Introduction
Gzmsは、CTLおよびNK細胞1の専門リソソームに局在高度に相同性セリンプロテアーゼのファミリーです。これらのキラー細胞の細胞傷害性顆粒はまた、排除2,3宛の標的細胞の認識にGzmsと同時にリリースされる膜破壊するタンパク質PFNとGNLYが含まれています。 （ - G、K、MおよびN GZMA）ヒトにおける5 Gzms（GZMA、B、H、KおよびM）、およびマウスでの10 Gzmsがあります。 GZMAとGZMBは最も豊富で広くヒトおよびマウス1で研究されています。しかし、最近の研究は、細胞死経路、ならびに健康と病気4の他、いわゆるオーファンGzmsによって媒介される追加の生物学的効果を検討し始めています。
PFN 5,6によって標的細胞に送達されたときGzmsの最もよく知られている機能は、GZMAおよびGZMBの、特に哺乳動物細胞におけるプログラム細胞死の誘導です。しかしながら、より最近の研究はまた、PFN 7,8によって独立細胞質ゾルデリバリーの、免疫調節および炎症に計り知れない影響を与えGzmsの細胞外効果を実証しました。 Gzmsの細胞質ゾルのエントリの後に効率的に殺された細胞のスペクトルはまた、最近、細菌9,10、さらには特定の寄生虫11に、哺乳動物細胞から広がりました。これらの最近の発見は、Gzmの研究者のための全く新しい分野を開きました。そのため、コスト効率、高収量哺乳動物発現系は、かなりのもの、将来の研究のための方法を容易にします。
天然ヒト、マウス、ラットGzmsが正常にCTLおよびNK細胞株12-14の顆粒画分から精製されています。しかし、我々の手で、このような精製技術の収量は0.1mg / L未満の細胞培養物（未発表の観察及び12）の範囲内です。また、パーソナルプラグインによる汚染のない単一Gzmのクロマトグラフィー分割R Gzmsおよび/ または顆粒中にも存在するタンパク質は、（未発表データと12,14）に挑戦されています。組換えGzms 16は、酵母、昆虫細胞は17とでさえ、このようなHEK 293 18,19などの哺乳動物細胞において、細菌15で製造しました。のみが哺乳動物発現系は、天然の細胞毒性タンパク質と同じ翻訳後修飾を有する組換え酵素を産生する可能性を負います。翻訳後修飾は、エンドサイトーシスによる特異的な取り込みおよび標的細胞20-22内のプロテアーゼの細胞内局在に関与しています。したがって、Gzm発現のためのプラスミド骨格としてpHLsec 23（ラドゥAricescuとイヴォンヌ·ジョーンズの寄贈、オックスフォード、英国の大学）を使用することにより、我々は、高収量のタンパク質産生のための簡単な、時間とコスト効率の高いシステムを構築しましたHEK293T細胞。 pHLsecは、ニワトリΒアクチンプロモーターとCMVエンハンサーを組み合わせました。一緒に、これらの要素はdemonstraテッド種々の細胞株24最強のプロモーター活性。また、プラスミドは、ウサギΒグロビンイントロン、最適化されたKozakおよび分泌シグナル、Lysの-の6xHisタグおよびポリAシグナルが含まれています。インサートは分泌シグナル、適切なN末端 ドメインを欠くタンパク質の最適な発現および分泌の効率を確保するのLys-の6xHisタグ（ 図1）との間で簡便にクローニングすることができます。 EK処理が分泌Gzmsを活性化（アクティブGzmsは、N末端で始まるようにGzmsの発現のために、我々は、エンテロキナーゼ（EK）のサイト（DDDDK）、続いて、ベクターが提供する分泌シグナルと内因性の分泌シグナル配列を置換しアミノ酸配列IIGG 25）。さらに、この方法のために有利なように、HEK293T細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、低価格媒体中で急速に成長し、コスト効率の高いカルシウムリン酸トランスフェクション法に適しています。
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Protocol
