Introduction
Proteomik experiment som använder masspektrometri (MS) kan utformas för att använda antingen icke öron (hagelgevär) eller riktade metoder. Discovery proteomik bygger i allmänhet på bottom-up hagelgevär MS, antingen genom att använda en traditionell databeroende förvärvsläge, eller med någon av de nyligen utvecklade dataoberoende teknik (t.ex. MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomik är ett kraftfullt verktyg för hög genomströmning peptid identifiering och relativ kvantifiering, men det är i allmänhet olämpligt för absolut kvantifiering eller riktar sig till småföretag, definierade uppsättningar (~ TEN) av proteiner. MS metod som oftast används för riktade proteomik väljs reaktion övervakning (SRM) på grund av dess höga känslighet, hastighet och det dynamiska omfånget 3-5. Alternativ till SRM inkluderar parallella reaktionsövervakning, som drar nytta av hög upplösning, full MS skanning 6.
SRM utförs vanligtvis med användning av en nanoflöde reverSED-fas HPLC (nano-RP-LC) instrument kopplat till en nano elektrosprayjonisering (nano ESI) jonkälla fäst till en trippel kvadrupol masspektrometer (QQQ-MS). I ett typiskt experiment, är provproteiner proteolytiskt digere, och de resulterande peptiderna separeras kromatografiskt, desorberas och joniseras. De resulterande föregångarjoner är m / z filtreras genom den första quadrupole (Q1) och splittrad i den andra fyrfaldiga (Q2) genom att kollidera dem med en kollision gas. De resulterande fragmentjoner är m / z-filtreras i tredje quadrupole (Q3) och kvantifieras enligt en dynod. Varje föregångare och fragmentjon par kallas en övergång, och varje övergång övervakas under en viss tidsperiod (uppehållstiden, typiskt 2-50 ms). Under LC-SRM, de qqq-MS går igenom en fördefinierad lista med övergångar (duty cycle är typiskt ≤3 sek), och ett kromatogram av varje övergång produceras.
Alternativa strategtalet för protein kvantifiering använder vanligtvis immun såsom dot-blottar, Western blöts, ELISA, mikroarrayer antikropps omvänd fas protein mikroarrayer, mikroflödesimmun, digitala ELISA och mikrosfärbaserade immun 7. De bästa immun kan vara betydligt känsligare än LC-SRM, och provkapacitet av immun kan vara betydligt högre än för LC-SRM 5. Däremot kan utveckla immun vara dyrt och / eller tidskrävande, och de resulterande analyser kan vara sårbara för korsreaktivitet och / eller störningar oförenligt med cell / vävnads lys / homogenisering metoder, och / eller inte mottagliga för multiplexering 5,8. Några av dessa frågor kan lösas genom att koppla antikropps och MS-baserade tekniker. Till exempel kan målproteiner berikas med hjälp av immunoutfällning före proteolys och LC-SRM 9-12. Alternativt använder SISCAPA tekniken immunoprecipitation efter proteolys vid peptid level 13,14. Förutom immunoenrichment strategier kan immunotömning av hög förekomst proteiner användas för att öka LC-SRM känslighet genom att reducera interferens genom coeluting analyter 15,16.
MS-baserade protein kvantifiering kan delas in i relativ och absolut kvantifiering, och även i etikett fri och stabil isotop märkning (t.ex. metabolisk märkning, kemisk märkning, och tung-märkta protein- och peptid interna standarder). Märkningsfria tekniker kan vara användbara för relativ protein kvantifiering, men är olämpliga för noggrann absolut kvantifiering. Som jämförelse har märkningstekniker minskat felet i samband med provberedning och MS varians, och används ofta för relativ protein kvantifiering 17. Till exempel, stabil isotop märkt proteomet (SILAP) standarder ställdes med användning av en odlad human cellinje aktiverat relativ kvantifiering av potentiella biomarkörer via LC-SRM av humant serum 18. Exakt absolut protein kvantifiering av MS kräver att renat, kvantifieras, isotopinmärkt protein- eller peptid interna standarder spetsade-i biologiska prover innan MS. Införlivandet av tunga isotopmärkta interna standarder i en LC-SRM arbetsflöde gör absolut kvantifiering som har visat sig vara mycket reproducerbar och överföras mellan laboratorier 16,19.
Stabil isotopmärkta interna standarder för absolut protein kvantifiering av MS inkluderar peptid standarder ställdes med användning av fastfassyntes 20 proteiner som består av sammansatta proteas-klyvbara peptid normer 21, och fullängdsproteinstandarder 22. Målprotein kovalent modifiering och förberedelse ofullständig prov (dvs ofullständig provlysering och homogenisering, och ofullständig protein solubilisering, denaturering, alkylering, och proteolys) kan underminera exakt kvantifiering. Intern protein standarder är minst benägna att påverkas av de flesta av dessa potentiella problem, men de är oftast svårast att förbereda. Ett alternativ är att analysera varje målprotein använder flera interna peptid standarder som är utformade för att inkludera amino- och karboxiterminala infödda flankerande rester. Oavsett vilken typ av intern standard används, bör det spetsade-i biologiska prover på ett så tidigt gång under provberedning som möjligt. Dessutom bör flera provberedningstekniker (t.ex. olika denatureringsvillkor) testas. Användningen av flera ortogonala experimentella tekniker (experimentell tvär validering) är en hållbar strategi för att övervinna de potentiella kvantifiering utmanar 23-25.
LC-SRM kvantifiering av proteiner är en mycket flexibel teknik som har använts i en mängd olika tillämpningar. Notably, har den använts för att studera peptid- och protein biomarkörer inomkliniska prover, såsom serum, kärn biopsier och fin nål aspirat 5. LC-SRM har också använts för att mäta stökiometrin för protein komplex 5,26, för att detektera botulinneurotoxiner 27, för att kvantifiera protein fosforyleringsställen dynamik inom signalvägar 5, och för att kvantifiera förändringar i proteinkonformation 28.
Vårt laboratorium använder LC-SRM att kvantifiera de signalerande proteiner som förmedlar makrofager kemotaxi för att stödja utvecklingen av kemotaxi pathway simuleringar. Den övergripande planen för protokollet (Figur 1) börjar med ranking trevande målpeptider. Därefter råa externa peptid standarder syntetiseras och användas för att utveckla LC-SRM analyser för kvalitativa analyser av biologiska prover. Om det biologiska provet härrörande målpeptiden upptäcks, är renade tunga märkta interna peptid standarder förberedd för kvantitativ LC-SRM. Detta protokoll kan användas för att accurately kvantifiera proteiner från ett brett utbud av biologiska prover, och för att stödja undersökningar av ett stort antal olika proteinmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Denna metod har tidigare beskrivits 56.
1. Peptid målval
- Sammanställ en lista över de målproteiner, och inkluderar ett litet antal hushållning proteiner för normalisering över biologiska prover, och även inkludera en intern proteinstandard (t.ex. eldflugeluciferas). Smälta målproteiner i tryptiska peptider i silico med hjälp av ett verktyg, såsom proteindigestion Simulator 29,30.
