Introduction
De Gzms är en familj av mycket homologa serinproteaser lokaliserade i specialiserade lysosomer av CTL och NK-celler 1. De cytotoxiska granuler av dessa mördarceller innehåller också membranstörande proteiner PFN och GNLY som publiceras samtidigt med Gzms vid erkännandet av en målcell avsedd för eliminering 2,3. Det finns fem Gzms hos människor (GzmA, B, H, K och M), och 10 Gzms i möss (GzmA - G, K, M och N). GzmA och GzmB är de mest förekommande och omfattande i människor och möss 1. Emellertid har nyare studier börjat undersöka celldöds vägar samt ytterligare biologiska effekter som förmedlas av de andra, så kallade föräldralösa Gzms i hälsa och sjukdom 4.
Den mest kända funktionen av Gzms, speciellt av GzmA och GzmB, är induktionen av programmerad celldöd i däggdjursceller vid leverans i målcellema genom PFN 5,6. Emellertid, Senare studier visade också extracellulära effekterna av Gzms med stor inverkan på immunreglering och inflammation, oberoende av cytosoliskt leverans av PFN 7,8. Spektrumet av celler som dödas effektivt efter cytosoliskt inträde av Gzms har också nyligen utvidgats från däggdjursceller till bakterier 9,10 och även vissa parasiter 11. Dessa senaste upptäckterna öppnat en helt nytt område för GZM forskare. Därför kommer en kostnadseffektiv, hög avkastning mammalieexpressionssystem avsevärt underlätta för dessa framtida studier.
Native människa, mus och råtta Gzms har framgångsrikt renas från granulat fraktion av CTL och NK-celler linjer 12-14. Emellertid, i våra händer var utbytet av sådana reningstekniker är i området av mindre än 0,1 mg / I cellodling (opublicerad observation och 12). Vidare, den kromatografiska upplösningen av en enda GZM utan förorening med andrasr Gzms och / eller proteiner som också finns i granulerna är utmanande (opublicerade data och 12,14). Rekombinanta Gzms producerades i bakterier 15, jäst 16, insektsceller 17 och även i däggdjursceller såsom HEK 293 18,19. Endast de däggdjursexpressionssystem bära potential att producera rekombinanta enzymerna med posttranslationella modifieringar som är identiska med den naturliga cytotoxiska protein. Posttranslationella modifieringar har varit inblandade med den specifikt upptag genom endocytos och den intracellulära lokaliseringen av proteaset inom målceller 20-22. Därför genom att använda pHLsec 23 (en slags gåva av Radu Aricescu och Yvonne Jones, University of Oxford, Storbritannien) som plasmidskelettet för GZM uttryck, har vi etablerat en enkel, tids- och kostnadseffektivt system för högavkastande proteinproduktion i HEK293T celler. pHLsec kombinerar en CMV-förstärkare med en kyckling Β-aktinpromotor; Sammantaget ger dessa faktorer demonstrationsTed den starkaste promotoraktivitet i olika cellinjer 24. Dessutom innehåller plasmiden en kanin Β-globin intron, optimerade Kozak och sekretionssignaler, en Lys-6xHis-tagg och en poly-A-signal. Skär kan klonas bekvämt mellan utsöndringssignalen och Lys-6xHis-tag (figur 1) säkerställa optimal expression och sekre effektivitet för proteiner som saknar lämpliga N-terminala domänerna. För expression av de Gzms ersatte vi den endogena utsöndringssignalsekvens med utsöndringssignalen som tillhandahålls av vektorn följt av ett enterokinas (EK) plats (DDDDK) så att EK behandling aktiverade de utsöndrade Gzms (aktiva Gzms börjar med den N-terminala aminosyrasekvensen IIGG 25). Dessutom till fördel för denna metod, HEK293T celler växer snabbt i lågpris medium, såsom Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), och är väl lämpade för kostnadseffektiv kalciumfosfat-transfektion metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av expressionsplasmiden pHLsec-GZM
- Förbered totalt RNA från humana NK-celler (primära celler framställda som i 26 eller NK-celllinjen NK-92 uttrycka alla fem mänskliga Gzms) med hjälp av en lämplig RNA-isolering metod och omvänd transkribera med hjälp av en första cDNA-strängen syntetisera kit, efter manufacturer` s rekommendationer. Amplify GZM cDNA med hjälp av PCR och klon i pHLsec som beskrivs i 23 (vänlig gåva från Radu Aricescu och Yvonne Jones, University of Oxford, Storbritannien) med Agel och Kpnl-ställena (Figur 1).
