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निरपेक्ष प्रोटीन की मात्रा के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री निगरानी चयनित रिएक्शन

Published: August 17, 2015 doi: 10.3791/52959
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करने वाले प्रोटिओमिक प्रयोगों गैर लक्षित (बन्दूक) या लक्षित तरीकों का भी उपयोग करने के लिए तैयार किया जा सकता है। डिस्कवरी प्रोटिओमिक्स आम तौर पर एक पारंपरिक डेटा पर निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग कर, या (उदाहरण के लिए, एमएस ई, पट्टी) हाल ही में विकसित डेटा स्वतंत्र तकनीकों में से एक 1,2 का उपयोग करके, या तो नीचे-ऊपर बन्दूक एमएस पर निर्भर करता है। शॉटगन प्रोटिओमिक्स उच्च throughput पेप्टाइड पहचान और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लेकिन यह पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए या प्रोटीन के छोटे से परिभाषित सेट (~ दसियों) को लक्षित करने के लिए आम तौर पर अनुपयुक्त है। सबसे अधिक बार निशाना बनाया प्रोटिओमिक्स के लिए इस्तेमाल किया एमएस विधि क्योंकि इसकी उच्च संवेदनशीलता, गति, और गतिशील रेंज में 3-5 की प्रतिक्रिया की निगरानी (एस आर एम) का चयन किया गया है। एस आर एम के लिए वैकल्पिक उच्च संकल्प, पूर्ण एमएस स्कैनिंग 6 का लाभ लेता है जो समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी, ​​शामिल हैं।

एस आर एम आमतौर पर एक नैनो प्रवाह लौ का उपयोग किया जाता हैSED चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (नैनो आरपी-नियंत्रण रेखा) एक नैनो electrospray आयनीकरण करने के लिए मिलकर साधन एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर (Qqq एमएस) से जुड़ी (नैनो ईएसआई) आयन स्रोत है। एक ठेठ प्रयोग में, नमूना प्रोटीन proteolytically पच जाता है, और जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स chromatographically अलग desorbed, और आयनित कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप अग्रदूत आयनों एम / पहला quadrupole (क्यू 1) द्वारा फ़िल्टर जेड और एक टक्कर गैस उन के साथ टकराने से दूसरे quadrupole (Q2) में खंडित कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप टुकड़ा आयनों हैं मी / z फ़िल्टर तीसरे quadrupole (Q3) में और एक dynode द्वारा मात्रा। प्रत्येक अग्रदूत और टुकड़ा आयन जोड़ी एक संक्रमण के रूप में जाना जाता है, और प्रत्येक संक्रमण एक निर्दिष्ट समय अवधि (समय ध्यान केन्द्रित करना, आम तौर पर 2-50 मिसे) के लिए नजर रखी है। नियंत्रण रेखा के आर एम के दौरान, संक्रमण के एक पूर्वनिर्धारित सूची के माध्यम से Qqq एमएस चक्र (कर्तव्य चक्र आम तौर पर ≤3 सेकंड है), और प्रत्येक संक्रमण के एक वर्णलेख उत्पादन किया जाता है।

वैकल्पिक रणनीतिप्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एँ आम तौर पर ऐसे डॉट दाग, पश्चिमी blots, ELISAs, एंटीबॉडी, रिवर्स चरण प्रोटीन, microfluidic immunoassays, डिजिटल ELISAs, और microsphere आधारित immunoassays के रूप में 7 immunoassays का उपयोग करें। सबसे अच्छा immunoassays नियंत्रण रेखा के आर एम की तुलना में काफी अधिक संवेदनशील हो सकता है, और immunoassays के throughput नमूना नियंत्रण रेखा के आर एम 5 की तुलना में काफी अधिक हो सकता है। हालांकि, विकासशील immunoassays महंगा हो सकता है और / या समय लेने वाली है, और जिसके परिणामस्वरूप assays के सेल / ऊतक सेल / homogenization के तरीकों के साथ असंगत, पार जेट और / या हस्तक्षेप करने के लिए असुरक्षित हो सकता है, और / या उत्तरदायी नहीं 5,8 बहुसंकेतन के लिए। इन मुद्दों में से कुछ antibody- और एमएस आधारित तकनीक युग्मन द्वारा संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लक्ष्य प्रोटीन पूर्व प्रोटियोलिसिस और नियंत्रण रेखा के आर एम 9-12 immunoprecipitation का उपयोग कर समृद्ध बनाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, SISCAPA तकनीक पेप्टाइड छुट्टी पर प्रोटियोलिसिस करने के बाद immunoprecipitation को रोजगारएल 13,14। इसके अलावा रणनीतियों immunoenrichment करने के लिए, उच्च बहुतायत प्रोटीन की immunodepletion analytes 15,16 coeluting द्वारा हस्तक्षेप को कम करने से नियंत्रण रेखा के आर एम संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

एमएस आधारित प्रोटीन मात्रा का ठहराव लेबल से मुक्त और स्थिर आइसोटोप लेबलिंग (उदाहरण के लिए, चयापचय लेबलिंग, लेबलिंग रासायनिक, और भारी लेबल प्रोटीन और पेप्टाइड आंतरिक मानकों) में भी सापेक्ष और निरपेक्ष मात्रा का ठहराव में विभाजित किया जा सकता है। लेबल मुक्त तकनीक सापेक्ष प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन सटीक पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए अनुपयुक्त हैं कर सकते हैं। तुलना करके, लेबलिंग तकनीक नमूना तैयार करने और एमएस विचरण के साथ जुड़े त्रुटि को कम कर दिया है, और अक्सर रिश्तेदार प्रोटीन मात्रा का ठहराव 17 के लिए उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, स्थिर आइसोटोप में लेबल के proteome (SILAP) मानकों मानव सीरम 18 वर्ष की नियंत्रण रेखा के आर एम के माध्यम से संभावित बायोमार्कर के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव सक्षम एक सुसंस्कृत मानव कोशिका लाइन का उपयोग कर तैयार। एमएस द्वारा सटीक निरपेक्ष प्रोटीन मात्रा का ठहराव शुद्ध, मात्रा निर्धारित, isotopically लेबल प्रोटीन या पेप्टाइड आंतरिक मानकों नुकीला-में किया है कि एमएस के लिए पहले जैविक नमूने की आवश्यकता है। एक नियंत्रण रेखा के आर एम कार्यप्रवाह में भारी आइसोटोप में लेबल आंतरिक मानकों का समावेश अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रयोगशालाओं 16,19 के बीच हस्तांतरणीय होना दिखाया गया है कि पूर्ण मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।

एमएस द्वारा पूर्ण प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए स्थिर आइसोटोप लेबल वाली आंतरिक मानकों पेप्टाइड मानकों ठोस चरण संश्लेषण 20, concatenated प्रोटीज-cleavable पेप्टाइड मानकों 21 से बना प्रोटीन, और पूर्ण लंबाई प्रोटीन मानकों में 22 का उपयोग कर तैयार शामिल हैं। लक्ष्य प्रोटीन सहसंयोजक संशोधन और अधूरा नमूना तैयार करने (यानी, अधूरा नमूना lysis और homogenization, और अधूरा प्रोटीन solubilization, विकृतीकरण, alkylation, और प्रोटियोलिसिस) सही मात्रा का ठहराव को कमजोर कर सकते हैं। आंतरिक पीrotein मानकों इन संभावित समस्याओं के अधिकांश से प्रभावित होने की कम से कम संभावना है, लेकिन वे आम तौर पर तैयार करने के लिए सबसे मुश्किल है। एक वैकल्पिक amino- और carboxy टर्मिनल देशी flanking अवशेष शामिल करने के लिए तैयार कर रहे हैं जो कई आंतरिक पेप्टाइड मानकों का उपयोग कर प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए है। भले ही आंतरिक मानक के प्रकार कार्यरत है, जिनमें से यह नुकीला-में किया जाना चाहिए जैविक नमूने के रूप में जल्दी एक बिंदु पर संभव के रूप में नमूना तैयार करने के दौरान। इसके अलावा, कई नमूना तैयार करने की तकनीक (उदाहरण के लिए, अलग विकृतीकरण शर्तें) परीक्षण किया जाना चाहिए। कई ओर्थोगोनल प्रयोगात्मक तकनीक (प्रयोगात्मक पार विधिमान्यकरण) के उपयोग को 23-25 ​​चुनौतियों के सबसे संभावित मात्रा का ठहराव पर काबू पाने के लिए एक व्यवहार्य रणनीति है।

प्रोटीन की नियंत्रण रेखा के आर एम मात्रा का ठहराव आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया गया है कि एक अत्यंत लचीला तकनीक है। विशेष रूप से, यह भीतर पेप्टाइड और प्रोटीन बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैइस तरह के सीरम, कोर बायोप्सी, और ठीक सुई रेस्पायरेट्रस 5 के रूप में नैदानिक ​​नमूने हैं। नियंत्रण रेखा के आर एम भी, बोटुलिनम न्यूरोटोक्सिन 27 का पता लगाने के संकेत दे रास्ते 5 भीतर प्रोटीन फास्फारिलीकरण गतिशीलता यों, और प्रोटीन रचना 28 में परिवर्तन यों, प्रोटीन परिसरों 5,26 के stoichiometry को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

हमारी प्रयोगशाला कीमोटैक्सिस मार्ग सिमुलेशन के विकास का समर्थन करने के लिए बृहतभक्षककोशिका कीमोटैक्सिस कि मध्यस्थता संकेत प्रोटीन यों के लिए नियंत्रण रेखा के आर एम उपयोग कर रहा है। प्रोटोकॉल की समग्र योजना (चित्रा 1) जांच का लक्ष्य पेप्टाइड्स रैंकिंग के साथ शुरू होता है। बाद में, कच्चे तेल की बाहरी पेप्टाइड मानकों संश्लेषित और जैविक नमूने के गुणात्मक विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा के आर एम assays के विकसित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जैविक नमूने व्युत्पन्न लक्ष्य पेप्टाइड का पता चला है, तो शुद्ध भारी लेबल आंतरिक पेप्टाइड मानकों मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम के लिए तैयार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल एसी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैcurately जैविक नमूने की एक विस्तृत विविधता से प्रोटीन यों, और प्रोटीन लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता की जांच का समर्थन है।