- Kräv att peptiderna är fullt tryptisk och innehåller inga saknade trypsin klyvningsställen. Undvik peptider med grann trypsin klyvningsställen för att undvika potentiellt ofullständig trypsindigestion 31.
- Kräver att längden hos varje peptid är 5-20 rester. Tänk längre peptider, men observera att de är i allmänhet dyrare att syntetisera.
- Undvik en peptid om det överensstämmer med en naturlig genetisk variant (t.ex. en enda nucleotide polymorfism). Bekräftar också att trypsin platserna är opåverkade (steg 1,2).
- Undvik en peptid om det motsvarar ett område av posttranslationell modifiering (PTM). På samma sätt, undvika en peptid om det skulle vara benägna att kemisk modifiering under LC-MS provberedning. Specifikt undvika peptider benägna att cystein och metionin oxidation, asparagin och glutamin deamidering, och amino-terminal glutamin bildning av pyroglutamat. Kontrollera att trypsin platserna är opåverkade (steg 1,2).
- Dessutom undvika peptider som härrör från protein amino- och karboxi-terminaler eftersom protein terminaler är benägna att posttranslationell modifiering (aminoterminal metionin förlust och acetylering, och karboxiterminala amideringen).
- Kräv att varje målpeptiden är unik för varje målprotein. Om detta inte är möjligt, kräver att peptiden är unik för en uppsättning av isoformer / homologer. Behandla peptider som skiljer sig endast genom leucin / isoleucin substitutionsom om de var identiska vid fastställandet peptid unika eftersom dessa utför nästan identiskt under LC-SRM.
- Om en omfattande transcriptomic analys av alla biologiska prover har utförts (t.ex. RNA-punkter), bestämma peptid unika att använda in silico översättningar av avskriften sekvenser 32 i stället för att använda hela proteomet av arten.
- Kräv att målpeptider är proteotypic. Identifiera proteotypic peptider använder hagelgevär masspektrometri 1,2 av biologiska prover som studeras. Alternativt, hämta peptid identifieringar av proteotypic peptider från online proteomik databaser såsom NIST masspektrometri bibliotek 33 (http://peptide.nist.gov/), Global Proteome Machine 34 (X HUNTER spektrala bibliotek från http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html, och GPMDB peptid identifieringar från http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
- Om kvantitativa transkript-nivå analyser av biologiska prover har utförts (t.ex. RNA-punkter, qPCR), sedan undvika inriktning peptider som motsvarar de relativt låga överflöd transkript.
- Om det behövs väljer målpeptider som skulle kunna användas för LC-SRM analyser av målprotein ortologer (t.ex. för att analysera både mänskliga och mus former av ett målprotein).
- Välj minst två målpeptider per målprotein (om möjligt).
2. Framställning av peptiden Standards
OBS: Denna del av protokollet beskriver framställningen av en uppsättning av tjugo frystorkade peptid standarder (vardera 1 nmol i kvantitet) för analys nedströms. För ett annat antal peptider, eller för olika peptidmängder, den kommer att behöva justeras i enlighet därmed.
- Se till att cysteinrester externa peptid standarder carbamidomethylated (den kemiska strukturen som bildas av jodacetamid alkylering). Däremot säkerställa att cysteinrester interna peptid standarder är omodifierade (dessa kommer att alkyleras under provberedning, som beskrivs nedan).
- Designa interna peptid standarder så att de innehåller amino- och karboxiterminala infödda flankerande rester (att kontrollera för trypsindigerering effektivitet, var och en är typiskt 05:57 rester lång).
- Plan interna peptid standarder så att de är stabila isotopmärkt. Betrakta den naturliga isotop profilen av målpeptiden och noggrannheten massan mätningen av MS när man väljer en strategi peptidmärkning. Använd inte deutererade peptid standarder eftersom peptid deuteration orsaker omvänd fas LC uppehållstids att flytta 38.
OBS: Typiskt tryptiska interna peptid standarder syntetiseras med hjälp av ~ 98% ren [13 C 6, 15 N 4] Arg och [13 C 6, 15 N 2] Lys införlivas i karboxiterminal. - Rena interna peptid standarder med hjälp av HPLC 39, och exakt kvantifiera dem 40.
- Lägg 100 pl av 0,1% vol / vol myrsyra, kan 20% volym / volym acetonitril (ACN) till var och en nmol lyofiliserade peptiden standard för att producera en peptidkoncentration av 10 pM (användning vård som den lyofiliserade peptiden har en mycket låg densitet och kan förloras lätt). Vortexa prover för 2 min och bad Sonikera dem för fem minuter för att säkerställa att peptid upplösningen är fullständig.
- Pool de upplösta peptidema, och koncentrera den resulterande blandningen i en vakuumkoncentrator till en slutlig volym av 80 | il. Tillsätt 20 pl av ACN för att lösa eventuella utfällda peptiden.
Obs: Provet nu contains 10 pM av varje peptid och 20% volym / volym ACN. - För interna peptid standarder, förbereda en spädningsserie för kvantitativ LC-SRM:
- Bered 100 | il av en 1 | iM utspädning: kombinera 90 pl av 20% volym / volym ACN och 10 ul av 10 pM peptidblandningen.
- Bered 100 | il av en 100 nM utspädning: kombinera 90 pl av 20% volym / volym ACN och 10 | il av en pM peptidblandningen.
- För externa peptid standarder, förbereda 100 | il av en 1 | iM utspädning för LC-MS genom att kombinera 90 pl av 0,1% vol / vol myrsyra och 10 ul av 10 pM peptidblandningen.
Anmärkning: Provet innehåller nu en iM av varje peptid, 0,1% vol / vol myrsyra, och 2% volym / volym ACN, och är redo att användas för LC-SRM analysutveckling.
3. LC-SRM metodutveckling
- Analysera blandningar av de externa peptid standarder (ungefär 1-10 pmol av varje peptid per injektion) med hagelgevär MS med en nano-flöde HPLC-systemet kopplat till en trippel kvadrupol masspektrometer (LC-QQQ-MS (/ MS)).
- Använd en LC-MS-system utrustat med en kapillärkolonn packad med C-18 media (≤5 um diameter, ~ 200 Å porer, längd ≥10 cm, id = 50-100 pm) och en nano-ESI spetsen (typiskt med hjälp av en laser avdragare). Säkerställ att varje LC-MS-körning innehåller en ~ 60 min linjär gradient (typiskt 0-40% lösningsmedel B), en kolonn regenereringssteg (~ 80% lösningsmedel B), och en kolonnåterjämviktsteg (~ 0% lösningsmedel B ) (lösningsmedel A = 0,1% vol / vol myrsyra i H2O, Lösningsmedel B = 0,1% vol / vol myrsyra i ACN, flödeshastighet = 200 till 800 Nl / min, ESI spänning = 1800 V, Q3 isolering bredd = 0,7 m / z, q2 argontryck = 1,5 mTorr).