OBS: Använd följande primers som anges i tabell 1. - Bekräfta korrekta skär genom sekvensering. Expandera expressionsplasmider i DH5a-celler och rena med hjälp av en endotoxinfritt plasmidisolering kit och följa tillverkarens instruktioner.
- Resuspendera renade plasmider i endotoxinfritt, sterilt vatten vid en koncentration av 2 mg / ml och förvara vid -20 ° C until användning.
2. Expression av Gzms i HEK293T celler
- Framställning av reagens
- Bered standardodlingsmedium. Till Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande hög glukoshalt (25 mM), GlutaMax (4 mM), natriumpyruvat (1 mM) till 10% av standard fetalt kalvserum (FCS), penicillin (100 enheter / ml), streptomycin ( 100 | ig / ml).
- Förbered transfektionsmediet. Till odlingsmedium utan penicillin-streptomycin lägg 25 | ig / ml klorokin (lägg färskt på dagen för transfektion från 1,000x bestånd i PBS, lagrad vid -20 ° C).
- Förbered serumfritt odlingsmedium: Till serumfritt medium för HEK293-celler lägga glutamin (4 mM), penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 | ig / ml), och 2,5 mg / L amfotericin B.
- Förbered de lösningar som beskrivs i tabell 2 och filter med en 0,45 um filter före användning:
- Expanderande HEK293T celler
- Väx HEK293T-celler i 20 ml kulture medium med användning av 150 x 25 mm vävnadsodlingsskålar.
- Sträck celler vid 80% sammanflytning (split-kvot av 1: 4, vanligtvis varje 3: e dag). Celler löst fästa, de kan mekaniskt avlägsnas utan trypsinization genom noggrant pipettera upp och ned.
- Plate celler natten innan transfektion för att ge 60-70% konfluens vid dagen för transfektion (såddtäthet ~ 2 x 10 5 celler / ml). En vanlig beredning storlek består av 20 till 25 odlingsskålar.
- Kalcium-fosfat transfektion
- 1 h före transfektion, ändra standardodlingsmedium för att 20 ml transfektionsmediet. Nära slutet av denna 1 h inkubationssteg, blanda 400 ^ g av plasmid-DNA med 10,95 ml DDH 2 0 och 1,55 ml 2 M CaCl2 i 50 ml rör (en tub / 5 rätter).
- 1 till 2 min före transfektionen till 12,5 ml 2x HBS till 12,5 ml av DNA-kalcium-lösning, blanda genom inversion av rören och inkubera under 30 sek vid rumstemperatur.
- Lägg the blandning framställd i 2.3.2 direkt till cellerna (5 ml per skål), droppvis i mediet. Strö jämnt över hela området, vrida mediet till en något orange färg.
- Inkubera odlingsskålama för 7 till 11 h i en vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2 i fuktad luft). Efter inkuberingen är en fin fällning synlig. Ta transfektion mediet, skölj noga med förvärmda PBS och tillsätt 20 ml serumfritt odlingsmedium som framställts i 2.1.3. Inkubera i 72 h i en vävnadsodlingsinkubator.
- Analysera transfektionen och expressionseffektiviteten genom att köra ett prov (~ 20 | il) av cellsupernatanten på SDS-PAGE och färgning med Coomassie Brilliant Blue för att visualisera en granzym band.