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Protocol

नोट: इस विधि में पहले 56 में वर्णित किया गया है।

1. पेप्टाइड लक्ष्य के चयन

  1. लक्ष्य प्रोटीन की एक सूची संकलित करें, और जैविक नमूने भर में सामान्य बनाने के लिए गृह व्यवस्था प्रोटीन की एक छोटी संख्या में शामिल हैं, और यह भी एक आंतरिक प्रोटीन मानक (जैसे, जुगनू luciferase) शामिल हैं। इस तरह के प्रोटीन पाचन सिम्युलेटर 29,30 के रूप में एक सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग सिलिको में tryptic पेप्टाइड में लक्ष्य प्रोटीन को पचाने।
  2. पेप्टाइड्स पूरी तरह tryptic रहे हैं और कोई लापता ट्रिप्सिन दरार साइटों है कि रोकने के लिए आवश्यकता है। संभावित अधूरा trypsin पाचन 31 से बचने के लिए पड़ोसी ट्रिप्सिन दरार साइटों के साथ पेप्टाइड्स से बचें।
  3. प्रत्येक पेप्टाइड की लंबाई 5-20 अवशेषों है कि आवश्यकता होती है। अब पेप्टाइड्स पर विचार करें, लेकिन वे आम तौर पर synthesize करने के लिए और अधिक महंगे हैं कि ध्यान दें।
  4. यह एक प्राकृतिक आनुवंशिक संस्करण (उदाहरण के लिए, एक एकल nucleotid से मेल खाती है अगर एक पेप्टाइड से बचेंई बहुरूपता)। इसके अलावा ट्रिप्सिन साइटों (1.2 चरण) अप्रभावित रहे हैं, इसकी पुष्टि।
  5. यह posttranslational संशोधन (PTM) की एक साइट से मेल खाती है अगर एक पेप्टाइड से बचें। यह नियंत्रण रेखा एमएस नमूना तैयार करने के दौरान रासायनिक संशोधन होने का खतरा हो सकता है अगर इसी तरह, एक पेप्टाइड से बचें। विशेष रूप से, सिस्टीन और methionine ऑक्सीकरण, asparagine और glutamine deamidation, और pyroglutamate के एमिनो टर्मिनल glutamine के गठन के लिए प्रवण पेप्टाइड्स से बचें। ट्रिप्सिन साइटों (1.2 चरण) अप्रभावित हैं पुष्टि।
    1. इसके अलावा, प्रोटीन टर्मिनी posttranslational संशोधन (एमिनो टर्मिनल मेथिओनिन घटाने और एसिटिलीकरण, और carboxy टर्मिनल amidation) होने का खतरा है, क्योंकि प्रोटीन amino- और carboxy-टर्मिनी से उत्पन्न होने वाले पेप्टाइड्स से बचें।
  6. प्रत्येक लक्ष्य पेप्टाइड प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अद्वितीय है कि आवश्यकता होती है। यह संभव नहीं है, तो पेप्टाइड isoforms / homologues का एक सेट के लिए अद्वितीय है कि आवश्यकता होती है। केवल leucine / isoleucine प्रतिस्थापन से भिन्न पेप्टाइड्स समझोके रूप में अगर इन नियंत्रण रेखा के आर एम के दौरान लगभग हूबहू प्रदर्शन क्योंकि पेप्टाइड विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए जब वे समान थे।
    1. जैविक नमूने के सभी के लिए एक व्यापक transcriptomic विश्लेषण (जैसे, आरएनए-सेक) का प्रदर्शन किया गया है, प्रतिलेख के सिलिको में अनुवाद में उपयोग कर विशिष्टता पेप्टाइड का निर्धारण 32 के बजाय प्रजातियों के पूरे proteome का उपयोग कर के दृश्यों।
  7. लक्ष्य पेप्टाइड्स proteotypic हैं कि आवश्यकता होती है। जैविक नमूने की बन्दूक मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,2 का उपयोग कर proteotypic पेप्टाइड्स पहचानें का अध्ययन किया जा रहा है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के NIST के मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में ऑनलाइन प्रोटिओमिक्स डेटाबेस से proteotypic पेप्टाइड्स के पेप्टाइड पहचान पुस्तकालयों को पुनः प्राप्त 33 (http://peptide.nist.gov/), ग्लोबल Proteome मशीन 34 (एक्स HTTP से शिकारी वर्णक्रमीय पुस्तकालयों: // www http://gpmdb.thegpm.org/ से .thegpm.org / हंटर / सूचकांक, और GPMDB पेप्टाइड पहचान), PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/)।
  8. मात्रात्मक प्रतिलेख स्तरीय प्रदर्शन किया गया है जैविक नमूने का विश्लेषण करती है (उदाहरण के लिए, शाही सेना-सेक, qPCR), तो अपेक्षाकृत कम बहुतायत टेप के अनुरूप हैं कि पेप्टाइड्स को लक्षित करने से बचें।
  9. लक्ष्य प्रोटीन orthologs की नियंत्रण रेखा के आर एम assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कि चयन लक्ष्य पेप्टाइड्स की जरूरत है (उदाहरण के लिए, मानव और एक लक्ष्य प्रोटीन का माउस रूपों दोनों परख करने के लिए)।
  10. (यदि संभव हो तो) लक्ष्य प्रोटीन के अनुसार कम से कम दो लक्ष्य पेप्टाइड्स का चयन करें।

पेप्टाइड मानक 2. तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड बहाव के विश्लेषण के लिए बीस lyophilized पेप्टाइड मानकों (मात्रा में प्रत्येक किया जा रहा है 1 nmol) का एक सेट की तैयारी का वर्णन है। पेप्टाइड्स की एक अलग संख्या के लिए, या अलग पेप्टाइड मात्रा के लिए, यह तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगी।

    20,37 के रूप में एक पेप्टाइड संश्लेषण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर lyophilized पेप्टाइड मानकों (≥1 nmol) तैयार करें।
    1. Carbamidomethylated कर रहे बाहरी पेप्टाइड मानकों की है कि सिस्टीन अवशेषों (iodoacetamide alkylation द्वारा गठित रासायनिक संरचना) सुनिश्चित करें। इसके विपरीत, आंतरिक पेप्टाइड मानकों की है कि सिस्टीन अवशेषों असंशोधित हैं सुनिश्चित (ये, नीचे वर्णित नमूना तैयार करने के दौरान alkylated) हो जाएगा।
    2. वे amino- और carboxy टर्मिनल देशी अवशेषों flanking होते तो यह है कि आंतरिक पेप्टाइड मानकों डिजाइन (ट्रिप्सिन पाचन दक्षता के लिए नियंत्रित करने के लिए, प्रत्येक आम तौर पर 3-6 अवशेषों लंबा है)।
    3. वे स्थिर आइसोटोप चिह्नित कर रहे हैं इतना है कि आंतरिक पेप्टाइड मानकों डिज़ाइन करें। एक पेप्टाइड लेबलिंग रणनीति का चयन करते समय लक्ष्य पेप्टाइड की प्राकृतिक समस्थानिक प्रोफाइल और एमएस की बड़े पैमाने पर माप सटीकता पर विचार करें। Deuterated पेप्टाइड मानकों का प्रयोग न करें पेप्टाइड deuteration कारणों उलट चरण नियंत्रण रेखा अवधारण समय है क्योंकिएस 38 शिफ्ट करने के लिए।
      नोट: आमतौर पर, tryptic आंतरिक पेप्टाइड मानकों शुद्ध ~ 98% का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं, [13 सी 6 15 एन 4] Arg और [13 सी 6, 15 एन 2] carboxy-टर्मिनी में शामिल किया लिस।
    4. एचपीएलसी 39 का उपयोग करते हुए आंतरिक पेप्टाइड मानकों शुद्ध, और उन्हें सही ढंग से 40 यों।
  1. वी / वी फार्मिक एसिड, lyophilized पेप्टाइड के रूप में एक 10 माइक्रोन की पेप्टाइड एकाग्रता (प्रयोग देखभाल का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक 1 nmol lyophilized पेप्टाइड मानक के लिए 20% वी / वी acetonitrile (ACN) एक बहुत ही कम घनत्व हो सकता है 0.1% की 100 μl जोड़ें और) आसानी से खो दिया जा सकता है। 2 मिनट और स्नान के लिए नमूने 5 मिनट के लिए उन्हें sonicate भंवर कि पेप्टाइड विघटन पूरा हो गया है सुनिश्चित करने के लिए।
  2. भंग पेप्टाइड्स पूल, और 80 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए एक वैक्यूम concentrator में जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण ध्यान केंद्रित। किसी भी उपजी पेप्टाइड भंग करने के लिए ACN के 20 μl जोड़ें।
    नोट: नमूना अब सहntains प्रत्येक पेप्टाइड और 20% वी / वी ACN के 10 माइक्रोन।
  3. आंतरिक पेप्टाइड मानकों के लिए, मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम के लिए एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार:
    1. एक 1 माइक्रोन कमजोर पड़ने के 100 μl तैयार: 20% वी / वी ACN के 90 μl और 10 माइक्रोन पेप्टाइड मिश्रण के 10 μl गठबंधन।
    2. एक 100 एनएम कमजोर पड़ने के 100 μl तैयार: 20% वी / वी ACN के 90 μl और 1 माइक्रोन पेप्टाइड मिश्रण के 10 μl गठबंधन।
  4. बाहरी पेप्टाइड मानकों के लिए, 0.1% v / वी फार्मिक एसिड के 90 μl और 10 माइक्रोन पेप्टाइड मिश्रण के 10 μl के संयोजन के द्वारा नियंत्रण रेखा-एमएस के लिए एक 1 माइक्रोन कमजोर पड़ने के 100 μl तैयार करते हैं।
    नोट: नमूना अब 1 प्रत्येक पेप्टाइड की माइक्रोन, वी / वी फार्मिक एसिड 0.1%, और 2% वी / वी ACN होता है, और नियंत्रण रेखा के आर एम परख के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है।