- För varje prekursor ion scan, dynamiskt välja den översta ~ 10 mest intensiva föregångare joner för tandem masspektrometri (MS / MS). Kör varje prov i duplikat, så att två olika kollisionsenergiramper används: en konstruerad för att optimalt fragmentera två föregångarjoner, och de andraför 3-prekursorn joner 41.
- Utför LC-qqq-MS (/ MS) analyser med hjälp Q3 moderjon skanning (Q1 föregångare jon scanning kan orsaka svans av föregångare jon toppar till följd av energisnåla argon kollisioner i Q2).
- Försäkra dig om att LC-MS-systemet fungerar tillfredsställande sätt genom att analysera QC prover och tekniska replikat. Förhindra smitta mellan prover med nybakade LC kolumner och genom att köra flera ämnen mellan prover.
- Analysera hagelgevär LC-qqq-MS (/ MS) uppgifter som härrör hjälp databassökning mot sekvenserna av de externa peptid standarder 42. Om så är lämpligt, kasta tvetydiga peptid identifieringar med hjälp av peptid identifiering förtroende poäng (t.ex. väntevärden) eller med hjälp av statistisk modellering 42. Oavsett, manuellt gå igenom alla peptid identifieringar 43 för att säkerställa att de är alla entydiga.
- Använd hagelgevär MS peptid identifieringar att construct ett spektrum bibliotek med hjälp av ett program som Skyline.
- Förbered en LC-SRM övergångs listan med 3-10 mest intensiva övergångar per prekursor jon (+2 och +3 föregångarjoner, +1 och +2 fragmentjoner, Y-, b-, och a-joner som är ≥2 rester lång).
- Kassera en övergång om prekursorn och fragmentet jon m / z-värdena överlappar i massan mätnoggrannhet av QQQ-MS (prekursor jon fragmentering är ibland ofullständig, kom ihåg att överväga monoisotopisk och de tunga naturliga isotopformer, såväl som den omärkta och tung-märkta former).
- På samma sätt, kasta en övergång om fragmentjon m / z lappar som en annan fragmentjon från samma prekursor jon.
- Använd de resulterande övergångslistor för att utföra LC-SRM analyser av de blandningar av externa peptid standarder (utföra masspektrometri såsom beskrivits i steg 3.1, Q1 och Q3 isolering width = 0,7 m / z, uppehållstid = 2-50 ms).
- Manually granska de resulterande LC-SRM uppgifter och ta bort alla dåliga resultat analyser (analys av LC-SRM uppgifter beskrivs i avsnitt 5).
4. LC-SRM analyser av biologiska prover
- Förbered rätter av odlade celler 44. Om flera experimentella betingelser jämförs, block och slumpmässigt prover för att minska eventuella systematiska fel 45.
- För varje skål med celler, aspirera cellodlingsmediet till avfall och suspendera cellerna i ett serumfritt buffert 44. Vid behov tvättas cellerna i ett serumfritt buffert för att avlägsna eventuell kvarvarande extracellulärt protein.
- För varje prov, räkna antalet livskraftiga och totala antalet celler genom att använda en viabilitet färgämne (t.ex., trypanblått) och en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare 44.
- Pellets cellerna genom centrifugering, och aspirera supernatanterna till avfall 44 (ett typiskt cellpellet volymen är ~ 30 | il).
- Blanda varje prov med användning av försiktig pipettering, och överför varje till ett 2 ml rör (med ett skruvlock med en O-ring) innehållande ~ 100 | il av 0,1 mm zirkoniumoxid / kiselpärlor (observera att pärlorna kan orsaka snäpplock för att läcka ). Lyse cellerna genom vortexa proverna för 5 minuter vid full hastighet (detta lyserar cellerna genom vulsten stryk).
- Alternativt, lysera cellerna med en annan mekanisk metod (t.ex. med hjälp av en fransk press eller homogenisering tips).
Obs: Undvik att centrifugering cellysat eftersom detta kan pelle utfällda proteinet som kunde otherwise vara tryptically smälta och detekteras genom LC-MS.
- Alternativt, lysera cellerna med en annan mekanisk metod (t.ex. med hjälp av en fransk press eller homogenisering tips).
- För ytaktiva denaturerade prover, inkubera dem vid 90 ° C under 10 min för att bistå prov homogenisering och proteindenaturering.
- Bad sonikera prover för 10 min vid rumstemperatur för att bistå homogenisering och proteindenaturering.
Obs! Lysat och lysisbuffert kan förvaras vid -80 ° C (lysbufferten kommer att behövas för steg 4.9 och 4.13). - Utför en proteinkoncentration analys 46 (t.ex., en bicinkoninsyra analys) av lysaten (med i lysbuffert såsom ett kontrollförsök).
- För kvalitativa analyser (dvs att inga interna peptid standarder spetsade-in proverna), pipett 200 mikrogram (proteinmassa) av cellysat i en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör. För kvantitativa analyser, förbereda fyra sådana prover för en stabil isotopspädningsserie.
- För varje prov, tillsätt en intern proteinstandard (t.ex. </ Em>, lägga ~ 5 pmol ~ 98% ren eldflugeluciferas).
- För kvantitativa analyser, lägg den stabila isotopspädningsserie av den ekvimolära blandning av interna peptid standarder (t.ex. 0, 0,2, 2, 20 pmol av varje peptid) till proverna.
- Parallellt förbereder kontrollprover med hjälp av interna peptid standarder ensam (dvs ingen cellysat) (t.ex. 0, 0,2, 2, 20 pmol av varje peptid).
- Också förbereda kontrollprover med hjälp av externa och interna peptid standarder (till exempel: 2 pmol av varje extern peptid standard, och 0, 0,2, 2, och 20 pmol av varje intern peptidstandard).
Obs: Se till att peptid standarder är fria från myrsyra eftersom det kan störa trypsindigerering.
- Lägg lysbuffert så att alla proverna är identiska volymer. Obs: Ett typiskt provvolym är 70 | il, så denna volym kommer att användas för detta protokoll.
- Minska protein cysteinrester genom att lägga till 0.7 | il 1 M DTT (nyberedd) till varje prov (den slutliga DTT-koncentrationen är 10 mM) och inkubation av proverna vid 60 ° C under 30 min.
- Alkylat protein cystiner genom att lägga 7 pl buffrad jodacetamid (500 mM jodacetamid, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8; nyberedd) och varje prov (den slutliga jodacetamid koncentrationen är 50 mM) och inkubera proverna vid rumstemperatur i 20 min i mörker (jodacetamid är ljuskänsligt). Om så är nödvändigt, släcka återstående jodacetamid genom tillsats DTT till en slutlig koncentration av 50 mM.
- För vart och ett av proven denatureras med hjälp av urea, tillsätt 482 pl 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, så att den slutliga koncentrationen urinämne är 1 Mkr (trypsin signifikant hämmas vid> 1 M urea 47).