- Rening av Gzms från odlingssupernatant av Nickel-IMAC
- Efter inkubationen dekanterades cellkultursupernatanter i 250 ml rör och klar genom centrifugering. Genomför en första dragning (400 xg, 10 min, 4 °C) som kommer att klara mediet från lösgjorda celler. Överför supernatanten i färska 250 ml rör och centrifugera vid 4000 xg, 30 min vid 4 ° C för att avlägsna eventuellt kvarvarande cellrester.
- Tillsätt 5 ml 5 M NaCl, 6,25 ml av 2 M Tris-bas (pH 8) och 1 ml 0,25 M Niso 4 per 250 ml rensas supernatanten. Filtrera supernatanten med användning av en 500 ml vakuumfilterenhet (0,45 mm).
- Jämvikta en Nickel-IMAC-kolonnen med His-bindande buffert A (10 kolonnvolymer, CV) med en lämplig FPLC-system.
- Applicera rensas supernatanten till den jämviktade kolonnen vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min vid 4 ° C.
- Efter det att supernatanten applicerades, tvätta kolonnen med His-bindningsbuffert tills UV-absorbans-baslinje uppnås (vanligen 10 CV).
- Eluera Gzms med en linjär 20 ml-gradient (0 till 250 mM imidazol) vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min under uppsamling av 2 ml-fraktioner. Analysera elueringsfraktionerna genom SDS-PAGE och Coomassie-färgning.
- Enterokinas (EK)behandling och slutlig sanering genom katjonbyteskromatografi
- Pool GZM innehållande fraktionerna i ett dialysröret med ≤10 MWCO. Lagra ett litet prov vid -20 ° C som pre-EK-kontroll.
- Lägg EK på 0,02 enhet / 50 ml initial vätskan direkt till den poolade fraktionen i dialysröret och dialysera O / N (minst 16 timmar) vid rumstemperatur i EK-buffert (4 L, förändring buffert en gång).
- Nästa dag, analysera EK behandlade Gzms i jämförelse med pre-EK-kontroll med hjälp av SDS-PAGE och Coomassie-färgning.
- När N-terminala bearbetningen är klar, ändrar dialysbuffert till S buffert A (4 liter) och dialysera under ytterligare 4 h vid RT. Filter dialysat (0,45 ^ m).
- Jämvikta en S-kolonn med S-buffert A. Ladda provet på kolonnen med en flödeshastighet av 0,5 ml / min vid 4 ° C.
- Efter provsatsning, tvätta kolonnen med S-buffert A tills UV-absorbans-baslinje uppnås (omkring 10 CV). Eluera de Gzms med en 30 ml linjär gradient (150 till 1000 mM NaCl). GzmA elutor vid ~ 650 mM NaCI, GzmB vid ~ 700 mM NaCl och GzmM vid ~ 750 mM NaCl.
- Analysera elueringsfraktioner med SDS-PAGE och kolorimetriska analyser (se nedan). Pool fraktioner innehållande Gzms och koncentrat (ca 30-faldigt till en koncentration av ca 100 pM) i spinnfilter (15 ml, 10 MWCO). Alikvotera de koncentrerade GZM preparat och förvara vid -80 ° C.
3. Test GZM aktivitet
- Framställning av reagens
- Bered kolorimetrisk analysbuffert: 50 mM Tris-bas, pH 7.
- För mätningen av GzmA, tillsätt Na-CBZ-L-lysin tiobensyl ester (S-Bzl) (BLT) till analysbufferten till en slutlig koncentration av 0,2 mM och 5,5'-ditio-bis (2-nitrobensoesyra) (DTNB) till en koncentration av 0,22 mM. För GzmB inkluderar 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) och 0,22 mM DTNB. För GzmM, inkluderar 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (pNA) (AAPL). Syntetiska peptider tillsätts från lämpliga stamlösningar (i DMSO, stored vid -20 ° C) till bufferten på nytt före analysen.
- Bered klyvningsanalysbuffert: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-bas, pH 7,5
- Bered kolorimetrisk analysbuffert: 50 mM Tris-bas, pH 7.