発現プラスミドpHLsec-Gzm 1.生産
- 適切なRNA単離法を用いて、ヒトNK細胞（一次細胞は、すべての5人のGzmsを発現するNK-92 26またはNK細胞株のように調製した）からの総RNAを調製し、第一鎖cDNAを合成しキットを用いての逆転写反応、manufacturer`以下の提言。 23（ラドゥAricescuとイヴォンヌ·ジョーンズの種類のギフト、オックスフォード、英国の大学）に記載されているように（ 図1）をAgeI及びKpnI部位を使用してpHLsecにPCRおよびクローンを使用してGzm cDNAを増幅。
注： 表1に示し、以下のプライマーを使用してください。 - 配列決定によって正しい挿入を確認してください。 DH5α細胞中で発現プラスミドを展開し、エンドトキシンフリープラスミド単離キットを用いて精製し、製造者の指示に従ってください。
- を2mg / mlの濃度でエンドトキシンフリー滅菌水で精製したプラスミドを再懸濁し、店で-20°C untiL使用。
HEK293T細胞におけるGzmsの2式
- 試薬の調製
- 標準的な培養培地を準備します。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含有する高グルコース（25ミリモル）、グルタマックス（4ミリモル）に、ピルビン酸ナトリウム（1mM）を（標準のウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシンの10％を加えます100μg/ mlの）。
- トランスフェクション培地を準備します。ペニシリン - ストレプトマイシンを含まない培地に25 / mlのクロロキン（-20℃で保存し、PBSで1,000倍の株式、からトランスフェクションの日に、新たに追加）を追加します。
- 無血清培地を準備します。無血清培地にHEK293細胞は、グルタミン（4 mM）の、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mlの）、および2.5mgの/ LのアンホテリシンBを追加するため
- 表2に記載されたソリューションを用意し、使用前に0.45μmのフィルターでフィルター：
- HEK293T細胞を拡大
- 20ミリリットルカルトにHEK293T細胞を成長させます150×25 mm組織培養皿を用いてURE媒体。
- 80％の密集度で分割細胞（1のスプリット比：4、通常3日毎）。細胞が緩く取り付け、それらは機械的に厳密に上下にピペッティングによりトリプシン処理せずに取り外すことができます。
- プレートの細胞は、トランスフェクション前日に、トランスフェクション（播種密度約2×10 5細胞/ ml）の日に60〜70％の集密度を得ました。通常の準備のサイズは20〜25培養皿で構成されています。
- リン酸カルシウムトランスフェクション
- トランスフェクションの1時間前には、20ミリリットルのトランスフェクション培地に標準的な培養培地を変更します。この1時間のインキュベーション工程の終わり近く、10.95ミリリットルののddH 2 0〜50 mlチューブ中2MのCaCl 2の1.55ミリリットル（1チューブ/ 5皿）でプラスミドDNA400μgのを混ぜます。
- トランスフェクションの前に1〜2分、DNA-カルシウム溶液12.5 mlに2×HBS 12.5ミリリットルを加え、チューブの反転により混合し、室温で30秒間インキュベートします。
- 目を追加します。Eの混合物を滴下培地中に、細胞（皿当たり5ミリリットル）に直接2.3.2に用意しました。ややオレンジ色に培地を回し、全領域に均等に振りかけます。
- 組織培養インキュベーター（37℃、加湿空気中5％CO 2）で7から11時間、培養皿をインキュベートします。インキュベーション後、微細な沈殿物が見えます。予め温めておいたPBSで丁寧に洗い流し、トランスフェクション培地を除去し、2.1.3で調製した20ミリリットルの無血清培地を追加します。組織培養インキュベーター中で72時間インキュベートします。