- Tryptically smälta proteinerna till peptider.
- För varje prov som innehåller cellysat, tillsätt 8 | il av 0,5 ug / ul sekvense grad modifierad trypsin så att den slutliga trypsin Koncentratjon är 1:50 (protein w: w) trypsin: prov och inkubera provet vid 37 ° C under 18 timmar.
- För varje prov som inte innehåller cellysat, tillsätt 0,5 | il av 0,5 | ig / | al sekvense grad modifierad trypsin och inkubera provet vid 37 ° C under 2 h (vart och ett av dessa prover är för kontrollexperiment, och innehåller typiskt endast 10 ng -10 ig av peptid + proteinmassa).
- För vart och ett av ureadenaturerade prover, tillsätt 440 pl av 2% vol / vol myrsyra (den slutliga myrsyra koncentrationen är 1% volym / volym). Kontrollera att dessa prover är pH ~ 3.
- För vart och ett av de ytaktiva denaturerade prover, tillsätt 914 pl av 0,5% volym / volym TFA (den slutliga TFA-koncentrationen är 0,5% volym / volym). Kontrollera att dessa prover är pH ~ 1.5. Inkubera dessa prover vid 37 ° C under 60 min för att hydrolysera det ytaktiva medlet.
- Mikrocentrifug alla proverna vid 21.000 x g under 20 min vid rumstemperatur för att pelletera det ytaktiva svansgruppen och varje annan utfipitates som skulle täppa ett SPE patron C-18.
- Fastfas extrahera var och en av supernatanterna med användning av en disponibel C-18 SPE-patron (Buffert A = 0,1% vol / vol myrsyra; Buffert B = 0,1% vol / vol myrsyra, 80% volym / volym ACN; ~ 100 mg C- 18 harts per patron). Tvinga mobila faserna genom SPE-patron C-18 med användning av en platt yta gummi glödlampa, med användning av en utvinningskanal, eller genom centrifugering av patronen i ett 15 ml centrifugrör vid 10 x g under 5 minuter.
- Blöt kolonnen genom att applicera en ml buffert B, jämvikta den genom att applicera en ml buffert A två gånger, anbringa provet, och tvätta patronen genom att applicera en ml buffert A två gånger. Eluera peptiderna genom att applicera en ml Buffert B långsamt (~ 2 min).
- Koncentrera varje eluatet i en vakuumkoncentrator till en slutlig volym av 100 | il att förånga bort ACN. Lägg 200 ^ il H2O till varje prov, och koncentrera vardera i en vakuumkoncentrator till en slutlig volym av 98 ^ il för att förånga bort eventuell reresterande ACN.
- Lägg 2 mikroliter av 5% volym / volym myrsyra i ACN till varje prov (de slutliga provkoncentrationerna är 0,1% vol / vol myrsyra, 2% volym / volym ACN).
Anmärkning: Proverna kan förvaras vid -80 ° C. - Analysera prover med LC-SRM (som i steg 3,4). För kvalitativa LC-SRM analyser, kör biologiska prover och de externa peptid standarder och analysera alla resulterande data tillsammans. För kvantitativ LC-SRM analyser, kör isotopspädningsserie av varje biologiskt prov, och även köra prover bestående av enbart peptid standarder och analysera alla resulterande data tillsammans.
5. LC-SRM Data Analysis
OBS: peptid identifiering och kvantifiering kan mycket förenklad och delvis automatiserad med hjälp av programvara såsom Skyline, men det är fortfarande rekommenderas starkt att all data anteckning manuellt granskas. Dessutom är det bäst att informationsproteinnivå vid manuell Annot uteslutation av LC-SRM för att förebygga fördomar.
- För varje peptid identifiering, bekräftar att formen av varje övergång elueringsprofil är ungefär Gauss. För varje övergång, bekräfta att elueringsprofilen är produkten av multipla signaler som mäts av MS-detektor (dvs., inte är en produkt av en eller två slumpmässiga spikar av MS-buller).
- För varje peptid identifiering, se till att hela peptiden elueringsprofilen väljs. Undvik manuell justering Elueringsprofilen gränser delkomponenter av peptiden identifiering (heavy-märkta peptiden form, omärkt form individuella mellanjoner, och individuella övergångar).
- Bekräfta att varje övergång elueringsprofil har ett signal-brusförhållande (S / N) ≥3. Obs: "Noise" avser slumpmässig MS buller, inte reproducerbar signal från coeluting analyter. Kromatogram utjämning funktioner kan vara till stor hjälp för analys av bullriga uppgifter.
- För varje peptid identifiering,bekräfta att alla övergångarna har nästan identiska elueringsprofiler (inte bara lika toppens spets gånger, elueringsprofilerna kan ha olika amplituder).
- För LC-SRM analyser av en stor mängd av peptid standarder (typiskt ≥100 fmol av varje peptid), bekräftar att de motsvarande peptid elueringsprofilerna är mycket intensiv (typiskt s / n ≥100), och att peptididentifiering är entydiga. Obs: Dessa mycket säker identifieringar kommer att vara avgörande för identifiering av motsvarande biologiska prov-härledda peptider.
- För varje peptid identifiering, bekräftar att de relativa övergångsintensitet matcha dem i tryggt identifierade peptiden standard. Om nödvändigt kassera brusiga, relativt låg-intensitetsövergångs elueringsprofiler, men bekräftar att ingen av de relativt intensiva övergångarna saknas. Bortse från relativt intensiva övergångs elueringsprofiler som väsentligt och otvetydigt påverkas av en coeluering förorening.
- För varje peptid identifiering, uppskatta sannolikheten för att det producerades slumpvis genom bakgrundssignal (slumpvis MS brus plus reproducerbar signal från coeluting analyter).
- Uppskatta denna sannolikhet manuellt genom att undersöka hela LC-SRM kromatogrammet och uppskatta det unika i varje peptid identifiering. Alstra en uppsättning av säker peptid identifieringar som har en uppskattad falsk upptäckten hastighet (FDR) av 5%. Använd strängare kriterier (t.ex. FDR ≤1%) om en högre förtroende uppsättning identifieringar krävs (användning av lösare kriterier rekommenderas inte).
- Alternativt kan du använda mProphet algoritmen 48 eller revisionsalgoritmen 49, men manuellt gå igenom resultaten.
- För varje peptid identifiering, bekräfta att den observerade elueringstiden överensstämmer med hydrofobiciteten av peptiden (Skyline är konstruerad för att utföra denna beräkning).
- För varje peptid, bekräftar attdess elueringstid är konsekvent över LC körs.