- Kolorimetriska analyser
- Fördela små GZM prover (<5 il) från elueringsfraktionerna eller koncentrerade bestånd i 96-brunns flatbottnade plattor. Inkludera en positiv kontroll (testade GZM beredningar eller rå NK cellysat) och en negativ kontroll (buffert enbart).
- Lägg 100 | il analysbuffert till varje brunn (med användning av en flerkanalig pipett). Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C. Mät OD vid 405 nm i en mikroplattläsare.
- Klyvning analys
- För klyvnings analyser med användning av renade substrat, co-inkubera ett proteinsubstrat (nativt eller rekombinant, 100-400 nM, några exempel på effektiva GZM substrat presenteras i resultatdelen och i noten i slutet av det här avsnittet) med serieutspädningar av en GZM (börjar vid 400 nM) i analysbuffert under olika tider.Analysera genom SDS-PAGE och Coomassie eller silverfärgning; eller genom western blotting med användning av specifika antikroppar.
- För klyvnings analyser med användning av cellysat, suspendera 10 6 HeLa-celler (eller någon tillgänglig tumörcellinje) i 1 ml analysbuffert och lyserar genom frysning i en etanol / torrisbad och tining vid 37 ° C tre gånger. Avlägsna cellrester genom centrifugering (15.000 x g under 10 min vid 4 ° C).
- Samtidig inkubera klarnat lysat med Gzms vid olika koncentrationer och tider som ovan. Klyvning detekteras genom immunblotting med användning av lämpliga antikroppar.
OBS: Några exempel på bona fide substrat som kommersiella antikroppar är tillgängliga: Bjud (BH3-interagerande domänen död agonist) och kaspas 3 klyvs av GzmB 27,28; flera heterogena kärn ribonukleoproteiner (hnRNPA1, A2 och U) klyvs av GzmA 29; cytomegalovirus fosfoprotein 71 av GzmM 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I följande avsnitt kommer vi att presentera en fullständig dokumentation av en GzmA förberedelse för att belysa metoden. Vi har också framgångsrikt renat GzmB och GzmM, producerar liknande resultat i fråga om reningseffektiviteten och aktivitet. Men från de senare förberedelser vi bara kommer att visa några utvalda bitar av data. GzmB preparat från 293T-celler efter det nuvarande protokollet användes i flera publicerade studier, belyser deras aktivitet i olika biologiska analyssystem 9,29,31-34.
En typisk GzmA rening visas i fig 2A. Effektiv transfektion och expression efter 72 h indikerades genom en detekterbar GZM band på en Coomassie-färgad SDS-PAGE-gel utan ytterligare koncentration av odlingssupernatanten (~ 37 kDa för GzmB och GzmM under reducerande betingelser; ~ 60/34 kDa för GzmA enligt icke-reducerande / reducerande betingelser). Efter IMAC rening proverna behandlades med enterokinase (EK). En synlig förskjutning av EK behandlade provet (efter-EK) jämfört med före-EK-kontroll observerades. Den slutliga reningen på S-kolonnen gav högrena GZM preparat (GzmA i fig 2A; GzmB och GzmM i figur 2B) med ett enda band framträdande på Coomassie-färgade proteingeler. De sammanslagna fraktionerna koncentrerades till en slutlig koncentration av ~ 100 pM. Typiskt vi erhållas utbyten av cirka 0,5 till 1 mg Gzms per 100 ml odlingssupernatant. För att demonstrera effektiv glykosylering, var några inledande förberedelser behandlades med Endoglykosidas (Endo) H, som avlägsnar högmannos oligosackarider från N-länkade glykoproteiner. Nativt GzmA har ett N-kopplat glykosyleringsställe vid Asn-142, till vilken en hög mannos oligosackarid är bunden 35. EndoH behandling inducerade en uppenbar rörlighetsskiftning i GZM A, liksom GzmB, beredningar från HEK293T celler men inte i bakteriellt genererade GzmA enligt analys med SDS-PAGE och Coomassiefärgning (Figur 2C).