3. नियंत्रण रेखा के आर एम परख विकास

  1. एक नैनो प्रवाह एचपीएल का उपयोग करते हुए एमएस बन्दूक से बाहरी पेप्टाइड मानकों (इंजेक्शन प्रति प्रत्येक पेप्टाइड का मोटे तौर पर 1-10 pmol) के मिश्रण का विश्लेषण करेंएक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर (नियंत्रण रेखा-Qqq एमएस (/ एमएस)) के लिए युग्मित सी प्रणाली।
    1. सी -18 मीडिया (≤5 माइक्रोन व्यास, ~ 200 A है pores, लंबाई ≥10 सेमी, आईडी = 50-100 माइक्रोन) के साथ पैक एक केशिका स्तंभ के साथ सुसज्जित एक नियंत्रण रेखा एमएस प्रणाली और एक नैनो ईएसआई टिप (आमतौर पर उपयोग कर उत्पादन का प्रयोग करें एक लेजर डांड़ी)। प्रत्येक नियंत्रण रेखा एमएस रन एक ~ 60 मिनट रैखिक ढाल (आमतौर पर, 0-40% सॉल्वेंट बी), एक स्तंभ उत्थान कदम (~ 80% सॉल्वेंट बी), और एक कॉलम फिर से संतुलन कदम (~ 0% सॉल्वेंट बी शामिल हैं सुनिश्चित करें कि ) (विलायक एक = 0.1% v / वी एच में फार्मिक एसिड 2 हे, विलायक बी = 0.1% v / वी ACN में फार्मिक एसिड, प्रवाह की दर = 200-800 NL / मिनट, ईएसआई वोल्टेज = 1,800 वी, Q3 में अलगाव चौड़ाई = 0.7 मी / z, Q2 आर्गन दबाव = 1.5 mTorr)।
    2. प्रत्येक अग्रदूत आयन स्कैन के लिए, गतिशील रूप से शीर्ष चयन ~ मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) के लिए 10 सबसे तीव्र अग्रदूत आयनों। बेहतर + 2 अग्रदूत आयनों टुकड़ा के लिए बनाया गया एक है, और अन्य: दो अलग अलग टक्कर ऊर्जा रैंप उपयोग किया जाता है तो यह है कि दो प्रतियों में प्रत्येक नमूना चलाएँ3 के लिए अग्रदूत 41 आयनों।
    3. नियंत्रण रेखा-Qqq एमएस (/ एमएस) (Q2 में कम ऊर्जा आर्गन टक्करों से उत्पन्न अग्रदूत आयन चोटियों का पीछा पैदा कर सकता है Q1 के अग्रदूत आयन स्कैनिंग) Q3 के अग्रदूत आयन स्कैनिंग का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन।
    4. नियंत्रण रेखा एमएस प्रणाली क्यूसी नमूने और तकनीकी प्रतिकृति का विश्लेषण करके पर्याप्त रूप से प्रदर्शन कर रहा है कि सुनिश्चित करें। ताजा बना नियंत्रण रेखा कॉलम का उपयोग करके और नमूने के बीच कई कारतूस चलाकर नमूना carryover रोकें।
  2. बाहरी पेप्टाइड मानकों 42 के दृश्यों के खिलाफ खोज डेटाबेस का उपयोग जिसके परिणामस्वरूप बन्दूक नियंत्रण रेखा-Qqq एमएस (/ एमएस) के आंकड़ों का विश्लेषण करें। यदि उपयुक्त हो, पेप्टाइड पहचान आत्मविश्वास स्कोर (जैसे, उम्मीद मान) या सांख्यिकीय मॉडलिंग 42 का उपयोग कर का उपयोग कर अस्पष्ट पेप्टाइड पहचान त्यागें। भले ही, मैन्युअल रूप से वे सब स्पष्ट कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए पेप्टाइड पहचान 43 के सभी की समीक्षा करें।
  3. चुनाव के लिए बन्दूक एमएस पेप्टाइड पहचान का उपयोग करेंइस तरह के क्षितिज के रूप में एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर एक स्पेक्ट्रम पुस्तकालय struct।
    1. अग्रदूत आयन (प्रति 3-10 सबसे तीव्र संक्रमण का उपयोग एक नियंत्रण रेखा के आर एम संक्रमण सूची तैयार + 2 और 3 अग्रदूत आयनों, 1 और 2 टुकड़ा आयनों, y-, बी, और ≥2 अवशेष हैं कि एक-आयनों लंबे)।
    2. अग्रदूत और टुकड़ा आयन मी / z मूल्यों Qqq-एमएस की बड़े पैमाने पर माप सटीकता के भीतर ओवरलैप अगर अग्रदूत आयन विखंडन अधूरा कभी कभी होता है (एक संक्रमण त्यागें; monoisotopic और भारी प्राकृतिक आइसोटोप रूपों, साथ ही unlabeled विचार करने के लिए याद है और ) रूपों भारी लेबल।
    3. टुकड़ा आयन मी / z है कि एक ही अग्रदूत आयन से एक अलग टुकड़ा आयन की overlaps इसी तरह, अगर एक संक्रमण त्यागें।
  4. नियंत्रण रेखा के आर एम बाहरी पेप्टाइड मानकों के मिश्रण का विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण सूचियों का उपयोग करें (3.1 कदम के रूप में वर्णित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन, Q1 और Q3 के अलगाव चौड़ाई = 0.7 मी / z, समय ध्यान केन्द्रित करना = 2-50 मिसे)।
  5. माnually किसी भी खराब प्रदर्शन करने assays के (नियंत्रण रेखा-एस आर एम आंकड़ों के विश्लेषण धारा 5 में वर्णित है) जिसके परिणामस्वरूप नियंत्रण रेखा के आर एम डेटा की समीक्षा करने और हटाने के।