OBS: LC-SRM analyser ibland producera elueringsprofiler som systematiskt skevt mellan körningarna. Systematiska förändringar är att vänta efter instrument förändringar såsom byte av en kolonn. Dessutom kan tidigt eluerande peptiderna vara benägna att skifta (särskilt om kolonnen belastas nära kapacitet), och sena eluerade peptidema kan också vara benägna att skifta. Peptid identifiering är nu klar. - För att förbättra peptid kvantifiering, reinspect varje peptid identifiering och kassera en övergångs elueringsprofil om den är speciellt bullrig jämfört med de andra övergångs elueringsprofilerna för peptididentifiering. Kasta en övergång elueringsprofil om dess relativa övergångsintensiteten är fel (jämfört med peptidstandard).
- Inspektera gränserna för varje prekursor jon och övergångs elueringsprofilen. Om det behövs, justera försiktigt Elueringsprofilen gränser för att beskära bort bakgrundssignal (eller improve bakgrundssignal uppskattning).
- För varje intern peptid standard, kontrollera om det är förorenat med en detekterbar mängd ljus peptid (bestäms av LC-SRM analyser av de interna peptid standarder ensam, som beskrivs ovan). Därefter, kasta alla ljuspeptid elueringsprofiler som signifikant äventyras av föroreningar ljus peptid inom de interna peptid standarder.
- Kvantifiera varje övergång Elueringsprofilen genom att beräkna dess LC topparea. Om så är lämpligt, dra den uppskattade bakgrundssignalen. Kvantifiera varje peptid elueringsprofilen genom summering av motsvarande övergångs kvantifieringsmetoder värden (nedan, detta kallas värdet "Sum_Peak_Area"). För varje biologiskt prov peptid Sum_Peak_Area värde, beräkna det biologiska provet peptiden molar överflöd med hjälp av data från LC-SRM av interna eller externa peptid standarder (använd endast de övergångar som framgångsrikt kvantifieras genom både det biologiska provet peptidenLC-SRM och den för den peptidstandard).
- Kvantifiering med hjälp av externa peptid standarder (rekommenderas inte):
- Rita de externa peptidstandard Sum_Peak_Area värden jämfört med de externa peptidstandard molar överflöd värden. Producera en standardkurva genom att montera en linjär regression till data (typiskt, bör endast den linjära komponenten av det dynamiska omfånget kan användas, någon olinjär komponent bör användas med stor försiktighet). För varje biologiskt prov peptid Sum_Peak_Area värde, använder standardkurvan för att beräkna peptiden molar överflöd.
Obs: Denna kvantifiering metod rekommenderas inte, eftersom det kräver att provberedning och LC-SRM vara demonstrability robusta eftersom de biologiska prover och externa peptid standarder framställs och analyseras genom LC-SRM separat. Dessutom gör det inte hänsyn till matriseffekter (effekter på grund av komponenter i en annan än den analytprovet).
- Rita de externa peptidstandard Sum_Peak_Area värden jämfört med de externa peptidstandard molar överflöd värden. Producera en standardkurva genom att montera en linjär regression till data (typiskt, bör endast den linjära komponenten av det dynamiska omfånget kan användas, någon olinjär komponent bör användas med stor försiktighet). För varje biologiskt prov peptid Sum_Peak_Area värde, använder standardkurvan för att beräkna peptiden molar överflöd.
- Kvantifiering med användning av internpeptid standarder (rekommenderas):
- För varje biologiskt prov peptid Sum_Peak_Area värde och motsvarande tung-märkta interna peptidstandard Sum_Peak_Area värde, beräkna ljus / tunga förhållande. Använd detta förhållande som ett mått på den motsvarande lätt / tung peptid molärt mängdförhållandet för att beräkna den molära mängden av det biologiska provet peptiden. Specifikt motsvarar det biologiska provet peptiden molar överflöd den interna peptiden standard molar överflöd multiplicerat med ljus / tunga Sum_Peak_Area förhållande.
- För varje biologisk replikat och målpeptiden, identifiera det linjära intervallet för LC-SRM kvantifiering genom att skapa en standardkurva med användning av en linjär regression. Specifikt plotta interna peptidstandard molar överflöd värden jämfört med de tunga / lätta Sum_Peak_Area förhållandevärden (observera att den biologiska provmassan är konstant över dataset). Kräv att varje biologiskt prov peptid Sum_Peak_Area värde ligger inom det linjära området (typicbundsförvant, bör endast den linjära komponenten av det dynamiska omfånget användas; någon olinjär komponent bör användas med stor försiktighet). Likaså utföra detta steg för varje målpeptid övergång.
Obs: analyt kvantifiering av LC-qqq-SRM bör vara linjär över ett brett dynamiskt omfång (~ 10.000). I den nedre delen, kommer bakgrundssignal (slumpvis MS brus plus reproducerbar signal från coeluting analyter) minska kvantifiering noggrannhet och precision. I den övre delen, kommer detektor mättnad orsaka olinjäritet (i slutändan kan det leda till elueringsprofiler att vara platt start vid en viss signalstyrka).
- Kvantifiering med hjälp av externa peptid standarder (rekommenderas inte):
- Om det är lämpligt, genomföra en övergripande normalisering över prover, såsom en central tendens normalisering 50, för att korrigera för små skillnader i provmängden före tillsatta in av de interna peptid standarder. Om det behövs, använd endast hushållning proteiner från steg 1.1.
- Om nödvändigt skriva saknas quantificatjon värden 51,52.
Obs: Det är olämpligt att helt enkelt ersätta saknade värden med halva den nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) eller halva detektionsgränsen (LOD) eftersom detta skulle artificiellt minska kvantifiering varians, och kan resultera i ett statistiskt test (t.ex. en ANOVA ) som producerar ett falskt positivt resultat (ett typ I fel). Men ignorera saknade värden kan också vara problematiskt. Till exempel, om hälften av verkliga överflöd värdena ligger under LOD, och den andra hälften är över LLOQ, då medelvärdet av den observerade överflöd skulle överskatta den genomsnittliga verkliga överflöd. - Se till att analyserna uppfyller allmänt accepterade riktlinjer för LC-SRM 23-25. Noterbart är att kräva att variationskoefficienten för kvantifiering värdena är normalt ≤25% för kliniska analyser och ≤35% för icke-kliniska analyser 25. För LC-SRM analyser i samband med hälso- och sjukvård eller veterinär produkter eller tjänster som ska beaktas för reglerings appRoval kräva att analyserna uppfyller de strängare precisionskrav för sådana analyser: "Precisionen bestämdes vid varje koncentrationsnivå bör inte överstiga 15% av variationskoefficienten (CV) med undantag för LLOQ, där det inte bör överstiga 20% av CV "23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvecklingen av prediktiva beräkningsmodeller av signaltransduktionsvägar är en av de grundläggande målen för systembiologi 53. Tyvärr, även för signalvägar som har studerats i stor utsträckning och har en hög klinisk betydelse, är det fortfarande i allmänhet inte möjligt att kvantitativt förutsäga väg beteende som svar på störningar (t.ex., är detta sant för MAPK / ERK väg 54). Nyligen en undersökning anställd riktade proteomik, transkriptomik och datormodellering och simulering för att studera mus makrofag kemotaxi signalväg 56. Fokus i undersökningen var sfingosin-1-fosfat förmedlade kemotaxi av RAW 264.7-celler (en mus monocyt / makrofag cellinje). För att underlätta vägen modellering, var LC-SRM analyser utvecklas och genomföras för att mäta den absoluta överflöd av kemotaxi pathway proteiner i RAW 264.7-celler. De erhållna överflöd värdena var användningd som parametrar i reaktionsvägen modellen.