Rutinmässigt var varje GZM parti testas för enzymatisk aktivitet i kolorimetriska analyser. Denna snabba och pålitliga test visar den proteolytiska aktiviteten av de Gzms genom klyvning av små syntetiska peptider som indikeras spektrofotometriskt genom en färgförändring av analysbufferten. På grund av olika preferenser beträffande de aminosyrarester (P1 position), varefter dessa proteaser spjälkar, valet av en specifik peptid varierar mellan Gzms. GzmA har trypsin-liknande aktivitet, klyvning efter de basiska resterna arginin (Arg, R) och lysin (Lys, K). GzmB klyver företrädesvis efter asparaginsyrarester (Asp, D), och GzmM klyver efter leucin (Leu, L) och metionin (Met, M) 1. Vår förmånliga peptid val är BLT -S-Bzl att mäta GzmA aktivitet, AAD -S-Bzl för GzmB och AAPL pNA för GzmM.
Den stora skillnaden mellan thiobenzylester substrat (AAD och BLT) och p-nitroanilid-substrat (AAPL) är den specifika kemin, eftersom GZM medierar klyvning av thiobenzylester substrat frisätter bensyl-merkaptan, som endast utlöser en kromogen reaktion i sin nedströms reaktion med kromoforen DTNB. Därför, i de reaktionsbuffertarna thiobenzylester substrat DTNB måste vara närvarande, medan GZM-medierad frisättning av p-nitroanilid är tillräcklig för kolorimetrisk detektion. Den detaljerade metoden för kolorimetriska analyser publicerades nyligen 36. Figur 3A visar representativa BLT och AAPL esterasaktivitet i elueringsfraktionerna från S-kolumnen i en GzmA och GzmM förberedelse, respektive. Kolorimetrisk analys användes också för att jämföra aktiviteten av rekombinant med nativa GzmB preparat. Såsom visas i figur 3B, rekombinant 293T GzmB spjälkas det kromogena substratet med liknande effektivitet jämfört med nativt GzmB renats från en human NK-cell linje, som nyligen beskrivits 12.
För att mer specifikt testa GZM aktivitet, GZM klyvningsanalyser med användning av kända proteinsubstrat anges. Dessa klyvningsanalyser kan utföras med renat rekombinant eller nativt protein (i förekommande fall), med cellysat eller mest fysiologiskt med intakta celler. Om ett proteinsubstrat är tillgänglig, kan proteolytisk aktivitet analyseras i enkla saminkuba experiment med de GZM preparat enligt detta demonstreras med den kända bakteriella GzmA och GzmB substraten nuoCD och nuoF 9, såväl som med den nya humana mitokondrie GzmM substrat NDUFAF3 (Figur 4A).
Cellysat representerar en annan uppenbar källa till flera GZM substrat. Kommersiella antikroppar är tillgängliga mot många av substraten. En snabb och enkel metod för att generera cellysat är genom att applicera flera frysnings / upptiningscykler såsom tidigare visats 33. Användningen av rengöringsmedel is rekommenderas inte eftersom de kan störa GZM aktivitet. I figur 4B, GzmA medierad klyvning av hnRNPA1 i en HeLa-cellysat demonstreras i en immunoblot med användning av en anti-hnRNPA1 antikropp, såväl som en anti-Β-aktin antikropp som laddningskontroll.
För klyvningsanalyser (eller cytotoxicitetsanalyser) i intakta celler, är det nödvändigt att det finns en extra leveransmolekyl (PFN eller streptolysin O, SLO, för däggdjursceller; GNLY eller andra antimikrobiella peptider för prokaryota celler). Cleavage analyser i intakta celler är mest utmanande när koncentrationen av leverans molekylerna är kritisk och kräver omfattande finjustering. Presentation dessa komplexa protokoll av apoptos-analyser är utanför ramen för denna uppsats. Här kan vi bara hänvisa till den stora mängd litteratur, som exempel 12,13.
