнему может быть недостаточно и может потребоваться другие, чем микрочипов для анализа 8 методов. Кроме того, ТМА строительство отнимает много времени, технически сложных, и требует первоначальных затрат и инвестиций в или доступ к ткани arrayer. Номера для упорядоченной блоки мульти-ткани могут быть сделаны в любой основной лаборатории со значительно меньшими затратами времени и усилий и реальной альтернативой для исследований, которые требуют больше ткани, чем массивы позволяют или в качестве средства, чтобы сократить расходы и упростить анализ.
Номера выстроены несколько блоки ткани аналогично требует надежной иразориентации маркер для отслеживания идентификацию образца, однако, развитие этих маркеров был ограничен. Большая часть литературы, описывающей ориентацию ткани фокусируется на правильном физиологическом ориентации для встраивания отдельных частей ткани, такие как татуировки ткани с чернилами 12, предварительно вложение тканей в агар-желатин до обработки 13, и маркировка определенные ткани с вырезами 14 или 15 швов , Хотя функциональный, эти методы не являются идеальными в качестве маркеров в нескольких тканевых блоков из-за ограничений. Шов будет срезы через быстро и не может быть виден в каждой секции. Предварительно вложение методы с использованием агар-желатин может сохранить ткани в правильном положении во время обработки и вложения, но не обеспечивает визуальный сигнал, чтобы дифференцировать между несколькими образцами в парафиновый блок и слайдов. Пазы или краситель на ткани может осложнить анализ или закрывают важные морфологические детали. Кроме того, идентичность тканив блоке не объединенным в массивы нескольких тканей может осуществляться с помощью встраивания кусочки ткани в асимметричном расположении, но это требует 3 или более кусочки ткани и может не позволять для оптимального расположения тканей для анализа.
Образец Ориентация тегов (SPOT) была разработана в качестве простого и недорогого способа четко определить тканей в нескольких тканевых блоков и предлагает множество преимуществ по сравнению с существующими методами ориентации. Пятно небольшое, красочные, ядро состоит из гидроксиэтил агарозном геле обработки и маркировки ткани красителя, и проникли с парафином (рис 2С). Ядро пятно встроен в конце рядом с одной ткани в парафин блока мульти-ткани и выглядит как яркие точки в блоке и в каждом разделе (рис 1А - D), четко указав правильную ориентацию блока и секций для облегчения идентификации ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Строительство месте
- Добавьте 50 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 1 мл тканевого маркировки красителем в 15 мл коническую пробирку или 2 мл пробирке и вихря в течение 1 мин или до полного растворения.
Примечание: Для этого протокола, использовать биохимический Grade BSA. В то время как другие сорта и чистота не были проверены, ожидается, что оценка и чистота не будет иметь значительное влияние на успех месте. - Тепло 9 мл гидроксиэтил агарозном геле обработки в 15 мл коническую пробирку в микроволновой печи при 30% мощности в течение 10 сек с шагом, пока гель не полностью плавится.
- Смешайте растопленное обработки геля и раствора красителя BSA в одном 15 мл коническую пробирку и тщательно перемешать с помощью пипетки. Vortex решение.
- Поместите коническую трубку в холодильнике в течение нескольких часов или до твердого продукта.
- Используйте длинный, тонкий, металлический шпатель или зонд, чтобы стравить гель вилку цветной с конической трубе.
- Используйте скальпель или лезвие, чтобы у.е.т гель подключить в поперечном направлении в 5 мм толщиной секций. Снимите закругленные концы и распоряжаться, как отходов (рис 2А).
- Поместите гель подключаемые разделы плоские в гистологии кассеты и удерживайте в 70% этаноле в течение 1 часа. Изменение 70% -ным раствором этанола каждые 2-4 ч в течение по крайней мере 3 изменений за период 24 ч.
- Вручную обработать участки гель через серию этанола (1 час каждого: 70% этанола, 80% этанола, 95% этанола, 100% этанола (изменения 3x), то ясно, при очистке раствора 3 раза в течение 1 часа каждый (например, алифатические углеводороды ( ксилолы заменой)) были использованы в данном протоколе, ксилолы также приемлемы), и проникнуть с расплавленным парафином (3x в течение 1 часа каждый), либо вручную, либо в ткани processer.