Den totala försöksverksamhet (Figur 1) började med en lista över målproteiner, som inkluderade G i2, ett heterotrimert G-protein α-subenheten. Framgången för den övergripande protokollet är mycket beroende på valet av peptid-mål som är proteotypic och quantotypic, såsom YDEAASYIQSK. Blandningar av externa peptid standarder framställdes och analyserades genom hagelgevär LC-QQQ-MS (/ MS). Den erhållna YDEAASYIQSK tandemmasspektrum var sammansatt av flera fragmentjoner, och den hade en låg bakgrund (Figur 2). De spektra användes för att komponera LC-SRM mållistor innehåller de tio mest intensiva fragmentjoner per prekursor jon.
En blandning av 409 externa peptid standarder ("JPT409") analyserades i tre exemplar av kvalitativ LC-SRM (data visas ej). Urvalet omfattar tre G i2 peptider och identifiering av alla tre varbedöms vara säker. Därefter RAW 264.7 prover (biologiska replikat "raw1" och "raw2") och JPT409 prov var och analyserades i duplikat (två LC-SRM tekniska replikat) med kvalitativa LC-SRM (dessa sex LC-SRM analyser utfördes enligt samma sätt som möjligt). Den YDEAASYIQSK peptiden tryggt identifieras i samtliga sex analyser (figurerna 3A - C). De YDEAASYIQSK övergångsintensitetsmönster överensstämde över sex LC-SRM analyser, och dessa var ungefär samma hagelgevär LC-MS (/ MS) mönster ("Bibliotek" replikera i figur 3C).
Mönstret övergångsintensitet är ensam inte alltid är tillräckliga för säker identifiering av en peptid. Peptiden hydrofobicitet och uppmätt LC uppehållstid måste vara konsekvent. Dessutom måste de externa peptid standarder och motsvarande biologiska prov peptider har ungefärlika retentionstider. Hydrofobiciteten (uppskattas med hjälp av SSRCalc version 3.0 100 Å algoritm 55) och observerade retentionstiden för YDEAASYIQSK befanns vara konsekvent (Figur 4A). Dessutom var YDEAASYIQSK retentionstid mätt med hjälp av både RAW 264.7 analyser och analyser av de externa peptid normer, och alla retentionstiden värdena var ungefär lika (Figur 4B).
De flesta av de kvalitativa LC-SRM analyser av biologiska prover var framgångsrika, så motsvarande tung-märkt, renat, kvantifieras interna peptid standarder framställdes och spetsade-i RAW 264.7 cellysat. Isotopspädningsserie LC-SRM användes för att analysera prover bestående av enbart de interna peptid standarder (prov "R0"), den interna och externa peptid standarder (prov "R1"), och sex RAW 264.7 biologiska replikat (prov "R2" - "R7"). Två different proteindenatureringsmedel användes för att testa eventuella protein solubilisering, denaturering, alkylering och / eller matsmältningsproblem som kan undergräva korrekt målprotein kvantifiering (prover R2-R4 används urea, och prover R5-R7 används RapiGest SF). De lätta och tunga former av YDEAASYIQSK innehöll nästan identiska övergångsintensitetsmönster och elueringsprofiler (figurerna 5A - C). LC-SRM summerade toppareaförhållanden användes som ett mått på relativ peptidhalten och de YDEAASYIQSK förhållanden användes för att beräkna G i2 överflöd värden i enheter av kopior per RAW 264.7-cell. Parallellt en andra G i2 intern peptidstandard (IAQSDYIPTQQDVLR) användes för att utföra kvantitativa G i2 LC-SRM-analyser av samma RAW 264.7 prover, och de två analyserna som produceras i hög grad liknande G i2 överflöd mätning över alla de biologiska replikat (Figur 5D). Avtalet av de två G
Totalt sett var 35 proteiner kvantifieras med hjälp av 58 interna peptidstandarder (tabell 1). Noterbart är att LC-SRM analyser av den interna proteinstandard (eldflugeluciferas, Steg 4.11) var noggrann och exakt. Den omfattande uppsättning Skyline data från denna undersökning finns på Panorama nätet LC-SRM databas (i mappen Manes_RAW_Chemotaxis på https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view).
Figur 1:. Översikt över protokoll Tre trevande målpeptider för G i2 (ett heterotrimert G-protein α-subenheten) valdes för extern peptidstandardsyntes. Dessa var analyzed av hagelgevär LC-MS (/ MS) för att utveckla tre G i2 LC-SRM-analyser, och dessa analyser användes för att utföra kvalitativa analyser av biologiska prover. Alla tre G i2 målpeptider identifierades, och två valdes för intern peptidstandardberedningen. Trypsin-klyvbara "JPT-taggar" användes för att kvantifiera de interna peptid standarder som använder UV-spektrofotometri. De interna peptid standarder användes för att utföra kvantitativa G i2 LC-SRM analyser av RAW 264.7 prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Shotgun LC-MS (/ MS) Den avbildade masspektrum härstammar från analyserna av en av de G-i2 externa peptidstandard (YDEAASYIQSK). För denna prekursorion, de tio mest intensiva övergångar valdes för LC-SRM (exklusive a1 1+ fragmentjon på grund av sin korta längd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Kvalitativ LC-SRM av G i2 Den YDEAASYIQSK kromatogram från JPT409 analyser innehöll en mycket låg bakgrund och peptiden tryggt identifierats (A). Motsvarande RAW 264.7 analyser resulterade i mer bakgrundssignal, men peptididentifiering var fortfarande entydig (B). De relativa övergångsintensitetsmönster överensstämde i alla sex LC-SRM analyser (två tekniska replikat av tre oberoende prov), och dessa var ungefär similar till motsvarande hagelgevär LC-MS (/ MS) mönster ("Bibliotek" replikat) (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: peptid uppehållstid förutsägelse och variation över körningar En linjär regression beräknas med hjälp av