<strong> Tabell 1: GZM Cloning primersekvenser.
Primersekvenserna som användes för att klona GzmA, GzmB och GzmM indikeras. Forward primrar utformades för att införa ett EK plats innan N-terminalen av det aktiva proteaset (se Figur 1)
Tabell 2: Stamlösningar och buffertkompositioner.
Recepten för de viktigaste stamlösningar och buffertar indikeras.
Figur 1. pHLsec Sekvens Kritiskt för Konstruera Kloning.
I sekvensen, några element i vektorn ärmarkerad som är viktiga för kloning, sekretion, IMAC rening och aktivering av proteaser: Kozak konsensus och utsöndringssignalsekvenser, de Agel och Kpnl-restriktionsställen, samt den C-terminala Lys_6xHis tagg. Vi exemplifierade GzmA som insatsen som är N-terminalt smält till en enterokinas (EK) webbplats. För hela kartan av hela vektorryggraden, hänvisar vi till kompletterande information i 23.
Figur 2. Expression, rening och aktivering av fullständigt glykosylerat mänskliga Gzms från HEK 293 T-celler.
A) visar en serie av Coomassie-färgad, icke-reducerande SDS-PAGE-geler som visar hela GzmA produktionsprocessen från dess utsöndring i supernatanten till första nickel-IMAC-rening, EK behandling och Fina l polering via katjonbyteskromatografi. Odlingssupernatanten kördes på SDS-PAGE under reducerande (röd) och icke-reducerande (icke-röd) betingelser. GzmA är en homodimer (ssGzmA) som stabiliseras av en disulfidbindning. Den GzmA homodimer (~ 60 kd) går nära förorenande BSA (~ 66 kDa). Under reducerande betingelser GzmA monomeren (shGzmA) visas som en kDa-band ~ 34. För att demonstrera renheten hos den slutliga GzmB och GzmM beredningar, representativ Coomassie-färgade geler under icke reducerande betingelser visas i B. Bakteriellt (E.coli) som genereras GzmA samt GzmA och GzmB produceras i HEK293T-celler behandlades med EndoH och analyseras genom icke-reducerande SDS-PAGE och Coomassie-färgning. Glykosylering av Gzms framställda i HEK293T celler demonstreras genom en rörlighetsskiftning efter EndoH behandling, jämfört med icke glykosylerat GzmA producerad i bakterier (C).
ig3.jpg "/>
Figur 3. Rekombinant Gzms hydrolysera syntetiska peptider.
A), var små prover av elueringsfraktionerna från den slutliga S-kolonn testad för GzmA och GzmM aktivitet i kromogena analyser med hjälp av BLT och AAPL, respektive, som substrat. Grafer visar peptidklyvning som angavs som en ökning OD vid 405 nm. Aktivitetstoppfraktionerna korrelerade med proteintopp i elueringen vad som anges i UV-absorbans och SDS-PAGE-analys (Figur 2A och B). B), rekombinant 293T och nativt GzmB (framställd såsom beskrivs 12) vid angivna koncentrationer inkuberades i närvaro av det kromogena substratet AAD. GzmB aktivitet angavs som ett OD vid 405 nm. Diagrammet visar medelvärdet ± SEM av våra senaste GZM preparat som testades i tre exemplar.
52.911 / 52911fig4.jpg "/>
Figur 4. Rekombinant Gzms Cleave proteinsubstrat.
