Introduction
De Gzms er en familie av høyt homologe serinproteaser lokalisert i spesialiserte lysosomene til CTL og NK-celler 1. De cytotoksiske granulater av disse killer celler inneholder også membranforstyrrende proteiner pFN og GNLY som er utgitt samtidig med Gzms på anerkjennelse av et mål celle bestemt for eliminering 2,3. Det er fem Gzms hos mennesker (GzmA, B, H, K og M), og 10 Gzms i mus (GzmA - G, K, M og N). GzmA og GzmB er den mest tallrike og omfattende studert hos mennesker og mus 1. Imidlertid har nyere studier begynt å undersøke celledødsveier samt flere biologiske effekter mediert av de andre, såkalte foreldreløse Gzms i helse og sykdom fire.
Den best kjente funksjon av Gzms, spesielt av GzmA og GzmB, er induksjon av programmert celledød i pattedyrceller når den leveres inn i målceller ved PFN 5,6. MenFlere nyere studier også vist effekten av de ekstracellulære Gzms med betydelig innflytelse på immunregulering og betennelse, uavhengig av cytosolisk levering av PFN 7,8. Spekteret av celler som er drept effektivt etter cytosolic oppføring av Gzms ble også nylig utvidet fra pattedyrceller til bakterier 9,10 og selv enkelte parasitter 11. Disse siste funn åpnet opp et helt nytt felt for Gzm forskere. Derfor vil en kostnadseffektiv, high-yield pattedyrekspresjonsvektor system vesentlig lette veien for de fremtidige studier.
Native menneske, mus og rotte Gzms har blitt renset fra granulatfraksjon av CTL og NK-cellelinjer 12-14. Men i våre hender utbyttet av slike renseteknikker er i området fra mindre enn 0,1 mg / l cellekultur (upublisert observasjon og 12). Videre er den kromatografiske oppløsning av et enkelt Gzm uten forurensning av other Gzms og / eller proteiner som også er til stede i granulene er utfordrende (upubliserte data og 12,14). Rekombinante Gzms ble produsert i bakterier, gjær 15 16, insektceller 17, og i og med i pattedyrceller som for eksempel HEK 293 18,19. Bare de pattedyrekspresjonssystemer bære potensial til å produsere rekombinante enzymer med posttranslational modifikasjoner som er identiske med det native cytotoksiske protein. Posttranslasjonelle modifikasjoner har vært implisert med det spesifikke opptak av endocytose og intracellulær lokalisering av protease innenfor målcellene 20-22. Derfor, ved hjelp pHLsec 23 (en slags gave av Radu Aricescu og Yvonne Jones, University of Oxford, UK) som plasmid ryggrad for Gzm uttrykk, vi etablert en enkel, tids- og kostnadseffektivt system for high-yield proteinproduksjon i HEK293T celler. pHLsec kombinerer en CMV forsterker sammen med en kylling Β-aktin promoter; sammen, disse elementene demonstrated den sterkeste promoter aktivitet i ulike cellelinjer 24. I tillegg inneholder plasmidet et kanin Β-globin intron, den optimaliserte Kozak og sekresjon signaler, et Lys-6xHis-tag og en poly-A-signalet. Innsatser kan klones hensiktsmessig mellom-sekresjonssignal, og Lys-6xHis-tag (figur 1) å sikre optimal ekspresjon og sekresjon effektivitet for proteiner som mangler egnede N-terminale domener. For ekspresjon av de Gzms, erstattet vi den endogene sekresjon-signalsekvensen med utskillelsen signal gitt av vektoren, etterfulgt av et enterokinase (EK) område (DDDDK), slik at EK behandling aktivert utskilte Gzms (aktive Gzms starte med den N-terminale aminosyresekvens IlgG 25). I tillegg til fordel for denne metoden, HEK293T celler vokser raskt i lavt priset medium, slik som Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), og er godt egnet for kostnadseffektiv kalsiumfosfat transfeksjon metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av ekspresjonsplasmidet pHLsec-Gzm
- Forbered total RNA fra menneske NK-celler (primærceller fremstilt som i 26 eller NK cellelinje NK-92 uttrykker alle de fem menneskelige Gzms) med en egnet RNA isolering metode og reversere transkriberer ved hjelp av en første-cDNA syntetisere kit, etter manufacturer` anbefalinger. Forsterke Gzm cDNA ved hjelp av PCR og klone inn pHLsec som beskrevet i 23 (slags gave Radu Aricescu og Yvonne Jones, University of Oxford, UK) ved hjelp av AgeI og KpnI områder (figur 1).