जैविक नमूने 4. नियंत्रण रेखा के आर एम Assays

  1. संवर्धित कोशिकाओं 44 के व्यंजन तैयार करते हैं। कई प्रयोगात्मक शर्तों, ब्लॉक तुलना में और किसी भी संभव व्यवस्थित पूर्वाग्रहों 45 कम करने के लिए नमूने randomize किया जा रहा है।
  2. कोशिकाओं में से प्रत्येक पकवान के लिए, एक सीरम मुक्त बफर 44 में कोशिकाओं को बर्बाद और निलंबित करने के लिए सेल संस्कृति के माध्यम महाप्राण। यदि आवश्यक हो, किसी भी शेष बाह्य प्रोटीन को हटाने के लिए एक सीरम मुक्त बफर में कोशिकाओं को धो लें।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए, एक व्यवहार्यता दाग (जैसे, trypan नीले रंग) और एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर 44 का उपयोग करके व्यवहार्य और कुल कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  4. Centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं, और 44 बर्बाद करने के लिए supernatants महाप्राण (एक ठेठ सेल गोली मात्रा 30 μl ~ है)।
  5. मोती रिसाव की तस्वीर-कैप ट्यूब पैदा कर सकता है कि ध्यान दें (~ युक्त 0.1 मिमी zirconia / सिलिका मोतियों की 100 μl कोमल pipetting का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने मिश्रण है, और (एक हे अंगूठी के साथ एक पेंच टोपी के साथ) एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रत्येक हस्तांतरण )। Lyse पूरी रफ्तार से 5 मिनट के लिए नमूने vortexing द्वारा कोशिकाओं (इस मनका पिटाई से कोशिकाओं lyses)।
    1. वैकल्पिक रूप से, (एक फ्रांसीसी प्रेस या homogenization के सुझावों का उपयोग, उदाहरण के लिए) एक अलग यांत्रिक विधि का उपयोग कोशिकाओं lyse।
      नोट: सेल lysates centrifuging बचें ओ.टी. सकता है कि इस उपजी प्रोटीन गोली सकता है क्योंकिherwise tryptically पचता है और नियंत्रण रेखा-एमएस द्वारा पता लगाया जा।
  6. पृष्ठसक्रियाकारक विकृत नमूने के लिए, नमूना homogenization और प्रोटीन विकृतीकरण की सहायता के लिए 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं।
  7. स्नान homogenization और प्रोटीन विकृतीकरण की सहायता के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने sonicate।
    नोट: lysates और lysis बफर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (lysis बफर कदम 4.9 और 4.13 के लिए आवश्यक हो जाएगा)।
  8. Lysates के एक प्रोटीन एकाग्रता परख 46 (जैसे, एक bicinchoninic एसिड परख) प्रदर्शन (और एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में lysis बफर के)।
  9. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में गुणात्मक विश्लेषण (यानी, कोई आंतरिक पेप्टाइड मानकों नुकीला-में किया जाएगा नमूने) सेल lysate की, पिपेट 200 माइक्रोग्राम (प्रोटीन मास) के लिए। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एक स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए चार तरह के नमूने तैयार करते हैं।
  10. प्रत्येक नमूने के लिए एक आंतरिक प्रोटीन मानक (जैसे <जोड़ने/ Em>) 98% शुद्ध जुगनू luciferase ~ की ~ 5 pmol जोड़ें।
  11. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, आंतरिक पेप्टाइड मानकों की equimolar मिश्रण के स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने श्रृंखला जोड़ने (उदाहरण के लिए, 0, 0.2, 2, प्रत्येक पेप्टाइड की 20 pmol) के नमूने लिए।
    1. समानांतर में, अकेले आंतरिक पेप्टाइड मानकों का प्रयोग नियंत्रण नमूने तैयार (यानी, कोई सेल lysate) (जैसे, 0, 0.2, 2, प्रत्येक पेप्टाइड की 20 pmol)।
    2. इसके अलावा बाह्य और आंतरिक पेप्टाइड मानकों का प्रयोग नियंत्रण नमूने तैयार (उदाहरण के लिए: 2 प्रत्येक बाहरी पेप्टाइड मानक के pmol, और 0, 0.2, 2, और प्रत्येक आंतरिक पेप्टाइड मानक के 20 pmol)।
      नोट: यह ट्रिप्सिन पाचन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में पेप्टाइड मानकों फार्मिक एसिड से मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  12. नमूने के सभी समान संस्करणों रहे हैं इतना है कि lysis बफर जोड़ें। नोट: एक ठेठ नमूना मात्रा 70 μl है, तो यह मात्रा इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  13. 0 जोड़कर प्रोटीन सिस्टीन अवशेषों को कम करें।प्रत्येक नमूने (अंतिम डीटीटी एकाग्रता मिमी 10) और 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूने incubating के लिए (हौसले से तैयार) 1 एम डीटीटी के 7 μl।
  14. Alkylate प्रोटीन बफर iodoacetamide के 7 μl जोड़कर cystines (500 मिमी iodoacetamide, 1 एम HEPES के ∙ NaOH के पीएच 8, हौसले से तैयार) प्रत्येक नमूने के लिए (अंतिम iodoacetamide एकाग्रता मिमी 50) है और अंधेरे में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने incubating (iodoacetamide प्रकाश के प्रति संवेदनशील है)। यदि आवश्यक हो, 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डीटीटी जोड़कर शेष iodoacetamide बुझा लेते हैं।
  15. नमूने के प्रत्येक यूरिया का उपयोग कर विकृत के लिए, (ट्रिप्सिन काफी> 1 एम यूरिया 47 में हिचकते हैं) अंतिम यूरिया एकाग्रता 1 एम इतना है कि 100 मिमी HEPES ∙ NaOH के पीएच 8 के 482 μl जोड़ें।
  16. Tryptically पेप्टाइड में प्रोटीन को पचाने।
    1. सेल lysate जिसमें प्रत्येक नमूना के लिए, 0.5 माइक्रोग्राम / μl अनुक्रमण ग्रेड संशोधित trypsin के 8 μl जोड़ सकते हैं ताकि अंतिम ट्रिप्सिन concentratट्रिप्सिन: नमूना, और 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं: आयन 01:50 (डब्ल्यू प्रोटीन डब्ल्यू) है।
    2. सेल lysate शामिल नहीं करता है कि प्रत्येक नमूने, 0.5 माइक्रोग्राम / μl अनुक्रमण ग्रेड संशोधित trypsin के 0.5 μL जोड़ें, और 2 घंटा (इन नमूनों में से प्रत्येक नियंत्रण प्रयोगों के लिए कर रहे हैं, और आम तौर पर केवल 10 एनजी को शामिल करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते के लिए पेप्टाइड + प्रोटीन जन के -10 माइक्रोग्राम)।
  17. यूरिया विकृत नमूने से प्रत्येक के लिए, 2% वी / वी फार्मिक एसिड के 440 μl जोड़ने (अंतिम फार्मिक एसिड एकाग्रता 1% वी है / वी)। इन नमूनों पीएच ~ 3 पुष्टि करते हैं कि।
    1. पृष्ठसक्रियाकारक विकृत नमूने के प्रत्येक 0.5% वी के 914 μl जोड़ें के लिए / TFA के वी (अंतिम TFA के एकाग्रता 0.5% वी है / वी)। इन नमूनों पीएच ~ 1.5 पुष्टि करते हैं कि। 60 मिनट पृष्ठसक्रियाकारक hydrolyze करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इन नमूनों को सेते हैं।
  18. Microcentrifuge नमूने के सभी पृष्ठसक्रियाकारक पूंछ समूह और किसी भी अन्य prec गोली कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 21,000 × छ परएक सी -18 एसपीई कारतूस रोकना होगा कि ipitates।
  19. ठोस चरण एक डिस्पोजेबल सी -18 एसपीई कारतूस का उपयोग कर supernatants में से प्रत्येक को निकालने (बफर एक = 0.1% v / वी फार्मिक एसिड, बफर बी = 0.1% v / वी फार्मिक एसिड, 80% वी / वी ACN; ~ 100 मिलीग्राम सी कारतूस प्रति 18 राल)। या 5 मिनट के लिए 10 × जी पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कारतूस centrifuging द्वारा एक निष्कर्षण कई गुना का उपयोग करते हुए, एक फ्लैट सामने रबर बल्ब का उपयोग सी -18 एसपीई कारतूस के माध्यम से मोबाइल चरणों बाध्य करें।
    1. बफर बी के 1 मिलीलीटर लगाने से स्तंभ गीला, दो बार, बफर के 1 मिलीलीटर लगाने से यह संतुलित करना नमूना लागू होते हैं, और दो बार बफर के 1 मिलीलीटर लगाने से कारतूस धो लें। धीरे-धीरे बफर बी के 1 मिलीलीटर लागू करने (~ 2 मिनट) द्वारा पेप्टाइड्स elute।
  20. ACN दूर लुप्त हो जाना करने के लिए 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए एक वैक्यूम concentrator में प्रत्येक eluate ध्यान लगाओ। प्रत्येक नमूने के लिए एच 2 ओ के 200 μl जोड़ें, और किसी भी संभव पुन दूर लुप्त हो जाना 98 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए एक वैक्यूम concentrator में प्रत्येक ध्यान केंद्रितmaining ACN।
  21. प्रत्येक नमूने के लिए ACN में 2 μL 5% की वी / वी फार्मिक एसिड जोड़ें (अंतिम नमूना सांद्रता 0.1% v / वी फार्मिक एसिड, 2% वी / वी ACN) कर रहे हैं।
    नोट: नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  22. (3.4 कदम के रूप में) नियंत्रण रेखा के आर एम का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण करें। गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम विश्लेषण के लिए, जैविक नमूने और बाहरी पेप्टाइड मानकों चलाते हैं, और एक साथ परिणामी डेटा के सभी विश्लेषण। मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम विश्लेषण के लिए, प्रत्येक जैविक नमूने का आइसोटोप कमजोर पड़ने श्रृंखला चलाने के लिए, और भी अकेले पेप्टाइड मानकों से मिलकर नमूने चलाते हैं, और एक साथ परिणामी डेटा के सभी विश्लेषण।

5. नियंत्रण रेखा के आर एम डेटा विश्लेषण

नोट: पेप्टाइड पहचान और मात्रा का ठहराव अत्यधिक सरल और आंशिक रूप से इस तरह के क्षितिज के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्वचालित है, लेकिन यह अभी भी दृढ़ता से सभी डेटा एनोटेशन मैन्युअल रूप से समीक्षा की जानी सिफारिश की है कि किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पुस्तिका annot दौरान प्रोटीन के स्तर की जानकारी बाहर करने के लिए सबसे अच्छा हैनियंत्रण रेखा के आर एम डेटा का समझना पूर्वाग्रह को रोकने के लिए।