- SDS-PAGE上での細胞の上清のサンプル（〜20μl）を実行し、グランザイムバンドを可視化するために、クマシーブリリアントブルーで染色することにより、トランスフェクション及び発現効率を分析します。
- ニッケルIMACにより培養上清からのGzmsの精製
- インキュベーション後、250ミリリットルチューブに細胞培養上清をデカントし、遠心分離により明確。最初のスピンを行う（400×gで、10分間、4°剥離した細胞からの培地をクリアしますC）。残りの細胞破片を除去し、4℃で4,000×gで、30分で新鮮な250ミリリットルチューブとスピンで上清を転送します。
- 5 M NaClを5mlの、透明な上清の250ミリリットル当たり0.25 MのNiSO 4の6.25 2 M Tris塩基（pHは8）のミリリットルと1ミリリットルを追加します。 500ミリリットル真空フィルターユニット（0.45 mm）を用いて上清をフィルタリングします。
- 適切なFPLCシステムを使用して彼の結合緩衝液A（10カラム体積、CV）とニッケルIMACカラムを平衡化します。
- 4℃で0.5ml /分の流速で平衡化したカラムに透明な上清を適用します。
- 上清を適用した後、UV吸光度がベースラインに達するまで、（通常、10 CV）のHis結合バッファーでカラムを洗浄します。
- 0.5ml /分の流速で20ミリリットルの線形勾配（0~250 mMイミダゾール）で溶出Gzms 2ミリリットル画分を収集しました。 SDS-PAGEおよびクーマシー染色により溶出画分を分析します。
- エンテロキナーゼ（EK）治療および陽イオン交換クロマトグラフィーによる最終クリーンアップ
- ≤10MWCOに透析チューブ内の画分を含むプールGzm。前EK制御などの-20℃での少量のサンプルを保管してください。
- 透析チューブに直接にプール画分に0.02単位/初期上清を50 mlのEKを追加して、O / N EK-バッファーで室温、（少なくとも16時間）（4 L、一度変更バッファ）を透析。
- 次の日、EKは、SDS-PAGEおよびクマシー染色による事前EKコントロールと比較してGzmsを処理し分析します。
- N末端の処理が完了すると、SバッファーA（4 L）に透析緩衝液を変更して、室温でさらに4時間透析します。フィルター透析液（0.45ミクロン）。
- 4℃で0.5ml /分の流速でカラムにサンプルをロードS緩衝液AでS-カラムを平衡化します。
- UV吸光度のベースラインに達するまで、試料ローディングの後、（約10 CV）S緩衝液Aでカラムを洗浄します。 30ミリリットルの直線勾配（150〜1000 mMのNaCl）でGzmsを溶出。 GZMA E〜750mMのNaClで〜700mMのNaClおよびGzmMで〜650のNaCl、GZMBでリュート。
- SDS-PAGEおよび比色アッセイ（下記参照）による溶出画分を分析します。 Gzmsおよび濃縮物を含むプール画分（約30倍、約100μMの濃度に）スピンフィルターで（15ミリリットル、10 MWCO）。 -80℃で濃縮さGzm製剤およびストアを等分。
3.テストGzm活動
- 試薬の調製
- 50mMのトリス塩基、pHは7：比色アッセイ緩衝液を準備します。
- GZMAの測定のために、0.2mMの及び5,5'-ジチオ - ビス（2-ニトロ安息香酸）の最終濃度までアッセイ緩衝液へのNa-CBZ-L-リジンをチオベンジルエステル（S-Bzlの）（BLT）を追加0.22 mMの濃度に（DTNB）。 GZMBについては、0.2 mMののBoc-ALA-ALA-ASP-S-Bzlの（AAD）および0.22 mMのDTNBを含みます。 GzmMについては、0.2 mMのあるSuc-ALA-ALA-PRO-Leuの-p-ニトロアニリド（PNA）（AAPL）が挙げられます。合成ペプチドは、DMSO中で（適切なストック溶液から追加され、STORアッセイの前に、新たにバッファに）-20°Cで編。