MERK: Bruk følgende primere angitt i tabell 1. - Bekreft riktige innsatser ved sekvensering. Utvid ekspresjonsplasmidene i DH5a celler og rense ved hjelp av en endotoksin-free plasmid isolasjon kit og følg produsentens anvisninger.
- Resuspender de rensede plasmider i endotoksin-fritt, sterilt vann ved en konsentrasjon på 2 mg / ml og oppbevares ved -20 ° C men kostnadenl bruk.
2. Expression of Gzms i HEK293T celler
- Fremstilling av reagenser
- Forbered standard dyrkingsmedium. For å Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) inneholdende høy glukose (25 mM), Glutamax (4 mM), natriumpyruvat (1 mM) tilsettes 10% av standard føtalt kalveserum (FCS), penicillin (100 enheter / ml), streptomycin ( 100 ug / ml).
- Forbered transfeksjon medium. Til kulturmedium uten penicillin-streptomycin legge 25 mikrogram / ml klorokin (legg fersk på dagen for transfeksjon fra 1,000x aksjer i PBS, lagret ved -20 ° C).
- Forbered serumfritt kulturmedium: serumfritt medium for HEK293-celler legge glutamin (4 mM), penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 ug / ml), og 2,5 mg / L amfotericin B.
- Klargjør løsningene som er beskrevet i tabell 2 og filteret med en 0,45 um filter før bruk:
- Utvide HEK293T celler
- Grow HEK293T celler i 20 ml kulture medium med 150 x 25 mm vevskulturskåler.
- Split celler på 80% confluency (split-forholdet 1: 4, vanligvis hver 3. dag). Celler løst feste, de kan være mekanisk frittliggende uten trypsinization ved strengt pipettering opp og ned.
- Plate celler natten før transfeksjon for å gi 60-70% konfluens på dagen for transfeksjon (seeding tetthet ~ 2 x 10 5 celler / ml). En vanlig størrelse preparatet består av 20 til 25 kulturskåler.
- Kalsium-fosfat transfeksjon
- 1 time før transfeksjon, endre standard kulturmedium til 20 ml medium transfeksjon. Nær slutten av denne 1 timers inkubasjon trinn, blande 400 ug av plasmid-DNA med 10,95 ml DDH 2 0 og 1,55 ml 2M CaCl 2 i 50 ml rør (en tube / 5 retter).
- 1 til 2 min før transfeksjon, tilsett 12,5 ml 2 x HBS til 12,5 ml av DNA-kalsiumoppløsningen blandes ved inversjon av rørene og inkuber i 30 sekunder ved romtemperatur.
- Legg the blanding utarbeidet i 2.3.2 direkte til cellene (5 ml per parabol), dråpevis inn i mediet. Strø jevnt over hele området, dreie medium til et svakt orange farge.
- Inkuber kulturskåler for 7 til 11 timer i en vevskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2 i fuktig luft). Etter inkubasjonen, er et fint bunnfall synlig. Fjern transfeksjon medium, skylles omhyggelig med en forvarmet PBS og tilsett 20 ml serum-fritt kulturmedium fremstilt i 2.1.3. Inkuber i 72 timer i en vevskulturinkubator.
- Analyser transfeksjon og ekspresjon effektivitet ved å kjøre en prøve (~ 20 mL) i cellesupernatanten på SDS-PAGE og farging med Coomassie Brilliant Blue for å visualisere et granzyme band.