beräknade hydrofobicitet och mäts kvalitativa LC-SRM elueringstid av samtliga målpeptider, och de förutsagda och uppmätta elueringstider av YDEAASYIQSK överensstämde (A). . Dessutom, samstämmigheten i observerade elueringstiden för varje peptid över LC-SRM analyser bestämdes. Elueringstiderna av YDEAASYIQSK sträckte en rad ~ 40 sekund, vilket var i överensstämmelse med precisionen hos LC-SRM instrument som användes (värdenär toppens spets tid +/- hela bredden vid halv-max, och även hela bredden vid basen av topp) (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Kvantitativ LC-SRM av G i2 Övergångs kromatogram av det biologiska provet peptiden (A) och den inre peptidstandard (B) hade konsekvent relativa övergångs intensiteter, och summerades (C) (visat är "R2" analys för YDEAASYIQSK användning av 10 fmol intern peptidstandard). De lätta och tunga elueringsprofiler överensstämde (C), och förhållandet mellan arean under dessa kurvor användes som ett mått på light / tung peptid överflöd. En andra G i2 intern peptidstandard (IAQSDYIPTQQDVLR) användes för kvantitativ LC-SRM parallellt, och de resulterande G i2 överflöd värden överensstämde över både de sex biologiska replikat och de två målpeptider (totalt, n = 12 och CV = 8,38 %) (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| UniProt anslutning | Målprotein | Målpeptiden | Överflöd (fmol / xg) | Överflöd (kopior / cell, normaliserat) | CV | ||||||
| P08659 | Luciferas | (UV vid 280 nm) | 23,824 | n / a | n / a | ||||||
| P08659 | Luciferas | VVDLDTGK | 24,103 | n / a | 7% | ||||||
| P08659 | Luciferas | VVPFFEAK | 24,717 | n / a | 4% | ||||||
| P60710 | Aktin cytoplasmiska 1 | IWHHTFYNELR | 760,448 | 61.762.598 | 3% | ||||||
| P16858 | GAPDH | LISWYDNEYGYSNR | 357,803 | 28.906.524 | 14% | ||||||
| P06151 | Laktatdehydrogenas | LLIVSNPVDILTYVAWK | 129,623 | 10.633.145 | 30% | ||||||
| P99024 | Tubulin β 5 | ALTVPELTQQVFDAK | 78,765 | 6.398.971 | 3% | ||||||
| P20152 | Vimentin | SLYSSSPGGAYVTR | 121,100 | 9.807.488 | 10% | ||||||
| P60766 | Cdc42 | DDPSTIEK | 86,647 | 6.957.317 | 27% | ||||||
| P60766 | Cdc42 | QKPITPETAEK | 26,475 | 2.153.669 | 6% | ||||||
| Q8C3J5 | DOCK2 | ETLYETIIGYFDK | 1,459 | 118.539 | 15% | ||||||
| Q8C3J5 | DOCK2 | ISSSPTHSLYVFVR | 1,795 | 143.440 | 33% | ||||||
| Q8BPU7 | ELMO1 | ALTTKPSSLDQFK | 2,302 | 186.754 | 7% | ||||||
| Q8BPU7 | ELMO1 | SAIDISILQR | 1,244 | 99.728 | 25% | ||||||
| Q8BGM0 | FGR | GAYSLSIR | 1,099 | 89.473 | 17% | ||||||
| Q8BGM0 | FGR | WTAPEAALFGR | 0,319 | 24.766 | 6% | ||||||
| P27601 | Ga 13 | GIHEYDFEIK | 0,843 | <td> 68.46715% | |||||||
| P27601 | Ga 13 | VFLQYLPAIR | 1.295 | 106.176 | 23% | ||||||
| P08752 | Ga (i) 2 | IAQSDYIPTQQDVLR | 10,900 | 885.701 | 2% | ||||||
| P08752 | Ga (i) 2 | YDEAASYIQSK | 9,774 | 790.616 | 9% | ||||||
| Q9DC51 | Ga (k) | EYQLNDSASYYLNDLDR | 6,574 | 537.862 | 15% | ||||||
| Q9DC51 | Ga (k) | ISQTNYIPTQQDVLR | 3,504 | 285.784 | 10% | ||||||
| P62874 | Gβ 1 | AGVLAGHDNR | 17,078 | 1.385.578 | 4% | ||||||
| Q9CXP8 | Gγ 10 | DALLLGVPAGSNPFR | 2.167 | 179.178 | 36% | P63213 | Gγ 2 | EDPLLTPVPASENPFR | 3,284 | 266.360 | 8% |
| Q80SZ7 | Gγ 5 | VSQAAADLK | 6,087 | 493.512 | 6% | ||||||
| P08103 | HCK | GPVYVPDPTSSSK | 1,143 | 93.044 | 12% | ||||||
| P08103 | HCK | IIEDNEYTAR | 0,944 | 77.147 | 19% | ||||||
| P43406 | Grin α V | AGTQLLAGLR | 0,276 | 22.264 | 32% | ||||||
| P43406 | Grin α V | SHQWFGASVR | 0,443 | 34.235 | 5% | ||||||
| P25911 | LYN | VIEDNEYTAR | 1,461 | 119.377 | 13% | ||||||
| Q5SW28 | PI3K reglerande 5 | AGFPGILDTASPGK | 0,301 | 24.331 | 11% | ||||||
| Q8K3B3 | PI3K reglerande α | LYEEYTR | 0,472 | 38.592 | 16% | ||||||
| Q8K3B3 | PI3K reglerande α | TWNVGSSNR | 0,524 | 42.697 | 12% | ||||||
| Q8K3B3 | PI3K reglerande α | VLSEIFSPVLFR | 0,440 | 35.902 | 20% | ||||||
| Q5U3K7 | PI3K reglerande β | DTPDGTFLVR | 0,188 | 15.262 | 30% | ||||||
| Q5U3K7 | PI3K reglerande β | IAEIHESR | 0,282 | 22.561 | 13% | ||||||
| Q0VGQ5 | PI3K α | LINLTDILK | 0,102 | 8494 | 38% | ||||||
| Q8CI98 | PI3K δ | HEVQEHFPEALAR | 0,178 | 14.566 | 22% | ||||||
| Q8CI98 | PI3K δ | ITEEEQLQLR | 0,481 | 38.709 | 24% | ||||||
| Q9ES52 | PIP3 5-fosfatas en | IVVLAKPEHENR | 0,486 | 39.194 | 19% | ||||||
| Q9ES52 | PIP3 5-fosfatas en | LSQLTSLLSSIEDK | 2,056 | 167.123 | 7% | ||||||
| Q69ZK0 | PIP3 beroende Rac GEF en | DSVLSYTSVR | 0,647 | 52.712 | 32% | ||||||
| Q69ZK0 | PIP3 beroende Rac GEF en | NQLLLALLK | 0,354 | 27.425 | 5% | ||||||
| Q9CQE5 | RGS 10 | ASSQVNVEGQSR | 2,460 | 199.782 | 4% | ||||||
| Q9CQE5 | RGS 10 | WASSLENLLEDPEGVQR | 20,647 | 206.005 | 11% | ||||||
| Q9CX84 | RGS 19 | AEANQHVVDEK | 0,495 | 39.753 | 21% | ||||||
| Q9CX84 | RGS 19 | LIYEDYVSILSPK | 0,846 | 68.481 | 22% | ||||||
| B9EKC3 | Rho GAP 5 | DGLAQELANEIR | 0,448 | 34.653 | 10% | ||||||
| Q99PT1 | Rho GDI 1 | SIQEIQELDK | 3,156 | 267.063 | 16% | ||||||
| Q99PT1 | Rho GDI 1 | VAVSADPNVPNVIVTR | 37,077 | 3.006.168 | 5% | ||||||
| Q61599 | Rho GDI 2 | LNYKPPPQK | 37,975 | 3.086.596 | 3% | ||||||
| Q61599 | Rho GDI 2 | YVQHTYR | 21,436 | 1.711.908 | 47% | ||||||
| Q61210 | Rho GEF en | FDGAEGSWFQK | 2,149 | 176.139 | 47% | ||||||
| Q61210 | Rho GEF en | SGLELEPEEPPGWR | 2,911 | 236.483 | 8% | ||||||
| Q9QUI0 | RhoA | QVELALWDTAGQEDYDR | 43,500 | 3.532.438 | 8% | ||||||
| P70336 | ROCK2 | GAFGEVQLVR | 0,527 | 42.800 | 23% | ||||||
| P70336 | ROCK2 | IYESIEEAK | 1,011 | 83.794 | 33% | ||||||
| P70336 | ROCK2 | LEGWLSLPVR | 0,573 | 48.259 | 22% | ||||||