  1. प्रत्येक पेप्टाइड पहचान के लिए, प्रत्येक संक्रमण क्षालन प्रोफ़ाइल के आकार मोटे तौर पर गाऊसी है कि इस बात की पुष्टि। प्रत्येक संक्रमण के लिए, क्षालन प्रोफाइल एमएस डिटेक्टर द्वारा मापा कई संकेतों के उत्पाद है कि इस बात की पुष्टि (यानी, एमएस शोर के एक या दो यादृच्छिक spikes के उत्पाद नहीं है)।
  2. प्रत्येक पेप्टाइड पहचान के लिए, पूरे पेप्टाइड क्षालन प्रोफाइल चयन किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के। पेप्टाइड पहचान (भारी लेबल पेप्टाइड फार्म, unlabeled फार्म, व्यक्तिगत अग्रदूत आयनों, और व्यक्तिगत संक्रमण) का subcomponents की क्षालन प्रोफाइल सीमाओं को एडजस्ट करने के लिए मैन्युअल रूप से बचें।
  3. प्रत्येक संक्रमण क्षालन प्रोफ़ाइल एक संकेत करने वाली शोर अनुपात (एस / एन) ≥3 है कि पुष्टि करें। नोट: "शोर" coeluting analytes से संकेत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए नहीं, यादृच्छिक एमएस शोर को दर्शाता है। Chromatogram चौरसाई कार्यों को काफी शोर डेटा के विश्लेषण की सहायता कर सकते हैं।
  4. प्रत्येक पेप्टाइड पहचान के लिए,संक्रमण के सभी लगभग समान क्षालन प्रोफाइल है कि इस बात की पुष्टि (न सिर्फ बराबर चोटी सुप्रीम बार; क्षालन प्रोफाइल अलग आयाम हो सकता है)।
  5. नियंत्रण रेखा के आर एम पेप्टाइड मानकों (प्रत्येक पेप्टाइड का आम तौर पर ≥100 fmol) की एक बड़ी मात्रा का विश्लेषण के लिए, इसी पेप्टाइड क्षालन प्रोफाइल को पेप्टाइड पहचान स्पष्ट कर रहे हैं, और कहा कि (आम तौर पर ≥100 एन / एस) बहुत तीव्र होते हैं, इसकी पुष्टि। नोट: ये अत्यधिक आत्मविश्वास पहचान इसी जैविक नमूने व्युत्पन्न पेप्टाइड्स की पहचान के लिए महत्वपूर्ण होगा।
  6. प्रत्येक पेप्टाइड पहचान के लिए, रिश्तेदार संक्रमण तीव्रता आत्मविश्वास से पहचान पेप्टाइड मानक के उन मैच की पुष्टि करें। यदि आवश्यक हो, शोर, अपेक्षाकृत कम तीव्रता संक्रमण क्षालन प्रोफाइल को त्यागें, लेकिन अपेक्षाकृत तीव्र संक्रमण की है कि कोई याद कर रहे हैं की पुष्टि करें। काफी और असंदिग्ध रूप से एक सह द्वारा प्रभावित होते हैं जो अपेक्षाकृत तीव्र संक्रमण क्षालन प्रोफाइल को उपेक्षादूषित पदार्थों को eluting।
  7. प्रत्येक पेप्टाइड पहचान के लिए, यह (coeluting analytes से यादृच्छिक एमएस शोर प्लस प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत) पृष्ठभूमि संकेत द्वारा बेतरतीब ढंग से पेश किया गया है कि संभावना का अनुमान है।
    1. पूरे नियंत्रण रेखा के आर एम वर्णलेख जांच और प्रत्येक पेप्टाइड पहचान की विशिष्टता का आकलन करके मैन्युअल रूप से इस संभावना का अनुमान है। 5% की अनुमानित झूठे खोज की दर (एफडीआर) है विश्वास है कि पेप्टाइड पहचान का एक सेट का उत्पादन। सख्त मापदंड पहचान का सेट एक उच्च विश्वास आवश्यक है, तो (पराजित मापदंड का उपयोग अनुशंसित नहीं है) (जैसे, एफडीआर ≤1%) का प्रयोग करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, mProphet एल्गोरिथ्म 48 या लेखा परीक्षा एल्गोरिथ्म 49 उपयोग करें, लेकिन मैन्युअल रूप से परिणामों की समीक्षा करें।
  8. प्रत्येक पेप्टाइड पहचान के लिए, मनाया क्षालन समय (क्षितिज इस गणना प्रदर्शन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है) पेप्टाइड की hydrophobicity के साथ संगत है कि इस बात की पुष्टि।
  9. प्रत्येक पेप्टाइड के लिए, यह पुष्टि करते हैंइसके क्षालन समय नियंत्रण रेखा रन भर के अनुरूप है।
    नोट: नियंत्रण रेखा के आर एम कभी कभी व्यवस्थित ढंग से रन के बीच विषम रहे हैं कि क्षालन प्रोफाइल उत्पादन विश्लेषण करती है। सिस्टमैटिक पारियों में इस तरह के एक कॉलम की जगह के रूप साधन परिवर्तन के बाद उम्मीद की जा रही हैं। इसके अलावा, जल्दी eluting पेप्टाइड्स (स्तंभ क्षमता के करीब भरी हुई है, खासकर अगर) स्थानांतरण होने का खतरा हो सकता है, और देर eluting पेप्टाइड्स भी स्थानांतरण होने का खतरा हो सकता है। पेप्टाइड पहचान अब पूरा हो गया है।
  10. पेप्टाइड मात्रा का ठहराव में सुधार करने के लिए, प्रत्येक पेप्टाइड पहचान reinspect और यह पेप्टाइड पहचान के अन्य संक्रमण क्षालन प्रोफाइल्स की तुलना में विशेष रूप से शोर है अगर एक संक्रमण क्षालन प्रोफाइल त्यागें। उसके रिश्तेदार संक्रमण तीव्रता (पेप्टाइड मानक की तुलना में) गलत है अगर एक संक्रमण क्षालन प्रोफाइल त्यागें।
  11. प्रत्येक अग्रदूत आयन और संक्रमण क्षालन प्रोफाइल की सीमाओं का निरीक्षण किया। यदि आवश्यक हो, ध्यान से पृष्ठभूमि संकेत दूर की फसल के लिए क्षालन प्रोफाइल सीमाओं को समायोजित (या मैं करने के लिएmprove पृष्ठभूमि संकेत आकलन)।
  12. यह प्रकाश पेप्टाइड का पता लगाने योग्य राशि के साथ दूषित है, तो प्रत्येक आंतरिक पेप्टाइड मानक के लिए, (नियंत्रण रेखा-एस आर एम द्वारा निर्धारित ऊपर वर्णित है, अकेले आंतरिक पेप्टाइड मानकों का विश्लेषण करती है) की जाँच करें। इसके बाद काफी आंतरिक पेप्टाइड मानकों के भीतर प्रकाश पेप्टाइड संदूषण से समझौता किया गया है कि किसी भी प्रकाश पेप्टाइड क्षालन प्रोफाइल को त्यागें।
  13. इसके नियंत्रण रेखा शिखर क्षेत्र की गणना के द्वारा प्रत्येक संक्रमण क्षालन प्रोफाइल यों। यदि उपयुक्त हो, अनुमानित पृष्ठभूमि संकेत घटा देते हैं। इसी संक्रमण मात्रा का ठहराव मूल्यों संक्षेप द्वारा प्रत्येक पेप्टाइड क्षालन प्रोफाइल यों (इसके बाद, इस 'Sum_Peak_Area "मूल्य के रूप में जाना जाता है)। आंतरिक या बाह्य पेप्टाइड मानकों के प्रत्येक जैविक नमूने पेप्टाइड Sum_Peak_Area मूल्य के लिए, से डेटा का उपयोग जैविक नमूने पेप्टाइड दाढ़ बहुतायत गणना नियंत्रण रेखा के आर एम (प्रयोग सफलतापूर्वक दोनों जैविक नमूने पेप्टाइड द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है कि केवल बदलावनियंत्रण रेखा के आर एम और पेप्टाइड मानक की है कि)।
    1. बाहरी पेप्टाइड मानकों (अनुशंसित नहीं) का उपयोग मात्रा:
      1. बाहरी पेप्टाइड मानक दाढ़ बहुतायत मूल्यों बनाम बाहरी पेप्टाइड मानक Sum_Peak_Area मूल्यों प्लॉट। डेटा के लिए एक रेखीय प्रतिगमन फिटिंग द्वारा एक मानक वक्र निर्माण (आमतौर पर, गतिशील रेंज के केवल रैखिक घटक इस्तेमाल किया जाना चाहिए, किसी भी अरेखीय घटक अत्यधिक सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए)। प्रत्येक जैविक नमूने पेप्टाइड Sum_Peak_Area मूल्य के लिए, पेप्टाइड दाढ़ बहुतायत गणना करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें।
        नोट: यह जैविक नमूने और बाहरी पेप्टाइड मानकों को अलग से नियंत्रण रेखा के आर एम द्वारा तैयार की और विश्लेषण कर रहे हैं क्योंकि नमूना तैयार करने और नियंत्रण रेखा के आर एम प्रदर्शनीयता मजबूत होने की आवश्यकता है क्योंकि यह मात्रा का ठहराव विधि की सिफारिश नहीं है। इसके अलावा, यह मैट्रिक्स प्रभाव (विश्लेष्य के अलावा किसी अन्य नमूना के घटकों के कारण प्रभाव) के लिए खाते में नहीं है।
    2. आंतरिक का उपयोग कर मात्रापेप्टाइड मानकों (अनुशंसित):
      1. प्रत्येक जैविक नमूने पेप्टाइड Sum_Peak_Area मूल्य और इसी भारी लेबल आंतरिक पेप्टाइड मानक Sum_Peak_Area मूल्य के लिए, प्रकाश / भारी अनुपात की गणना। जैविक नमूने पेप्टाइड की दाढ़ बहुतायत की गणना करने के लिए इसी प्रकाश / भारी पेप्टाइड दाढ़ बहुतायत अनुपात का एक उपाय के रूप में इस अनुपात का प्रयोग करें। विशेष रूप से, जैविक नमूने पेप्टाइड दाढ़ बहुतायत प्रकाश / भारी Sum_Peak_Area अनुपात से गुणा आंतरिक पेप्टाइड मानक दाढ़ बहुतायत के बराबर होती है।
      2. प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए और लक्ष्य पेप्टाइड के लिए, एक रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर एक मानक वक्र बनाने के द्वारा नियंत्रण रेखा के आर एम मात्रा का ठहराव के रैखिक सीमा की पहचान। विशेष रूप से, भारी / प्रकाश Sum_Peak_Area अनुपात मूल्यों बनाम आंतरिक पेप्टाइड मानक दाढ़ बहुतायत मूल्यों साजिश (जैविक नमूने बड़े पैमाने डाटासेट भर में स्थिर है कि ध्यान दें)। प्रत्येक जैविक नमूने पेप्टाइड Sum_Peak_Area मूल्य रैखिक सीमा के भीतर है कि (typic की आवश्यकता होती हैसहयोगी, गतिशील रेंज के केवल रैखिक घटक इस्तेमाल किया जाना चाहिए; किसी भी अरेखीय घटक) अत्यधिक सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए। इसी तरह, प्रत्येक लक्ष्य पेप्टाइड संक्रमण के लिए यह कदम प्रदर्शन करते हैं।
        नोट: नियंत्रण रेखा-Qqq-एस आर एम द्वारा analyte मात्रा का ठहराव एक व्यापक गतिशील रेंज (~ 10,000) से अधिक रैखिक होना चाहिए। कम अंत में, पृष्ठभूमि संकेत (यादृच्छिक एमएस शोर प्लस coeluting analytes से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत) मात्रा का ठहराव सटीकता और परिशुद्धता कम हो जाएगा। उच्च अंत में, डिटेक्टर संतृप्ति (अंततः, इस क्षालन प्रोफाइल एक विशिष्ट संकेत तीव्रता में फ्लैट शुरू होने पैदा कर सकता है) nonlinearity के कारण होगा।
  14. यदि उपयुक्त हो, पूर्व आंतरिक पेप्टाइड मानकों के spiking-इन करने के लिए नमूना मात्रा में मामूली अंतर के लिए सही करने के लिए इस तरह के एक केंद्रीय प्रवृत्ति को सामान्य बनाने के रूप में 50 नमूने, भर में एक वैश्विक सामान्य बनाने प्रदर्शन करते हैं। यदि आवश्यक हो, 1.1 कदम से केवल हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करें।
  15. यदि आवश्यक हो, quantificat लापता मढ़नाआयन 51,52 महत्व देता है।
    यह ऐसा करने से कृत्रिम रूप से मात्रा का ठहराव विचरण कम होगी क्योंकि बस मात्रा का ठहराव (LLOQ) या पहचान (लोद) के आधे से सीमा के आधे से कम सीमा के साथ लापता मूल्यों को बदलने के लिए अनुचित है, और (एक सांख्यिकीय परीक्षा में उदाहरण के लिए, एक एनोवा परिणाम सकता है: नोट ) एक झूठी सकारात्मक परिणाम उत्पादन (एक प्रकार मैं त्रुटि)। हालांकि, लापता मूल्यों की अनदेखी भी समस्याग्रस्त किया जा सकता है। आधा सच बहुतायत मूल्यों लोद से नीचे हैं, और दूसरे आधे LLOQ से ऊपर हैं, तो उदाहरण के लिए, तो मतलब सच बहुतायत मतलब overestimate होगा बहुतायत मनाया।
  16. Assays के नियंत्रण रेखा के आर एम 23-25 ​​के लिए मोटे तौर पर स्वीकार किए जाते हैं दिशा निर्देशों को पूरा सुनिश्चित करें। विशेष रूप से, मात्रा का ठहराव मूल्यों की विभिन्नता का गुणांक आमतौर पर नैदानिक ​​assays के लिए ≤25%, और गैर चिकित्सीय assays के 25 के लिए ≤35% है कि आवश्यकता होती है। नियामक अनुप्रयोग के लिए विचार किया जाना है कि स्वास्थ्य सेवा या पशु चिकित्सा उत्पादों या सेवाओं से संबंधित नियंत्रण रेखा के आर एम assays के लिएroval, assays के ऐसे assays के लिए सख्त सटीक आवश्यकताओं को संतुष्ट है कि आवश्यकता होती है: "प्रत्येक एकाग्रता के स्तर पर निर्धारित सटीक इसके बारे में 20% से अधिक नहीं होना चाहिए जहां LLOQ, के लिए छोड़कर विभिन्नता का गुणांक (सीवी) के 15% से अधिक नहीं होना चाहिए सीवी "23,24।