- 切断アッセイバッファーを準備します。100mMのNaCl、50mMのトリス塩基、pHは7.5
- 50mMのトリス塩基、pHは7：比色アッセイ緩衝液を準備します。
- 比色アッセイ
- 96ウェル平底プレート中の溶出画分または濃縮されたストックから小さなGzmサンプル（<5μl）を配布します。ポジティブコントロール（試験したGzm製剤または粗製のNK細胞溶解物）および陰性コントロール（緩衝液のみ）も含めます。
- （マルチチャンネルピペットを使用して）各ウエルに、アッセイ緩衝液100μlを加えます。 37℃で10分間インキュベートします。マイクロプレートリーダーで405nmでODを測定します。
- 切断アッセイ
- 精製された基板を使用して切断アッセイのために、タンパク質基質を共インキュベート（天然または組換え、100から400 nMの、効率的なGzm基板のいくつかの例は、このセクションの最後に結果の項でノートに示されている）の連続希釈でGzmの様々な時間のためにアッセイ緩衝液で（400nmで開始します）。SDS-PAGEおよびクーマシーまたは銀染色によって分析します。または特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって。
- 細胞溶解物を使用して切断アッセイのために、37℃で三回でエタノール/ドライアイス浴融解に凍結することによってアッセイ緩衝液と溶解1ml中10 6のHeLa細胞（または任意の利用可能な腫瘍細胞株）をサスペンド。 （4°Cで10分間15,000×gで）を、遠心分離によって細胞破片を除去。
- 上記のように様々な濃度と時間でGzmsでクリアした溶解物を共インキュベートします。切断は、適切な抗体を用いたイムノブロッティングによって検出されます。
注：市販の抗体が利用可能な善意の基板のいくつかの例：GZMB 27,28によって切断入札（BH3相互作用ドメイン死アゴニスト）およびカスパーゼ3; GZMA 29によって切断され、複数の異種核リボ（hnRNPA1、A2およびU）; GzmM 30によるサイトメガロウイルスリンタンパク質71。
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Representative Results
次のセクションでは、この方法を照明するGZMA準備の完全なドキュメントを紹介します。また、正常に精製効率および活性に関して同様の結果を生成する、GZMBとGzmMを精製しました。しかし、それらの後に調製物から、我々は、データの選択したいくつかの作品が表示されます。現在のプロトコルに従って293T細胞からGZMB調製物は、様々な生物学的ア ッセイ系9,29,31-34でそれらの活性を強調し、いくつかの公表された研究に使用しました。
典型的GZMA精製は、図2Aに示されています。 GZMAの下で〜34分の60キロダルトン、72時間は、還元条件下で培養上清GZMBとGzmM用（〜37 kDaでさらに濃縮することなく、クーマシー染色SDS-PAGEゲル上で検出可能Gzmバンドで表示した後の効率的なトランスフェクションおよび発現非還元/）の条件を減らします。 IMAC精製の後、サンプルは、入力を処理しましたokinase（EK）。 EKの可視シフト前EK対照と比較したサンプル（ポストEK）で処理が観察されました。クーマシー染色タンパク質ゲル上の単一バンドの出現と、S-列の最終精製は、高純度のGzm製剤（ 図2BのGZMBとGzmM 図2AのGZMA）をもたらしました。プールした画分は、約100μMの最終濃度まで濃縮しました。一般的に、我々は、100ミリリットルの培養上清あたり約0.5〜1ミリグラムGzmsの収率を得ました。効率的なグリコシル化を実証するために、いくつかの最初の調製物は、N結合型糖タンパク質からの高マンノース型オリゴ糖を除去するエンドグリコシダーゼ（エンド）Hで処理しました。ネイティブGZMAは、高マンノース型オリゴ糖を35に結合されているのAsn-142におけるN結合型グリコシル化部位を有します。遠藤の治療は、明らかなモビリティGzm Aのシフト、並びにGZMBを誘導したHEK293T細胞から調製物が、細菌生成GZMAにSDS-PAGEおよびクマシーで分析しないように染色（ 図2C）。