- Rensing av Gzms fra kultursupernatant av Nickel-IMAC
- Etter inkubering dekanteres cellekultursupernatanter inn i 250 ml rør og klar ved sentrifugering. Gjennomføre en første spinn (400 xg, 10 min, 4 °C) som vil fjerne mediet fra frittliggende celler. Overfør supernatanten i friske 250 ml rør og sentrifugering ved 4000 xg, 30 min ved 4 ° C for å fjerne eventuelle gjenværende cellerester.
- Tilsett 5 ml av 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-base (pH 8), og 1 ml av 0,25 M NISO 4 per 250 ml av supernatanten fjernet. Filtrer supernatanten ved bruk av en 500 ml vakuum filterenhet (0,45 mm).
- Stabil en nikkel IMAC-kolonne med His-bindende buffer A (10 kolonnevolumer, CV) ved hjelp av et passende FPLC-system.
- Påfør fjernet supernatanten til den ekvilibrerte kolonnen med en strømningshastighet på 0,5 ml / min ved 4 ° C.
- Etter at supernatanten ble påført, vaskes kolonnen med His-bindende buffer inntil UV-absorbans-grunnlinje er nådd (vanligvis 10 CV).
- Elueres Gzms med en lineær 20 ml-gradient (0-250 mM imidazol) ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min mens samle 2 ml-fraksjoner. Analyser elueringsprofiler fraksjoner ved SDS-PAGE og Coomassie-farging.
- Enterokinase (EK)behandling og vasking opp ved kationebytterkromatografi
- Pool Gzm fraksjoner i en dialyse tube med ≤10 MWCO. Lagre en liten prøve ved -20 ° C som pre-EK kontroll.
- Legg EK ved 0,02 enheter / 50 ml opprinnelige supernatant direkte til den sammenslåtte fraksjon i dialyserøret og dialyser O / N (minst 16 timer) ved romtemperatur i EK-buffer (4 L, endre buffer gang).
- Den neste dag, analysere EK behandlet Gzms i forhold til pre-EK kontroll ved SDS-PAGE og Coomassie-farging.
- Når N-terminal behandlingen er ferdig, endrer dialysebuffer til S buffer A (4 L) og dialyser for ytterligere 4 timer ved RT. Filter dialyse (0,45).
- Stabil en S-S-kolonne med buffer A. Legge prøven på kolonnen med en strømningshastighet på 0,5 ml / min ved 4 ° C.
- Etter prøve-lasting, vaske kolonnen med S buffer A inntil UV-absorbans-grunnlinje er nådd (ca. 10 CV). Eluer Gzms med en 30 ml lineær gradient (150 til 1000 mM NaCl). GzmA elutes på ~ 650 mM NaCl, GzmB på ~ 700 mM NaCl og GzmM på ~ 750 mM NaCl.
- Analyser eluering fraksjoner ved SDS-PAGE og kolorimetriske analyser (se nedenfor). Pool fraksjoner inneholdende Gzms og konsentrat (ca. 30-ganger, til en konsentrasjon på 100 uM) i ring filtre (15 ml, 10 MWCO). Delmengde de konsentrerte Gzm forberedelser og oppbevares ved -80 ° C.
3. Testing Gzm aktivitet
- Fremstilling av reagenser
- Forbered kolorimetrisk assay-buffer: 50 mM Tris-base, pH 7.
- For måling av GzmA, tilsett Na-CBZ-L-lysin tiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) i analysebuffer til en endelig konsentrasjon på 0,2 mM og 5,5'-ditio-bis (2-nitrobenzosyre) (DTNB) til en konsentrasjon på 0,22 mM. For GzmB, omfatter 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) og 0,22 mM DTNB. For GzmM, omfatter 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL). Syntetiske peptider er tilsatt fra aktuelle stamløsninger (i DMSO, stored ved -20 ° C) til bufferen ferskt før analysen.
- Forbered spaltning forsøks-buffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-base, pH 7,5
- Forbered kolorimetrisk assay-buffer: 50 mM Tris-base, pH 7.
- Kolorimetriske analyser
- Fordel små Gzm prøver (<5 pl) fra elueringsfraksjonene eller konsentrert aksjer i 96-brønners flatbunnede plater. Omfatte en positiv kontroll (testet Gzm preparater eller råolje NK-cellelysatene) og en negativ kontroll (buffer only).