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Representative Results

संकेत पारगमन रास्ते के भविष्य कहनेवाला कम्प्यूटेशनल मॉडल के विकास सिस्टम्स बायोलॉजी 53 के बुनियादी लक्ष्यों में से एक है। दुर्भाग्य से, यहां तक कि बड़े पैमाने पर अध्ययन किया और एक उच्च नैदानिक ​​महत्व दिया गया है कि रास्ते संकेतन के लिए, यह मात्रात्मक perturbations के जवाब में मार्ग व्यवहार की भविष्यवाणी करने के लिए आम तौर पर अभी भी संभव नहीं है (उदाहरण के लिए, इस MAPK / ERK मार्ग 54 के लिए सच है)। हाल ही में, एक जांच मार्ग 56 सिगनल माउस बृहतभक्षककोशिका कीमोटैक्सिस अध्ययन करने के लिए लक्षित प्रोटिओमिक्स, transcriptomics, और कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग और सिमुलेशन कार्यरत हैं। जांच का फोकस रॉ 264.7 कोशिकाओं (एक माउस monocyte / बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन) के sphingosine-1-फॉस्फेट मध्यस्थता कीमोटैक्सिस था। मार्ग मॉडलिंग की सुविधा के लिए, नियंत्रण रेखा-एस आर एम assays के विकसित और रॉ 264.7 कोशिकाओं के भीतर कीमोटैक्सिस मार्ग प्रोटीन की पूर्ण बहुतायत को मापने के लिए प्रदर्शन किया गया। जिसके परिणामस्वरूप बहुतायत मूल्यों का उपयोग कर रहे थेमार्ग मॉडल के मापदंडों के रूप में डी।

समग्र प्रायोगिक योजना (चित्रा 1) जी I2, एक heterotrimeric जी प्रोटीन α-सबयूनिट शामिल है जो लक्ष्य प्रोटीन की एक सूची के साथ शुरू हुआ। समग्र प्रोटोकॉल की सफलता इस तरह के YDEAASYIQSK के रूप में proteotypic और quantotypic हैं कि पेप्टाइड लक्ष्य के चयन पर निर्भर है। बाहरी पेप्टाइड मानकों के मिश्रण से तैयार है और बन्दूक नियंत्रण रेखा-Qqq एमएस (/ एमएस) द्वारा विश्लेषण किया गया। जिसके परिणामस्वरूप YDEAASYIQSK मिलकर जन स्पेक्ट्रम कई टुकड़ा आयनों से बना है, और यह एक कम पृष्ठभूमि (चित्रा 2) था। स्पेक्ट्रा अग्रदूत आयन प्रति शीर्ष दस सबसे तीव्र टुकड़ा आयनों युक्त नियंत्रण रेखा के आर एम लक्ष्य सूचियों शांत करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

409 बाहरी पेप्टाइड मानकों ("JPT409") का एक मिश्रण गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम द्वारा तीन प्रतियों में विश्लेषण किया गया था (डेटा) नहीं दिखाया। यह नमूना तीन जी I2 पेप्टाइड्स शामिल है, और सभी तीन की पहचान थीआत्मविश्वास से मुलजिम। बाद में, रॉ 264.7 नमूने (जैविक प्रतिकृति "RAW1" और "RAW2") और JPT409 नमूना प्रत्येक गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम द्वारा दो प्रतियों में (दो नियंत्रण रेखा के आर एम तकनीकी प्रतिकृति) विश्लेषण किया गया (इनमें छह नियंत्रण रेखा के आर एम इसी प्रकार के रूप में के रूप में प्रदर्शन किया गया विश्लेषण संभव हो)। (- सी आंकड़े 3 ए) YDEAASYIQSK पेप्टाइड आत्मविश्वास से सभी छह विश्लेषण में पहचान की थी। छह नियंत्रण रेखा के आर एम का विश्लेषण करती भर YDEAASYIQSK संक्रमण तीव्रता पैटर्न संगत कर रहे थे, और इन बन्दूक नियंत्रण रेखा-एमएस (/ एमएस) पैटर्न ("पुस्तकालय" चित्रा -3 सी के दोहराने) करने के लिए मोटे तौर पर इसी तरह के थे।

संक्रमण तीव्रता के पैटर्न अकेले हमेशा एक पेप्टाइड का पूरा भरोसा पहचान के लिए पर्याप्त नहीं है। पेप्टाइड hydrophobicity और मापा नियंत्रण रेखा अवधारण समय के अनुरूप होना चाहिए। इसके अलावा, बाहरी पेप्टाइड मानकों और इसी जैविक नमूने पेप्टाइड्स लगभग होनी चाहिएबराबर प्रतिधारण बार। और YDEAASYIQSK मनाया प्रतिधारण समय (SSRCalc संस्करण 3.0 100 एक एल्गोरिथ्म 55 का उपयोग कर अनुमानित) hydrophobicity संगत (चित्रा -4 ए) होना पाया गया है। इसके अलावा, YDEAASYIQSK अवधारण समय रॉ 264.7 विश्लेषण और बाहरी पेप्टाइड मानकों का विश्लेषण करती है, दोनों का उपयोग मापा जाता है, और अवधारण समय मूल्यों के सभी (4B चित्रा) लगभग बराबर थे।

गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम के सबसे जैविक नमूने का विश्लेषण करती है, इसलिए भारी लेबल, शुद्ध, इसी सफल रहे थे आंतरिक पेप्टाइड मानकों तैयार है और नुकीला-में रॉ 264.7 सेल lysates गया मात्रा निर्धारित। आइसोटोप कमजोर पड़ने श्रृंखला नियंत्रण रेखा के आर एम अकेले आंतरिक पेप्टाइड मानकों (नमूना "R0"), आंतरिक और बाह्य पेप्टाइड मानकों (नमूना "आर 1"), और छह रॉ 264.7 जैविक प्रतिकृति (नमूने "आर 2" से मिलकर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था - "R7")। दो विभिन्नNT प्रोटीन denaturants सटीक लक्ष्य प्रोटीन मात्रा का ठहराव कमजोर हो सकता है कि किसी भी संभव प्रोटीन solubilization, विकृतीकरण, alkylation, और / या पाचन समस्याओं के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया (नमूने आर 2-R4 यूरिया का इस्तेमाल किया, और नमूने आर 5-R7 के RapiGest एस एफ) का इस्तेमाल किया। YDEAASYIQSK के प्रकाश और भारी रूपों लगभग समान संक्रमण तीव्रता पैटर्न और क्षालन प्रोफाइल (- सी आंकड़े 5A) होता है। नियंत्रण रेखा के आर एम शिखर क्षेत्र अनुपात रिश्तेदार पेप्टाइड बहुतायत के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और YDEAASYIQSK अनुपात रॉ 264.7 सेल प्रति प्रतियों की इकाइयों में जी I2 बहुतायत मूल्यों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया अभिव्यक्त किया है। समानांतर में, एक दूसरे जी आंतरिक पेप्टाइड मानक (IAQSDYIPTQQDVLR) एक ही कच्चे 264.7 नमूनों की मात्रात्मक जी I2 नियंत्रण रेखा के आर एम assays के प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और दो ​​assays के जैविक प्रतिकृति के सभी भर में अत्यधिक इसी तरह जी I2 बहुतायत माप का उत्पादन i2 (चित्रा 5D)। दो जी की सहमति I2 नियंत्रण रेखा के आर एम assays के सब है कि सही और सटीक थे।

कुल मिलाकर, 35 प्रोटीन 58 आंतरिक पेप्टाइड मानकों (तालिका 1) का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया। विशेष रूप से, आंतरिक प्रोटीन मानक के नियंत्रण रेखा के आर एम assays के (जुगनू luciferase; चरण 4.11) सही और सटीक थे। इस जांच से क्षितिज डेटा का व्यापक सेट (https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view पर Manes_RAW_Chemotaxis फ़ोल्डर में) पैनोरमा ऑनलाइन नियंत्रण रेखा के आर एम डेटाबेस में उपलब्ध है।