Примечание: До полного обезвоживания в 100% этаноле, краситель может вытекать из пробки геля, которые могли бы повлиять на другие ткани и жидкие реагенты в автоматическом процессора ткани. Таким образом, руководство регидратации настоятельно рекомендуется, однако автоматизированной обработки фассоюзник эффективным. - Код для вставки нескольких разделов обработанные гелем, используя стандартный парафин методологии (рис 2b). Разрешить блоки для охлаждения и затвердеть, а затем до комнатной температуры.
- Используйте кожной удар иглы нужного размера, чтобы удалить месте ядра из срезов геля до блока не исчерпывается (рис 2С). Один блок может обеспечить до 20 х 2 мм 2 ядра. Хранить сердечники в прохладном месте. Используйте кожных удар в этом протоколе см рисунки, 1,5 мм (рис 1D, 2D и) или 2 мм (рис 1B, 1C, 2C и).
2. Использование пятна Ориент Номера выстроены блоков
- Создать ориентации ткани схему, чтобы указать желаемые места и личности всех отдельных частей ткани, чтобы быть встроенными вместе, и расположение пятна.
ПРИМЕЧАНИЕ: схема ориентации ткани показано на карте, которая включает рhysical расположение всех частей тканей помеченных идентификаторов и расположения месте. Она может быть создана в электронном виде или может быть рисованной. Схема должна быть создана при помощи любой метод лучше всего подходит техник и исследователь, используя конечный продукт. Эта карта будет служить в качестве руководства для исследователя, так образцы могут быть легко определены в ходе микроскопического анализа. Карта используется в данном протоколе была нарисована. Она изображает блок ткани и стекла микроскопа с каждой части ткани и месте проведенной и надписью в том же положении, как фактического блока тканей и горкой. - Обработайте кусочки ткани, обычно, гарантируя, что они остаются правильно определены на протяжении кассовым и обработки шагов. Для этого протокола, обрабатывать ткани в течение 1 часа каждый: 70% этанолом, 80% этанолом, 95% этанолом, 100% этанола (изменения x3), алифатические углеводороды (ксилолы) (заменители изменения x3), и расплавленный парафин ткани инфильтрации на 60 ° C (изменения x3).
ПРИМЕЧАНИЕ:LL ткани должны быть обработаны следующие лабораторных процедур стандарт гистологии. Это может быть из-за переменной в конкретной лаборатории процедуры, размер ткани и типа, но это не повлияет на возможность использовать месте в качестве инструмента ориентации. - Упорядочить кусочки ткани на вложения станции в правильных местах, назначенных в соответствии со схемой ориентации ткани. Используйте схему ориентации ткани в качестве эталона для руководства специалиста о том, как организовать месте и кусочки ткани в каждом блоке.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе встраивания техник поставить рисованной ориентации карты рядом с вложением станции и расположены тканевые части на вложения станции точно так же, как организации обращается на диаграмме. Это гарантирует, что все кусочки ткани остаются правильно идентифицировать в конечном продукте. Это абсолютно решающее значение для успешного использования мульти-ткани блоков. - Убедитесь, ядро пятно выше все кусочки ткани, чтобы быть встроен в блок,
- Вставить куски ткани, а затем пятно на конце (поперечных) в нужных местах в зависимости от ориентации ткани схеме, используя стандартную методику вложенности. При необходимости, провести месте (ы) вертикально щипцами, пока парафин не затвердеет настолько, что пятна (ы) не упадет (1-2 мин).
- Раздел и пятно парафиновые срезы с поверхности с помощью стандартной методики.
- Разрешить секции плавать на водяной бане при 40 ° С и приклеена к положительно заряженной стекло (незаряженные скользит не были протестированы). Сушат слайдов в сушильном шкафу при температуре 60 ° С в течение по меньшей мере 20 мин.