- Tilsett 100 ul analysebuffer til hver brønn (med en flerkanals pipette). Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C. Måle OD ved 405 nm i en mikroplateleser.
- Cleavage assay
- For cleavage analyser ved hjelp av rene underlag, co-ruge en proteinsubstrat (native eller rekombinant, 100-400 nM; noen eksempler på effektive Gzm substrater er presentert i resultatdelen og i noten på slutten av dette avsnittet) med seriefortynninger av en Gzm (som starter ved 400 nM) i analysebuffer til ulike tider.Analyser av SDS-PAGE og Coomassie eller sølv flekker; eller ved western blotting ved hjelp av spesifikke antistoffer.
- For spaltningsseter analyser ved anvendelse av cellelysatene, suspendere 10 6. HeLa-celler (eller hvilken som helst tilgjengelig tumorcellelinje) i 1 ml forsøksbuffer og lyse ved frysing i et etanol / tørris-bad og tining ved 37 ° C tre ganger. Fjerne cellerester ved sentrifugering (15 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C).
- Co-inkuber klarede lysat med Gzms ved forskjellige konsentrasjoner og tider som ovenfor. Spalting detekteres ved immunoblotting ved anvendelse av passende antistoffer.
MERK: Noen få eksempler på bona fide substrater som kommersielle antistoffer er tilgjengelige: Bud (BH3-samspill domene død agonist) og caspase 3 spaltes av GzmB 27,28; flere heterogene atom ribonucleoproteins (hnRNPA1, A2 og U) spaltes ved GzmA 29; cytomegalovirus fosfoprotein 71 av GzmM 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det følgende avsnittet vil vi presentere en komplett dokumentasjon av en GzmA forberedelse til å belyse metoden. Vi har også med hell renset GzmB og GzmM, produsere lignende resultater i forhold til renseeffekt og aktivitet. Men fra de senere forberedelsene vi vil bare vise noen få utvalgte stykker av data. GzmB preparater fra 293T celler etter gjeldende protokollen ble brukt i flere publiserte studier, fremhever sin aktivitet i ulike biologiske analysesystemer 9,29,31-34.
En typisk GzmA rensing er vist i figur 2A. Effektiv transfeksjon og uttrykk etter 72 timer ble angitt av en påvisbar Gzm band på en Coomassie-farget SDS-PAGE gel uten ytterligere konsentrasjon av kultursupernatanten (~ 37 kDa for GzmB og GzmM under reduserende betingelser; ~ 60/34 kDa for GzmA henhold ikke-reduserende / reduserende betingelser). Etter IMAC-rensing ble prøvene behandlet med skrivokinase (EK). Et synlig forskyvning av EK behandlede prøve (post-EK) sammenlignet med pre-EK kontroll ble observert. Den endelige rensingen av S-kolonne resulterte i høyrene Gzm preparater (GzmA i figur 2A, og GzmB GzmM i figur 2B) med et enkelt bånd opptreden på Coomassie-fargede geler protein. De sammenslåtte fraksjoner ble konsentrert til en endelig konsentrasjon på ~ 100 pM. Vanligvis vi oppnådd utbytter på omtrent 0,5 til 1 mg pr Gzms 100 ml kultursupernatant. For å demonstrere effektiv glykosylering, ble noen innledende forberedelser behandlet med endoglykosidase (Endo) H, som fjerner høyt mannoseinnhold oligosakkarider fra N-koblede glykoproteiner. Native GzmA har en N-bundet glykosyleringssete i Asn-142, til hvilken et oligosakkarid med høyt mannoseinnhold er bundet 35. EndoH behandling induserte en tydelig mobilitetsskift i Gzm A, så vel som GzmB, preparater fra HEK293T celler, men ikke i bakterielt generert GzmA som analysert ved SDS-PAGE og Coomassiefarging (figur 2C).