चित्र 1
चित्रा 1:। जी I2 के लिए प्रोटोकॉल तीन अस्थायी लक्ष्य पेप्टाइड्स का अवलोकन (एक heterotrimeric जी प्रोटीन α-सबयूनिट) बाहरी पेप्टाइड मानक संश्लेषण के लिए चयन किया गया था। ये analy थेतीन जी I2 नियंत्रण रेखा के आर एम assays के विकसित करने के लिए बन्दूक नियंत्रण रेखा-एमएस (/ एमएस) द्वारा जेड, और इन assays जैविक नमूने के गुणात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। सभी तीन जी I2 लक्ष्य पेप्टाइड्स की पहचान की गई है, और दो ​​आंतरिक पेप्टाइड मानक तैयार करने के लिए चयन किया गया था। ट्रिप्सिन-cleavable "जेपीटी-टैग" यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करते हुए आंतरिक पेप्टाइड मानकों यों के लिए इस्तेमाल किया गया। आंतरिक पेप्टाइड मानकों रॉ 264.7 नमूनों की मात्रात्मक जी I2 नियंत्रण रेखा के आर एम assays के प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। शॉटगन नियंत्रण रेखा-एमएस (/ एमएस) दर्शाया जन स्पेक्ट्रम जी I2 बाहरी पेप्टाइड मानकों (YDEAASYIQSK) में से एक के विश्लेषण से जन्म लिया है। इस अग्रदूत के लिएशीर्ष दस सबसे तीव्र संक्रमण (इसकी वजह से कम लंबाई को A1 1+ टुकड़ा आयन को छोड़कर) नियंत्रण रेखा के आर एम के लिए चयन किया गया था आयन,। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। जी I2 के गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम JPT409 से YDEAASYIQSK वर्णलेख एक बहुत कम पृष्ठभूमि निहित विश्लेषण करती है और पेप्टाइड विश्वास (ए) की पहचान की थी। इसी रॉ 264.7 विश्लेषण अधिक पृष्ठभूमि संकेत के परिणामस्वरूप, लेकिन पेप्टाइड पहचान अभी भी स्पष्ट (बी) था। रिश्तेदार संक्रमण तीव्रता पैटर्न सभी छह नियंत्रण रेखा के आर एम (तीन स्वतंत्र नमूनों की दो तकनीकी प्रतिकृति) का विश्लेषण करती भर में संगत कर रहे थे, और इन मोटे तौर पर सिमी थेइसी बन्दूक नियंत्रण रेखा-एमएस (/ एमएस) पैटर्न ("पुस्तकालय" दोहराने) (सी) के लिए LAR। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
रन के पार पेप्टाइड अवधारण समय की भविष्यवाणी और बदलाव एक रेखीय प्रतिगमन का अनुमान hydrophobicity उपयोग कर की गणना और लक्ष्य पेप्टाइड्स के सभी के गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम क्षालन समय मापा जाता है, और YDEAASYIQSK की भविष्यवाणी की है और मापा क्षालन बार संगत कर रहे थे (एक): चित्रा 4। । साथ ही, नियंत्रण रेखा के आर एम भर में प्रत्येक पेप्टाइड मनाया क्षालन समय की निरंतरता निर्धारित किया गया था विश्लेषण करती है। YDEAASYIQSK की क्षालन बार इस्तेमाल किया गया था कि नियंत्रण रेखा के आर एम साधन की शुद्धता के अनुरूप था जो ~ 40 सेकंड की एक सीमा (मान फैलाशिखर सुप्रीम समय +/- आधा अधिकतम पर पूरी चौड़ाई, और भी चोटी के आधार) (बी) पर पूरी चौड़ाई कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। दर्शाया जी I2 के मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम जैविक नमूने पेप्टाइड (ए) और लगातार सापेक्ष संक्रमण तीव्रता था आंतरिक पेप्टाइड मानक (बी) के संक्रमण chromatograms, और अभिव्यक्त किया गया (सी) ("R2" के विश्लेषण है YDEAASYIQSK के लिए) 10 fmol आंतरिक पेप्टाइड मानक का उपयोग। प्रकाश और भारी क्षालन प्रोफाइल (सी) के अनुरूप थे, और इन घटता के तहत क्षेत्र के अनुपात निम्न आय वर्ग के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया थाहिंदुस्तान टाइम्स / भारी पेप्टाइड बहुतायत। एक दूसरा जी I2 आंतरिक पेप्टाइड मानक (IAQSDYIPTQQDVLR) समानांतर में मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम के लिए इस्तेमाल किया गया था, और जिसके परिणामस्वरूप जी I2 बहुतायत मूल्यों छह जैविक प्रतिकृति और कुल मिलाकर दो लक्ष्य पेप्टाइड्स (दोनों भर में संगत कर रहे थे, एन = 12 और CV = 8.38 %) (डी)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 68,467
UniProt परिग्रहण लक्ष्य प्रोटीन लक्ष्य पेप्टाइड बहुतायत (fmol / माइक्रोग्राम) बहुतायत (प्रतियां / सेल, सामान्यीकृत) सीवी
P08659 Luciferase (280 एनएम पर यूवी) 23.824 N / A N / A
P08659 Luciferase VVDLDTGK 24.103 N / A 7%
P08659 Luciferase VVPFFEAK 24.717 N / A 4%
P60710 Actin, cytoplasmic 1 IWHHTFYNELR 760.448 61,762,598 3%
P16858 GAPDH LISWYDNEYGYSNR 357.803 28,906,524 14%
P06151 लैक्टेट डीहाइड्रोजिनेज LLIVSNPVDILTYVAWK 129.623 10,633,145 30%
P99024 ट्यूबिलिन β 5 ALTVPELTQQVFDAK 78.765 6,398,971 3%
P20152 Vimentin SLYSSSPGGAYVTR 121.100 9,807,488 10%
P60766 CDC42 DDPSTIEK 86.647 6,957,317 27%
P60766 CDC42 QKPITPETAEK 26.475 2,153,669 6%
Q8C3J5 DOCK2 ETLYETIIGYFDK 1.459 118,539 15%
Q8C3J5 DOCK2 ISSSPTHSLYVFVR 1.795 143,440 33%
Q8BPU7 ELMO1 ALTTKPSSLDQFK 2.302 186,754 7%
Q8BPU7 ELMO1 SAIDISILQR 1.244 99,728 25%
Q8BGM0 FGR GAYSLSIR 1.099 89,473 17%
Q8BGM0 FGR WTAPEAALFGR 0.319 24,766 6%
P27601 Gα 13 GIHEYDFEIK 0.843 15%
P27601 Gα 13 VFLQYLPAIR 1.295 106,176 23%
P08752 Gα (मैं) 2 IAQSDYIPTQQDVLR 10.900 885,701 2%
P08752 Gα (मैं) 2 YDEAASYIQSK 9.774 790,616 9%
Q9DC51 Gα (कश्मीर) EYQLNDSASYYLNDLDR 6.574 537,862 15%
Q9DC51 Gα (कश्मीर) ISQTNYIPTQQDVLR 3.504 285,784 10%
P62874 Gβ 1 AGVLAGHDNR 17.078 1,385,578 4%
Q9CXP8 Gγ 10 DALLLGVPAGSNPFR 2.167 179,178 36% P63213 Gγ 2 EDPLLTPVPASENPFR 3.284 266,360 8%
Q80SZ7 Gγ 5 VSQAAADLK 6.087 493,512 6%
P08103 HCK GPVYVPDPTSSSK 1.143 93,044 12%
P08103 HCK IIEDNEYTAR 0.944 77,147 19%
P43406 Integrin से α वी AGTQLLAGLR 0.276 22,264 32%
P43406 Integrin से α वी SHQWFGASVR 0.443 34,235 5%
P25911 Lyn VIEDNEYTAR 1.461 119,377 13%
Q5SW28 PI3K नियामक 5 AGFPGILDTASPGK 0.301 24,331 1 1%
Q8K3B3 PI3K नियामक α LYEEYTR 0.472 38,592 16%
Q8K3B3 PI3K नियामक α TWNVGSSNR 0.524 42,697 12%
Q8K3B3 PI3K नियामक α VLSEIFSPVLFR 0.440 35,902 20%
Q5U3K7 PI3K नियामक β DTPDGTFLVR 0.188 15,262 30%
Q5U3K7 PI3K नियामक β IAEIHESR 0.282 22,561 13%
Q0VGQ5 PI3K α LINLTDILK 0.102 8494 38%
Q8CI98 PI3K δ HEVQEHFPEALAआर 0.178 14,566 22%
Q8CI98 PI3K δ ITEEEQLQLR 0.481 38,709 24%
Q9ES52 PIP3 5-फॉस्फेट 1 IVVLAKPEHENR 0.486 39,194 19%
Q9ES52 PIP3 5-फॉस्फेट 1 LSQLTSLLSSIEDK 2.056 167,123 7%
Q69ZK0 PIP3 निर्भर आरएसी जीईएफ 1 DSVLSYTSVR 0.647 52,712 32%
Q69ZK0 PIP3 निर्भर आरएसी जीईएफ 1 NQLLLALLK 0.354 27,425 5%
Q9CQE5 RGS 10 ASSQVNVEGQSR 2.460 199,782 4%
Q9CQE5 RGS 10 WASSLENLLEDPEGVQR 20.647 206,005 1 1%
Q9CX84 RGS 19 AEANQHVVDEK 0.495 39,753 21%
Q9CX84 RGS 19 LIYEDYVSILSPK 0.846 68,481 22%
B9EKC3 रो गैप 5 DGLAQELANEIR 0.448 34,653 10%
Q99PT1 रो GDI 1 SIQEIQELDK 3.156 267,063 16%
Q99PT1 रो GDI 1 VAVSADPNVPNVIVTR 37.077 3,006,168 5%
Q61599 रो GDI के 2 LNYKPPPQK 37.975 3,086,596 3%
Q61599 रो GDI के 2 YVQHTYR 21.436 1,711,908 47%
Q61210 रो जीईएफ 1 FDGAEGSWFQK 2.149 176,139 47%
Q61210 रो जीईएफ 1 SGLELEPEEPPGWR 2.911 236,483 8%
Q9QUI0 RhoA QVELALWDTAGQEDYDR 43.500 3,532,438 8%
P70336 ROCK2 GAFGEVQLVR 0.527 42,800 23%
P70336 ROCK2 IYESIEEAK 1.011 83,794 33%
P70336 ROCK2 LEGWLSLPVR 0.573 48,259 22%
Q8R0X7 S1P lyase 1 AGYPLEKPFDFR 1.787 147,043 27%
Q8R0X7 S1P lyase 1 TPEIVAPESAHAAFDK 3.562 291,791 18%