- Поместите слайды в автоматическом ситечко и обработан следующими реагентами: ксилолы (ксилолы 1-5 мин, ксилолы 2 и 3-2 мин, каждый), 100% -ного этанола (2 мин), 95% этанол (1 мин), 80 % этанола (30 сек), 70% -ный этанол (30 сек), проточной водопроводной водой (2 мин), гематоксилином (1,5 мин), проточной водопроводной водой (3 мин), кислоты спиртом (1 мин), проточной водопроводной водой (2 мин ), блuing реагент (1 мин), вода (2 мин), 80% -ный этанол (30 сек), эозином (1 мин), вода (10 сек), 80% этанол (1 мин), 100% -ного этанола (3 изменения, 2 мин каждый), ксилолы (3 изменения, 30 сек каждый).
- Обложка слайды с покровные стекла, смонтированных с монтажной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, histotechnician срезы парафиновых блоков на микротоме в 5 мкм разделов. Для этого протокола мы использовали автоматический Стайнер, однако равные результаты могут быть получены с помощью ручного окрашивания.
3. место в ТМА (Руководство Комплект ТМА)
- Создать схему ориентации ткани, как описано в 2.1 и назначить нужное место (ы) пятна.
- Заполните форму TMA с расплавленным парафином на вложения станции. Как форма охлаждения, вставлять месте (ы) на конце в кулуарах формы ТМА в нужных местах, указанных на диаграмме ориентации ткани. При необходимости, удерживать месте (ы) в вертикальном положении до тех пор, щипцами парафина гас затвердевает настолько, что пятна (ы) не упадет (1-2 мин).
- Соберите ядер TMA в соответствии с указаниями изготовителя и с учетом расположения пятна (ы) в массиве маржи (рис 2D) и следуйте стандартные секционирования и окрашивания протоколы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь шаг 2,6, чтобы увидеть секционирования и окрашивания методы, используемые в настоящем протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пятно появляется как раунд, яркие точка в парафиновый блок (рис 1А и 2D), во всех парафиновых срезах, и остается на стекле через процедуры Н & Е или IHC окрашивания (рис 1B - 1D, 2D и). Это очевидные визуальные средства кий оба histotechnician и исследователь в идентификации каждого отдельного кусочек ткани и упрощает коммуникацию как histotechnician можете использовать этот визуальный сигнал, чтобы указать расположение тканевых частей к исследователю сбора данных с горкой под микроскопом. Диаграмма ориентации ткани должны быть включены со слайдами, предусмотренных для исследователя и подробно, так что не будет никакой путаницы во микроскопического анализа. 2А показывает результаты срезов затвердевшей, цветные агарозном пробки геля. 2В показан результат встраивания срезы агарозы плагин гельс в парафиновый блок. фиг.2С показаны результаты с использованием кожных удар для получения ядер месте.
Рисунок 1: Точечная сердечники легко созданы и легко виден в тканевых блоков и слайдов (A) пятна отчетливо видны во встроенном блоке.. (B) пятна позволяют легко ориентации и идентификации ткани для мульти-ткани блоков, содержащих подобные появляющиеся тканей из разных групп лиц / лечения. (C) пятна позволит каждому ядро тканей Microarray быть использованы для образцов ценных тканей. (D), Микроскоп вид пятна рядом с ядром ТМА. Стрелки указывают на месте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 
Рисунок 2:. Подготовка ядер месте () Затвердевший гидроксиэтил агарозные пробки освобождаются от пробирки Эппендорф и сократить в поперечном направлении в 5 ломтиков мм. (B) несколько ломтиков встроены в единый блок парафина и (С) кожных удар используется для удаления пятен сердечников. (D) пятна встроены в кулуарах ткани Microarray. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешное подготовка и использование пятен требует тщательного соблюдения нескольких технических этапов. Таяние гидроксиэтил агарозы должно быть сделано медленно и на слабом огне. Быстро плавления при высокой температуре может привести к какой-либо аварии агарозы для менее оптимальных результатов. При резке красителей Ладена пробки на на куски для обработки, убедитесь, что толщина каждого куска больше 4,5 мм и не превышает 7 мм. Закругленные концы удалены как отходы, поскольку они не равномерно 5 мм в толщину. Шт меньше, чем 5 мм приведет к созданию более коротких видит, что рискуете исчерпаны секционирования до исчерпания прилегающих материала ткани. Для обеспечения месте присутствует через полностью блока, кусочки должны быть, по крайней мере 4,5-5 мм. Чтобы обеспечить надлежащее проникновение воска, однако, части не должна превышать 7 мм. При дегидратации кусочки краситель для воска инфильтрации, краска будет вымываться немного из частей в ЛоуR концентрации этанола. Выщелачивание не влияет на конечный продукт, пятна будут по-прежнему интенсивно окрашенных и четко видны. Выщелачивание может повлиять на другие ткани, хотя, так что срезы ткани не должны быть обработаны в тех же ваннах в части красителя до кусков достигли 100% этанола.