Rutinemessig ble det hver Gzm batch testet for enzymatisk aktivitet i kolorimetriske analyser. Denne raske og pålitelig test demonstrerer proteolytisk aktivitet av Gzms ved spalting av små syntetiske peptider som er angitt spektrofotometrisk ved en fargeendring i analysebuffer. På grunn av forskjellige preferanser vedrørende de aminosyrerestene (P1-stilling), hvoretter disse proteasene spalter, varierer valget av et spesifikt peptid blant Gzms. GzmA har trypsin-lignende aktivitet, spalte etter basiske rester arginin (Arg, R) og lysin (Lys, K). GzmB spalter fortrinnsvis etter asparaginsyrerester (Asp, D), og GzmM spalter etter leucin (Leu, L) og metionin (Met, M) 1. Vår fortrinnsrett peptid valget er BLT -S-Bzl å måle GzmA aktivitet, AAD -S-Bzl for GzmB og AAPL -pNA for GzmM.
Den store forskjellen mellom thiobenzylester substrater (AAD og BLT) og p-nitroanilid-substrat (AAPL) er den spesifikke kjemi, ved at Gzm medierer spaltingen av thiobenzylester substrater frigjør benzyl-merkaptan, som bare utløser en kromogen reaksjon i sin nedstrøms reaksjon med DTNB kromofor. Derfor, i reaksjons buffere thiobenzylester substrater DTNB må være til stede, mens den Gzm-formidlet frigivelse av p-nitroanilid er tilstrekkelig for den kolorimetriske deteksjon. Den detaljerte fremgangsmåten ifølge den kolorimetriske assays ble nylig utgitt 36. Figur 3A viser representative BLT og AAPL esterase-aktivitet i elueringsfraksjonene fra S-kolonne av en GzmA og GzmM tilberedning, hhv. Kolorimetrisk assay ble også brukt til å sammenligne aktiviteten til rekombinant til innfødte GzmB preparater. Som vist i figur 3B, rekombinant 293T GzmB spaltes det kromogene substrat med lik effektivitet, sammenlignet med nativ GzmB renset fra en human NK cell linje, som nylig beskrevet 12.
For å teste mer spesifikt Gzm aktivitet, er Gzm cleavage analyser ved hjelp av kjente proteinsubstrater indikert. Disse cleavage analyser kan utføres med renset rekombinant eller innfødte protein (hvis tilgjengelig), med cellelysater eller mest fysiologiske med intakte celler. Hvis et protein-substrat er tilgjengelig, kan proteolytiske aktivitet analyseres i enkle co-inkuberings eksperimenter med Gzm tilbe Dette er demonstrert ved det kjente bakterielle GzmA og GzmB substrater nuoCD og nuoF 9, så vel som med den nye humane mitokondrie GzmM substrat NDUFAF3 (Figur 4A).
Cellelysater representerer en annen åpenbar kilde til flere Gzm underlag. Kommersielle antistoffer er tilgjengelige mot mange av substratene. En rask og enkel metode for å generere cellelysatene er ved å påføre flere fryse / tine-sykluser som tidligere vist 33. Bruken av vaskemidler is ikke anbefalt som de kan forstyrre Gzm aktivitet. På figur 4B, GzmA mediert spaltning av hnRNPA1 i en HeLa celle-lysat er demonstrert i et immunoblot ved å bruke et anti-hnRNPA1 antistoff, så vel som et anti-Β-actin-antistoff som lasting kontrollen.
For spaltningsseter analyser (eller cytotoksisitetsanalyser) i intakte celler, er det nødvendig at det finnes en ekstra leverings molekyl (PFN eller streptolysin O, SLO, for pattedyrceller; GNLY eller andre antimikrobielle peptider for prokaryote celler). Cleavage forsøk i intakte celler er mest utfordrende når konsentrasjonen av leveranse molekylene er kritisk og må omfattende finjustering. Vi presenterer disse komplekse protokoller av apoptose analyser er utenfor omfanget av denne artikkelen. Her kan vi bare henvise til den enorme mengde litteratur, som eksempler 12,13.
<strong> Tabell 1: Gzm Kloning primersekvenser.