तालिका 1: मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम रॉ के 264.7 सेल प्रोटीन पैंतीस रॉ 264.7 सेल प्रोटीन अट्ठावन आंतरिक पेप्टाइड मानकों और छह जैविक प्रतिकृति का उपयोग मात्रा गया।। लक्ष्य प्रोटीन की पाँच (एक्टिन, GAPDH, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज, ट्यूबिलिन, और vimentin) प्रोटीन गृह व्यवस्था कर रहे थे, और जैविक नमूने (1.1 चरण) भर में सामान्य बनाने सक्षम करने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, एक आंतरिक प्रोटीन मानक (4.765 pmol प्रति जुगनू luciferase के 200 माइक्रोग्राम नमूना, एसडीएस पृष्ठ से 98% शुद्ध, 280 एनएम पर spectrophotometrically मात्रा निर्धारित; 4.11 चरण) नियंत्रण रेखा के आर एम द्वारा प्रत्येक सेल lysate में-नुकीला और मात्रा निर्धारित किया गया था। सीवी मूल्यों विश्व स्तर पर सामान्यीकृत बहुतायत मूल्यों का उपयोग छह जैविक प्रतिकृति भर में गणना की गई है (luciferase के लिए छोड़कर, चरण 5.15)।

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Discussion

निरपेक्ष प्रोटीन मात्रा का ठहराव ऐसे बायोमार्कर सत्यापन और संकेत पारगमन मार्ग मॉडलिंग के रूप में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों का एक बहुत ही विविध रेंज के लिए आवश्यक है। हाल ही में, नियंत्रण रेखा के आर एम का उपयोग कर निशाना बनाया प्रोटिओमिक्स पेप्टाइड मानक तैयार करने, एचपीएलसी, Qqq एमएस, और नियंत्रण रेखा के आर एम डेटा विश्लेषण सहित कई प्रौद्योगिकियों में सुधार से लाभ हुआ है। नतीजतन, यह immunoassays के लिए एक शक्तिशाली विकल्प बन गया है। Immunoassays और / या उत्तरदायी नहीं बहुसंकेतन के लिए अत्यंत संवेदनशील और उच्च throughput हो सकता है, लेकिन immunoassays सेल / ऊतक सेल / homogenization के तरीकों के साथ असंगत, पार जेट और / या हस्तक्षेप करने के लिए असुरक्षित हो सकता है क्योंकि एक मजबूत Immunoassay विकासशील बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है 5,8। उदाहरण के लिए, पार जेट के लिए सबसे व्यापक परीक्षण की तैयारी के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो जीन knockouts, से उत्पन्न कि नमूने का उपयोग Immunoassay प्रदर्शन करना है।

इस प्रोटोकॉल लक्ष्य pept का वर्णनआईडीई चयन, नियंत्रण रेखा के आर एम परख विकास, गुणात्मक और मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम, और नियंत्रण रेखा के आर एम डेटा विश्लेषण। यह कच्चे 264.7 कोशिकाओं को 56 के भीतर 36 कीमोटैक्सिस मार्ग प्रोटीन की पूर्ण बहुतायत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन इसके लागू तक इस विशिष्ट अनुप्रयोग से परे फैली किया गया था। यह सेल छर्रों के भीतर प्रोटीन यों के लिए डिजाइन किया गया था हालांकि, यह अन्य जैविक नमूने (जैसे, biofluids) और अन्य एस आर एम लक्ष्य (जैसे, phosphopeptides) के विश्लेषण के लिए समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, homogenization और / या प्रोटीन पाचन प्रोटोकॉल को बदलने के लिए काफी विशेष रूप से कठिन लक्ष्य प्रोटीन (जैसे, झिल्ली प्रोटीन) के solubilization, विकृतीकरण, alkylation, पाचन, और मात्रा का ठहराव सुधार हो सकता है, या विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण नमूने (जैसे, नमूनों के विश्लेषण के लिए सक्षम हो सकता है युक्त <100 माइक्रोग्राम प्रोटीन मास)।

लक्ष्य पेप्टाइड्स की प्रारंभिक चयन के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन समय लगता हो सकता है। Hundre के लिएलक्ष्य प्रोटीन की डी एस, एक तदर्थ स्कोर प्रत्येक मापदंड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और पहले 56 किया गया है के रूप में जांच का लक्ष्य पेप्टाइड्स, स्कोर की राशि के आधार पर रैंक किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस विश्लेषण PeptidePicker, बहुत लक्ष्य पेप्टाइड चयन 30 को सरल है कि एक वेब इंटरफेस का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/)।

लक्ष्य पेप्टाइड्स चयनित किया गया है और नियंत्रण रेखा के आर एम assays के लिए विकसित किया गया है, के बाद यह प्रोटीन में व्यक्त किया जाता है यहाँ तक कि अगर एक अत्यधिक proteotypic और quantotypic पेप्टाइड पता लगाने योग्य नहीं होगा क्योंकि जैविक नमूने के गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम assays के लिए प्रदर्शन किया जाना महत्वपूर्ण है कि यंत्र की संवेदनशीलता सीमा से नीचे के स्तर, या अगर पृष्ठभूमि हस्तक्षेप विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। जुदाई का एक दूसरा आयाम प्रोटिओमिक गहराई बढ़ा सकते हैं (जैसे, मजबूत कटियन विनिमय एचपीएलसी, उच्च पीएच एचपीएलसी, और जेल से मुक्त वैद्युतकणसंचलन चरण उलट), लेकिन आवश्यकता होगीसाधन समय और डेटा विश्लेषण काफी अधिक। वैकल्पिक रूप से, एक संवर्धन रणनीति (जैसे, peptide- और प्रोटीन-स्तर immunoenrichment और सेल विभाजन) प्रोटिओमिक गहराई में सुधार कर सकते हैं और अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की immunodepletion analytes coeluting द्वारा हस्तक्षेप को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

बदलाव की ~ सैकड़ों या ~ हजारों के लिए नमूने के दसियों आम तौर पर व्यापक साधन समय की आवश्यकता है ~ की नियंत्रण रेखा के आर एम। यह इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था, नियंत्रण रेखा के आर एम (पूर्व-निर्धारित क्षालन समय खिड़कियों के दौरान बदलाव को मापने) का समय निर्धारण रन प्रति अधिक बदलाव के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, निर्धारण नियंत्रण रेखा ढाल के अपेक्षाकृत खाली समय के दौरान एस आर एम कर्तव्य चक्र को कम कर देता है, और यह सुधार पेप्टाइड पहचान और मात्रा का ठहराव में परिणाम कर सकते हैं। हालांकि, निर्धारण पेप्टाइड क्षालन समय आत्मविश्वास से एक गुणात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम विश्लेषण से निर्धारित किया है कि आवश्यकता है। नमूना तैयार करने के लिए सूक्ष्म परिवर्तन, नियंत्रण रेखा एमएस साधन,या नियंत्रण रेखा एमएस विधि का समय निर्धारण फसल या यहां तक ​​कि पूरी तरह से लक्ष्य पेप्टाइड्स याद करने के लिए पैदा कर सकता है। उदाहरण के लिए, जैविक नमूने YDEAASYIQSK क्षालन प्रोफाइल को थोड़ा बाहरी पेप्टाइड के उन मानक (चित्रा 4 बी) के सापेक्ष, संभवतः के कारण मैट्रिक्स प्रभाव में स्थानांतरित कर दिया गया।

सारांश में, एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल पूर्ण प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए नियंत्रण रेखा के आर एम के विकास और आवेदन के लिए प्रस्तुत किया है। नियंत्रण रेखा के आर एम द्वारा प्रोटीन की निरपेक्ष quantitation के पहले से ही प्रयोगशालाओं 16,19 के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए प्रदर्शन किया गया है। नमूना (जैसे, ऑटोमेशन) की तैयारी, तरल क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और डेटा विश्लेषण सहित प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकी, तेजी से सुधार कर रहे हैं, और बड़े पैमाने पर अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए व्यावहारिक बनने के लिए नियंत्रण रेखा के आर एम सक्षम है। मात्रात्मक नियंत्रण रेखा के आर एम की विशिष्टता, संवेदनशीलता, सटीकता, reproducibly, और उच्च throughput यह बुनियादी अनुसंधान और biomedicine के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना देता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade Fisher A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit Fisher 23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm BioSpec Products 11079101z
Bestatin hydrochloride Sigma B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) Lonza 12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 Gibco 15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11550
Cell culture L-glutamine Sigma G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Gibco 10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v Lonza 17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers Nexcelom Bioscience CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules Fisher A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep Marienfeld-Superior 0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2 Mediatech 25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id Polymicro Technologies 1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene SUN SRI 200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone SUN SRI 500-061
Luciferase, from Photinus pyralis Sigma L9506-1MG
Pepstatin A EMD Millipore 516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) EMD Chemicals 9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail Roche 04906837001
RapiGest SF Waters 186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge Waters WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position Waters WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb Fisher 03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
SpeedVac vacuum concentrator Fisher SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Tube decapper for Micronic tubes USA Scientific 1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile Sarstedt 72.694.006
Urea Sigma U0631-500g
Water, LC-MS grade Fisher W6-1

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बायोकैमिस्ट्री अंक 102 पूर्ण मात्रा का ठहराव तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री चयनित प्रतिक्रिया निगरानी ​​स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने श्रृंखला लक्षित प्रोटिओमिक्स ट्रिपल quadrupole
निरपेक्ष प्रोटीन की मात्रा के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री निगरानी चयनित रिएक्शन
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Manes, N. P., Mann, J. M.,… More

Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10.3791/52959 (2015).

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