日常的毎Gzmバッチは比色アッセイにおける酵素活性について試験しました。この迅速かつ信頼性の高いテストをアッセイ緩衝液の色の変化により、分光光度示される小さな合成ペプチドの切断によってGzmsのタンパク質分解活性を示します。原因これらのプロテアーゼが切断する後のアミノ酸残基（P1位置）に関する別の設定に、特定のペプチドの選択はGzmsによって異なります。 GZMAは、塩基性残基のアルギニン（Argで、R）およびリジン（Lysで、K）の後に切断、トリプシン様活性を有します。ロイシン（Leuで、L）およびメチオニン（Metを、M）1の後に優先的にアスパラギン酸残基（ASP、D）後のGZMBを切断し、GzmMを切断。当社の優先的なペプチドの選択はGZMA活性を測定しBLT -S-Bzlのある、GzmMためGZMBとAAPL -pNAためのAAD -S-Bzlの。
thiobの主な違いenzylester基板（AADとBLT）とp-ニトロアニリド基質（AAPL）は、そのGzmで、特定の化学的性質であるthiobenzylester基質の切断のみが発色団のDTNBとその下流の反応で発色反応をトリガーベンジルメルカプタンを放出媒介します。 p-ニトロアニリドのGzm媒介性の放出は比色検出のために十分であるがため、thiobenzylester基板DTNBの反応緩衝液中で、存在しなければなりません。比色アッセイの詳細な方法は、最近出版された36。 図3Aはそれぞれ、GZMAとGzmM準備のSカラムからの溶出画分中の代表BLTとAAPLエステラーゼ活性を示しています。比色アッセイは、ネイティブGZMB製剤に組換えの活性を比較するために使用しました。 図3Bに示されるように、組換え293T GZMB、ヒトNKセルから精製された天然のGZMBと比較して類似の効率で発色基質を開裂Lラインは、最近12として記載しました 。
より具体的にGzm活性を試験するために、既知のタンパク質基質を用いGzm切断アッセイが示されています。これらの切断アッセイは、無傷細胞との細胞溶解物またはほとんどの生理的に、精製組換えまたは天然タンパク質（利用可能な場合）を用いて行うことができます。タンパク質基質が利用可能である場合、タンパク質分解活性は、これは既知の細菌GZMAで実証されており、GZMBはnuoCDとnuoF 9を基板としてGzm製剤による単純な同時インキュベーション実験で分析し、ならびに新規のヒトミトコンドリアGzmM基板NDUFAF3とすることができます（ 図4A）。
細胞溶解物は、複数のGzm基板の別の明らかな供給源を表します。市販の抗体は、基板の多くに対して利用可能です。細胞溶解物を生成するための迅速かつ簡単な方法は、以前に33を示したように、複数の凍結/融解サイクルを適用することによってです。洗剤iの使用彼らはGzm活性を妨害することができるようにお勧めしませんよ。 図4Bに、HeLa細胞溶解物中のhnRNPA1のGZMA媒介切断はローディングコントロールとして抗hnRNPA1抗体、ならびに抗Βアクチン抗体を用いたイムノブロットで実証されています。
無傷の細胞中の切断アッセイ（または細胞傷害性アッセイ）のために、追加の送達分子の利用可能性は、（哺乳動物細胞のため、SLO、PFNまたはストレプトリシンO; GNLYまたは原核細胞のための他の抗菌ペプチド）が必要です。配達分子の濃度が重要であり、大規模な微調整を必要とするように、無傷の細胞内での切断アッセイは、最も困難です。アポトーシスアッセイのこれらの複雑なプロトコルを導入することは、この論文の範囲を超えています。ここでは、単なる例12,13のように、文学の広大な体を参照することができます。
<強い>表1：Gzmクローニングプライマー配列。