A) Rekombinanta GST-märkt, bakteriella respirator kedjeproteiner nuoCD och nuoF samt däggdjursandningskedjan protein NDUFAF3, behandlades med angivna koncentrationen av angivna Gzms för 15 min vid 37 ° C. 1 | ig av renade proteiner i 20 | il reaktioner användes. Klyvning analyserades genom SDS-PAGE och Coomassie-färgning. B) HeLa-cell-lysat (vid en proteinkoncentration av ~ 1 mg / ml) inkuberades med indikerade koncentrationer av rekombinant GzmA för 30 min och analyserades genom immunoblotting med användning av anti hnRNPA1 och Β-aktin-antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den klassiska och omfattande studerat rollen för GzmA och GzmB är induktionen av apoptos i däggdjursceller efter deras cytosoliska leverans av det porbildande protein PFN 1. Nyligen var den cytotoxiska spektrum av Gzms breddats avsevärt från däggdjursceller till bakterier 9,10, liksom till vissa parasiter 11. Vidare är de icke-klassisk, extracellulära funktioner i GzmA och GzmB liksom den biologiska betydelsen av de olika anonyma Gzms är fortfarande oklar. Därför är en robust tids- och kostnadseffektiv uttryck och rening systemet för Gzms, i enlighet med detta protokoll, kommer att vara till stor hjälp för dessa framtida studier.
Styrkan i denna metod är särskilt baserad på expressionsvektom, pHLsec 23, som används i detta system. Denna plasmid har ett högt kopietal i E. coli, vilket möjliggör effektiv DNA-produktion. Dess förstärkare / promotorelement gerstarkaste aktiviteten i olika cellinjer 24. Den innehåller ett intron inom transkriptionsenheten. Introner har befunnits förstärka genuttryck i däggdjursceller upp till 100-faldigt 37. Dessutom ger plasmiden en Kozak konsensus och en optimerad utsöndringssignal, en Lys-6xHis-tagg och en poly-A-signal (fig 1). Skär kan klonas genom att använda Agel och Kpnl-ställena mellan utsöndringssignalen och Lys-6xHis tagg. Använda Agel och Xhol kommer att undvika polyHis taggen. För Gzms, var det nödvändigt att infoga en enterokinas ställe vid N-terminalen av de proteaser som möjliggör aktivering av proteaser efter expression och IMAC-rening. För uttryck av andra enzymer detta kanske inte är nödvändigt. Expressionsplasmiden testades framgångsrikt för flera konstruktioner av olika längd, glykosylerings states, och antalet disulfidbindningar, liksom för proteiner, som innehöll flera domäner med olika veck 23.
38. Vi fann att transfektionseffektivitet var linjärt beroende av DNA-mängden mättar bara på omkring 80 mikrogram för en 15-cm skål (opublicerad observation). Därför rekommenderar vi att du använder upp till 80 μ g plasmid DNA / fat i detta protokoll för maximal effektivitet. Detta kommer att uppgå till ca 2 mg DNA per beredning (corresponding till 2 Maxiprep kolumner). Transfektionseffektiviteten var mest övervakas lätt genom att köra ett prov av kultursupernatant (ca 20 μ l) på SDS-PAGE efter 72 h inkubationsperiod. Ett proteinband av det utsöndrade proteaset bör vara synliga genom Coomassie-färgning. Om GZM bandet var svag och cellerna inte lossnar och verkade genomförbar, kulturerna inkuberades under ytterligare 24 timmar innan IMAC rening.
En annan mest kritiska steget var enterokinas (EK) behandling som aktiverar enzymet. EK-aktivitet är kalciumberoende och hämmas av höga koncentrationer av NaCI 39 eller imidazol (opublicerad observation). Därför var det viktigt att dialysera eluatet från IMAC mot en tillräcklig volym (20 ml eluat per 2 liter dialysbuffert) i EK buffert innehållande tillräckligt med kalcium och inte mer än 50 mM NaCl vid neutralt pH. EK behandling rekommenderas under 16 timmar vid RT och bör övervakas av SDS-PAGE som avslöjade en rörlighetsskiftning of den behandlade proteaset om klyvningen var fullständig. Färsk EK tillsattes och inkubation i färskt EK Dialys buffert fortsätta om övergången var ofullständig. Endast om klyvningen var fullständig dialys mot S-buffert A startat och rening fortsatt. Den katalytiska lätta kedjan av EK har ett pl-värde på 5,2, vilket gör att fullständig separation av EK från Gzms i slut katjonbytarkromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5 ml column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
References
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C.
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