Primersekvensene som ble brukt for å klone GzmA, GzmB og GzmM er indikert. Termin primere ble utformet for å innføre en EK området før den N-terminale ende til det aktive protease (se figur 1)
Tabell 2: Aksje Solutions og Buffer Komposisjoner.
Oppskrifter på de viktigste stamløsninger og buffere er indikert.
Figur 1. pHLsec Sequence Kritisk for Construct Cloning.
I sekvensen, et par elementene i vektoren erfremhevet som er viktige for kloning, sekresjon, IMAC-rensing og aktivering av proteasene: Kozak konsensus og sekresjon signalsekvenser, de AgeI og KpnI-restriksjonsseter, så vel som den C-terminale Lys_6xHis tag. Vi eksemplifisert GzmA da innsatsen som er N-terminalt smeltet til en enterokinase (EK) nettsted. For hele kartet av hele vektor ryggrad, vises det til utfyllende informasjon i 23.
Figur 2. Expression, Rensing og aktivering av fullt Glycosylated menneske Gzms fra HEK 293 T-celler.
A) viser en serie med Coomassie-farget, ikke-reduserende SDS-PAGE-geler som viser hele GzmA produksjonsprosessen fra dens sekresjon i supernatanten til første nikkel-IMAC-rensing, EK behandling og Fina l polering via kationebytterkromatografi. Kultursupernatanten ble kjørt på SDS-PAGE under reduserende (rød) og ikke-reduserende (ikke-rød) betingelser. GzmA er en homodimer (ssGzmA) som er stabilisert ved en disulfidbinding. Den GzmA homodimer (~ 60 kDa) går nær forurensende BSA (~ 66 kDa). Under reduserende forhold GzmA monomer (shGzmA) vises som en ~ 34 kDa band. For å demonstrere at renheten av slutt GzmB og GzmM preparater, representative Coomassie-fargede geler under ikke-reduserende betingelser, er vist i B. bakterielt (E. coli) generert GzmA samt GzmA og GzmB produsert i HEK293T celler ble behandlet med EndoH og analysert ved ikke-reduserende SDS-PAGE og Coomassie-farging. Glykosylering av Gzms produsert i HEK293T celler er demonstrert ved et mobilitetsforskyvning etter EndoH behandling, sammenlignet med ikke-glykosylert GzmA produsert i bakterier (C).
ig3.jpg "/>
Figur 3. Rekombinant Gzms hydrolyze syntetiske peptider.
A) ble små prøver av de fraksjoner fra eluering slutt S-kolonne testet for GzmA og GzmM aktivitet i kromogene analyser ved anvendelse BLT og AAPL, henholdsvis som substrater. Grafene viser peptid cleavage som ble angitt som en OD økning på 405 nm. Aktivitetstoppfraksjoner korrelert med proteintoppen i eluering som angitt i UV-absorbans, og SDS-PAGE-analyse (figur 2A og B). B), rekombinant 293T og native GzmB (fremstilt som beskrevet 12) ved indikerte konsentrasjoner ble inkubert i nærvær av det kromogene substratet AAD. GzmB aktivitet ble angitt som en OD endring ved 405 nm. Grafen viser gjennomsnitt ± SEM av våre nyeste Gzm preparater som ble testet i tre paralleller.
52911 / 52911fig4.jpg "/>
Figur 4. Rekombinant Gzms Cleave proteinsubstrater.