GZMA、GZMBとGzmMをクローニングするために使用されたプライマー配列が示されています。フォワードプライマーは、活性プロテアーゼのN末端 前EK部位を導入するように設計した（ 図1参照）
表2：株価ソリューションおよびバッファ組成物。
最も重要なストック溶液及び緩衝液のレシピが表示されています。
図1。コンストラクトのクローニングのための重要なpHLsecシーケンス。
シーケンスでは、ベクター内のいくつかの要素がありますKozakコンセンサスと分泌シグナル配列、をAgeI及びKpnI制限部位、ならびにC末端Lys_6xHisタグ：クローニング、分泌、IMAC精製及びプロテアーゼの活性化のために重要であることを強調しました。我々は、N末端エンテロキナーゼ（EK）のサイトに融合されたインサートとしてGZMAを例示しました。完全なベクターバックボーンの完全なマップのために、我々は23で補足情報を参照してください。
図2。 HEK 293 T細胞からの発現、精製および完全グリコシル化ヒトGzmsの活性化。
A）第一ニッケルIMAC精製、EK処理およびFINAに上清中の分泌から全体GZMA製造プロセスを実証するクーマシー染色、非還元SDS-PAGEゲルのシリーズを示し陽イオン交換クロマトグラフィーを介して研磨L。培養上清（赤）および非還元（非赤）還元条件下でSDS-PAGEにかけました。 GZMAは、ジスルフィド結合によって安定化されたホモ二量体（ssGzmA）です。 GZMAホモダイマー（〜60 kDa）がBSA（〜66 kDaの）の汚染の近くに実行されます。還元条件下ではGZMAモノマー（shGzmA）は〜34 kDaのバンドとして表示されます。非還元条件下で最終GZMB及びGzmM調製物の純度を証明するために、代表的なクーマシー染色ゲルはB.細菌（ 大腸菌 ）に示されているがGZMA同様GZMAとGZMBをHEK293T細胞中で産生さとして遠藤で処理し、分析した生成しましたSDS-PAGEおよびクーマシー染色非還元による。細菌（C）で作製した非グリコシル化GZMAと比較して、HEK293T細胞中で産生さGzmsのグリコシル化は、遠藤処理後の移動度シフトによって示されます。
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図3。組換えGzms加水分解合成ペプチド。
A）、最終的なSカラムからの溶出画分の少量のサンプルを基質として、それぞれ、BLTとAAPLを用いて発色アッセイにおいてGZMAとGzmM活性について試験しました。グラフは、405nmのODの増加として示されたペプチドの切断を示します。 UV吸光度およびSDS-PAGE分析（ 図2AおよびB）に示されるように、溶出中のタンパク質ピークと相関活動ピーク画分。 B）示された濃度で、組換え293Tおよび天然GZMB（12記載のように調製）を発色基質AADの存在下でインキュベートしました。 GZMB活性は、405 nmでのODの変化として示されました。グラフは三連で試験した当社の最新のGzm製剤の平均±SEMを示します。
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4.組換えGzms薙ぎ払いタンパク質基質図。
A）組換えGSTタグ化、細菌の呼吸鎖タンパク質nuoCDとnuoF、ならびに哺乳動物の呼吸鎖タンパク質NDUFAF3は、37℃で15分間、示さGzmsの指示濃度で処理しました。 20μlの反応における精製されたタンパク質の1μgのを用いました。切断は、SDS-PAGEおよびクーマシー染色により分析しました。 B）〜1mg / mlのタンパク質濃度で、HeLa細胞溶解物は、（）で30分間、組換えGZMAの指示濃度でインキュベートし、抗hnRNPA1とΒアクチン抗体を用いたイムノブロッティングによって分析しました。
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Discussion