При размещении видит в выстроенных блоков, убедитесь, что все другие размещение ткани полный перед добавлением месте. С пятно проникли парафином, расплавленный воск блока получателя может начать таять ядро месте, если это разрешено сидеть слишком долго. Организовать все кусочки ткани сначала добавьте ядро месте и немедленно передать блок в холодной пластины для предотвращения любой таяние месте.
Пятно может быть изменен, чтобы соответствовать в большинстве гистология лабораторных рабочих процессов. Цвет красителя может быть изменен для оптимального контраста в каждом приложении. Красный или черный краситель производит четкое высокую контрастность IHC окрашенных слайдов, жотя красное пятно не так глаз ловить в Н & Е окрашенных слайд выстроенных секций в почках. Для H & E слайды, зеленые или желтые пятна, как правило, обеспечивают более высокую контрастность. Кроме того, при высокой температуре в течение процессов, таких как нагрев, вызывающий поиска антигена для иммуногистохимии, гидроксиэтил агарозном тает. БСА добавляется краситель во время подготовки месте, чтобы сохранить яркие пятна на слайде, даже после высокой тепловой методов извлечения. Если слайды не будут подвергаться воздействию высоких температур, БСА может быть опущен для быстрого производства месте.
Наиболее критические аспекты использования спотовых в создании и поддержании четкой и лаконичной карте ориентации и верного присоединения к карте при размещении месте. При правильном использовании, уменьшает путаницу месте на расположении ткани и упрощает связь между техниками и исследователями, как вложения техник может просто указать расположение пятна и отношение к TissuES к нему на карте. Пятно четко видно на всех этапах подготовки слайд, обеспечивая высокую последовательной разделе монтажа на слайдах для облегчения последующей анализа. В отличие от физиологических маркеров, пятна отчетливо видны в каждой секции и не изменяет ткани в любом виде, предотвращая введение артефактов или обструкции морфологии. В отличие от метода встраивания тканей асимметрично, месте позволяет техников и исследователей гибкость в расположении тканей для оптимизации визуального анализа под микроскопом. В ТМА, пятно может быть помещен за пределами главного массива, устраняя необходимость в пустых пространствах, асимметричных узлов, или ядер маяка, позволяя весь массив будет состоять из разделов ценных тканей. Месте также может быть использован, чтобы указать, анатомическое направление (например, дистальный или проксимальный) образцов ткани. Пятно простое и дешевое решение для быстрого и последовательного ориентации образцов тканей во время строительства, а такженализ мульти-ткани блоков и ТМА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Brent Харрис для обеспечения критический обзор рукописи. Эти исследования были проведены в Lombardi всеобъемлющем онкологический центр Гистопатология & Tissue общей ресурс, который поддерживается частично NIH / NCI грант P30-CA051008. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института рака, Национального института здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histogel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
References
- Jawhar, N. Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).
- Dhir, R.
- Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).
- Saxena, R., Bade, S. Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance. Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , Available from: http://www.dako.com/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf (2013).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).
- Rangel, C. The tissue microarray: helpful hints. J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).
- Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology. Vet. Path. 44, 196-203 (2007).
- Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. Tissue microarrays: one size does not fit all. Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).
- Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast. Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).
- Wampfler, J., et al. Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer. J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).
- Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA). Microarray. 3, 91-102 (2014).
- Miettinen, M. A simple method for generating multitissue blocks without special equipment. Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).
- Jones, M., Calabresdi, P. Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing. BioTechniques. 42, 569-570 (2007).
- Carson, F., Hladik, C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , 3rd ed, American Society for Clinical Pathology Press. Chicago, IL. (2009).
- Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , 7th ed, Churchill Livingstone Elsevier Ltd. London, UK. (2013).