A) Rekombinant GST-kodet, bakterielle respiratoriske kjeden proteiner nuoCD og nuoF, samt pattedyr respiratoriske kjeden protein NDUFAF3, ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Gzms indikert i 15 minutter ved 37 ° C. 1 ug av rensede proteiner i 20 pl reaksjonsblandinger ble anvendt. Spalting ble analysert ved SDS-PAGE og Coomassie-farging. B) HeLa cellelysat (i en proteinkonsentrasjon på ~ 1 mg / ml) ble inkubert med angitte konsentrasjoner av rekombinant GzmA i 30 minutter og analysert ved immunoblotting ved anvendelse av anti hnRNPA1 og Β-actin-antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den klassiske og omfattende undersøkt rollen til GzmA og GzmB er induksjon av apoptose i pattedyrceller etter deres cytosoliske levering av pore-dannende protein PFN 1. Nylig ble den cytotoksiske spektrum for Gzms utvidet betydelig fra pattedyrceller til 9,10 bakterier, så vel som visse parasitter 11. Videre er de ikke-klassiske, ekstracellulære funksjoner av GzmA og GzmB samt den biologiske betydning av de forskjellige sjeldne Gzms er fortsatt uklar. Derfor, en robust tids- og kostnadseffektiv uttrykk og rensing system av Gzms, som tilbys av denne protokollen, vil være til stor hjelp for disse fremtidige studier.
Styrken av denne fremgangsmåte er spesielt basert på ekspresjonsvektoren, pHLsec 23, som er brukt i dette systemet. Dette plasmidet har et høyt kopiantall i E. coli, og dermed muliggjør effektiv DNA produksjon. Dens forsterker / promoterelementer gisterkest aktivitet i ulike cellelinjer 24. Den inneholder et intron i transkripsjonsenheten. Introner er blitt funnet å forbedre genekspresjon i pattedyrceller opptil 100 ganger 37. I tillegg gir plasmidet en Kozak konsensus og en optimalisert sekresjonssignal, en Lys-6xHis-tag og en poly-A signal (figur 1). Innsatser kan klones ved hjelp av AgeI og KpnI-setene mellom-sekresjonssignal, og Lys-6xHis tag. Bruke AgeI og XhoI vil unngå polyHis tag. For Gzms, var det nødvendig å sette inn et enterokinase-sete ved N-terminus av de proteaser som muliggjør aktivering av proteasene etter ekspresjon og rensing IMAC. For ekspresjon av andre enzymer dette kanskje ikke er nødvendig. Ekspresjonsplasmidet ble testet for flere konstruksjoner av forskjellige lengder, glykosyleringsseter tilstander, og antall disulfidbindinger, samt for proteiner som inneholdt flere domener med forskjellige folder 23.
38. Vi fant at transfeksjonseffektiviteten var lineært avhengig av DNA mengden metning bare på omtrent 80 pg for en 15-cm tallerken (upublisert observasjon). Derfor anbefaler vi at du bruker opp til 80 μ g plasmid DNA / fatet i denne protokollen for maksimal effektivitet. Dette vil utgjøre omtrent 2 mg DNA pr preparat (corresponding til 2 MaxiPrep kolonner). Transfeksjonseffektiviteten ble lettest overvåket ved å kjøre en prøve av kultursupernatant (ca 20 μ l) på SDS-PAGE etter 72 timers inkubasjonstid. Et proteinbånd av det utskilte protease bør være synlig ved Coomassie-farging. Hvis Gzm båndet var svak, og cellene ikke løsner og viste levedyktige ble kulturene inkubert i ytterligere 24 timer før IMAC-rensing.
En annen mest kritiske trinnet var enterokinase (EK) behandling som aktiverer enzymet. EK aktivitet er kalsiumavhengig og inhiberes ved høye konsentrasjoner av NaCl 39 eller imidazol (upublisert observasjon). Det var derfor viktig å dialyser eluatet fra IMAC mot et tilstrekkelig volum (20 ml eluat pr 2 liter dialysebuffer) EK buffer inneholdende nok kalsium og ikke mer enn 50 mM NaCl ved nøytral pH. EK behandling anbefales i 16 timer ved RT, og skal overvåkes ved hjelp av SDS-PAGE avslørte at en mobilitetsforskyvning of den behandlede protease hvis spaltningen var fullført. Frisk EK ble tilsatt og inkubasjon i frisk EK Dialyse buffer ble videreført hvis skift var ufullstendig. Bare hvis spaltingen var fullført dialyse mot buffer A S ble startet og fortsatt rensning. Den katalytiske lette kjede av EK har en pl-verdi på 5,2, slik at fullstendig atskillelse av EK fra Gzms i slutt kationebytterkromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