GZMAとGZMBの古典と広範囲に研究の役割は、孔形成タンパク質PFN 1によるそれらのサイトゾル送達後、哺乳動物細胞におけるアポトーシスの誘導です。最近、Gzmsの細胞傷害性スペクトルは、細菌9,10、ならびに特定の寄生虫11に、哺乳動物細胞から大幅に広がりました。また、GZMAとGZMBの非古典的、細胞外の機能だけでなく、様々な孤児Gzmsの生物学的意義は依然として不明瞭です。したがって、Gzmsの堅牢時間とコスト効率の高い発現および精製システムは、このプロトコルによって提供されるよう、これらの将来の研究のための大きな助けとなります。
この方法の強みは、特に、このシステムで使用される発現ベクターpHLsec 23に基づいています。このプラスミドは、 大腸菌における高コピー数を有しています大腸菌は 、効率的なDNAの生産を可能にします。そのエンハンサー/プロモーターエレメントが提供します種々の細胞株24で最も強い活性を示します。これは、転写単位内のイントロンを含みます。イントロンは、最大100倍の37に、哺乳動物細胞における遺伝子発現を増強することが見出されています。また、プラスミドは、Kozakコンセンサスと最適化された分泌シグナル、Lysの-の6xHisタグおよびポリAシグナル（ 図1）を提供します。インサートは、分泌シグナルおよびLys-の6xHisタグとの間のAgeI及びKpnI部位を使用してクローニングすることができます。をAgeIおよびXhoIを使用すると、ポリHisタグを避けることができます。 Gzmsためには、発現及びIMAC精製後にプロテアーゼの活性化を可能にするプロテアーゼのN末端にエンテロキナーゼ部位を挿入する必要がありました。他の酵素の発現のためにこれは必要ないかもしれません。発現プラスミドは、正常複数様々な長さ、グリコシル化状態、及びジスルフィド結合の数の構築、ならびに異なる折り目23を複数のドメインに含まれるタンパク質のために試験しました。
38クロロキンを加えます。我々は、トランスフェクション効率は、15 cmディッシュ（未発表の観察）のために、わずか約80μgので飽和DNA量の直線的に依存していたことがわかりました。そこで、最大効率のために、このプロトコルでは、プラスミドDNA /皿の80μgの最大使用することをお勧めします。これはcorrespondin（準備あたりのDNAの約2mgに達するだろう2マキシプレップカラムにg）を得ました。トランスフェクション効率は、最も容易に72時間のインキュベーション期間後にSDS-PAGE上で培養上清（約20μL）のサンプルを実行することによってモニターしました。分泌されたプロテアーゼのタンパク質バンドはクーマシー染色によって可視でなければなりません。 Gzmバンドが弱く、細胞が生存を切り離し、現れなかった場合、培養物は、IMAC精製の前にさらに24時間インキュベートしました。
別の最も重要なステップは、酵素を活性化するエンテロキナーゼ（EK）の治療でした。 EK活性は、カルシウム依存性であり、NaClの39またはイミダゾール（未発表の観察）の高濃度によって阻害されます。したがって、中性pHで十分にカルシウムと塩化ナトリウムのない50mm以下を含むEK緩衝液の十分な体積（透析緩衝液の2リットルあたり20mLの溶出液）に対するIMACからの溶出液を透析することが重要でした。 EK処理は室温で16時間のために推奨されており、移動度シフトOを明らかにしたSDS-PAGEによって監視されるべきです切断が完了した場合に処理されたプロテアーゼ、F。新鮮なEKを添加し、シフトが不完全であった場合は、新鮮な透析EK緩衝液中でインキュベーションを続けました。切断が完了した場合にのみ、S緩衝液Aに対して透析を開始し、精製を続けました。 EKの触媒軽鎖は、最終的な陽イオン交換クロマトグラフィーでGzms EKからの完全な分離を可能にする、5.2のpI値を有しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
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