| Q8R0X7 | S1P lyas 1 | AGYPLEKPFDFR | 1,787 | 147.043 | 27% | ||||||
| Q8R0X7 | S1P lyas 1 | TPEIVAPESAHAAFDK | 3,562 | 291.791 | 18% |
Tabell 1: Kvantitativa LC-SRM av RAW 264.7 cellproteiner Trettiofem RAW 264.7 cellproteiner kvantifierades med hjälp av femtioåtta interna peptid standarder och sex biologiska replikat.. Fem av de målproteiner hushållning proteiner (aktin, GAPDH, laktatdehydrogenas, tubulin och vimentin), och kvantifierades för att möjliggöra normalisering över biologiska prover (steg 1,1). Vidare har en intern proteinstandard spiked-in i varje cellysat och kvantifierades med LC-SRM (4,765 pmol av eldflugeluciferas per 200 | j, g prov, 98% ren genom SDS-PAGE; kvantifieras spektrofotometriskt vid 280 nm, Steg 4,11). CV-värden beräknades över sex biologiska replikat med hjälp av globalt normaliserade överflöd värden (med undantag för luciferas, steg 5,15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Absolut protein kvantifiering är en förutsättning för ett mycket varierat utbud av biomedicinska tillämpningar såsom validering biomarkörer och signaltransduktionsväg modellering. Nyligen har riktade proteomik använder LC-SRM gynnats av förbättringar för många teknologier däribland peptidstandardberedningen, HPLC, QQQ-MS och LC-SRM dataanalys. Följaktligen har det blivit ett kraftfullt alternativ till immunanalyser. Immun kan vara extremt känslig och hög genomströmning, men att utveckla en robust immun kan vara mycket utmanande eftersom immun kan vara sårbara för korsreaktivitet och / eller störningar oförenligt med cell / vävnads lys / homogenisering metoder, och / eller inte mottagliga för multiplexering 5,8. Till exempel, är den mest omfattande test för korsreaktivitet att utföra immun användning av prover som har sitt ursprung från gen knockouts, som kan vara svårt att förbereda.
Detta protokoll beskriver mål Peptide urval, LC-SRM analysutveckling, kvalitativ och kvantitativ LC-SRM, och LC-SRM dataanalys. Det användes för att mäta den absoluta överflöd av 36 kemotaxi pathway proteiner i RAW 264.7-celler 56, men dess användbarhet sträcker sig långt utöver detta specifika program. Även om det har utformats för att kvantifiera proteiner inom cellpelletar, kan den justeras för analys av andra biologiska prover (t.ex. Biofluids) och andra SRM mål (t.ex. fosfopeptider). Till exempel, ändra homogenisering och / eller proteinupptaget protokoll kan avsevärt förbättra solubilisering, denaturering, alkylering, matsmältning, och kvantifiering av särskilt svåra målproteiner (t.ex. membranproteiner), eller skulle kunna möjliggöra en analys av särskilt utmanande prover (t.ex. prov innehållande <100 pg proteinmassa).
Den initiala selektionen av målpeptider är kritisk men kan vara tidskrävande. För hundreds av målproteiner, kan en ad hoc-poäng kan användas för varje kriterium, och de preliminära målpeptider kan rankas baserat på summan av poängen, som har gjorts tidigare 56. Alternativt kan denna analys automatiseras med hjälp av PeptidePicker, ett webbgränssnitt som förenklar målpeptid val 30 (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/).
Efter målpeptider har valts ut och LC-SRM analyser har utvecklats, är det viktigt att kvalitativa LC-SRM analyser av biologiska prover utföras eftersom även en mycket proteotypic och quantotypic peptiden inte kommer att upptäckas om proteinet uttrycks på nivåer under tröskelvärdet av instrumentet, eller om bakgrunden störningar är särskilt problematiskt. En andra dimension separation (t.ex. starka katjonbytar-HPLC, hög-pH omvändfas-HPLC, och gelfri elektroföres) kan öka proteomic djup, men kommer att krävabetydligt mer instrument tid och dataanalys. Alternativt kan en anrikning strategi (t.ex., peptid- och proteinnivå immunoenrichment och cellfraktionering) förbättra proteomic djup, och immunotömning av mycket rikliga proteinerna kan användas för att reducera interferens genom coeluting analyter.
LC-SRM av ~ tiotals prover för ~ hundratals eller ~ tusentals övergångar kräver vanligtvis omfattande instrument tid. Även om det inte användes för denna studie, LC-SRM schemaläggning (mätning övergångar under fördefinierade Elueringstid fönster) gör det möjligt att analysera fler övergångar per körning. Dessutom minskar schemaläggning SRM pulskvoten under relativt lediga perioder av LC-gradient, och detta kan resultera i förbättrad peptid identifiering och kvantifiering. Kräver dock schemaläggning att peptiden elueringstiden vara tryggt bestämmas utifrån en kvalitativ LC-SRM analys. Subtila förändringar i provberedning, LC-MS instrument,eller LC-MS-metoden kan orsaka schemaläggning för att beskära eller till och med helt och hållet missar målpeptider. Till exempel var de biologiska prov YDEAASYIQSK elueringsprofiler något skiftat i förhållande till de av externa peptidstandard (Figur 4B), möjligen på grund av matriseffekter.
Sammanfattningsvis är en steg-för-steg Protokollet presenteras för utveckling och tillämpning av LC-SRM för absolut protein kvantifiering. Absolut kvantifiering av proteiner genom LC-SRM har redan visat sig vara reproducerbar mellan laboratorier 16,19. Teknologier, inklusive provberedning (t.ex. automation), vätskekromatografi, masspektrometri och dataanalys, förbättras snabbt, och gör det möjligt för LC-SRM att bli praktiskt för storskalig forskning och kliniska tillämpningar. Den specificitet, känslighet, noggrannhet, reproducerbart och hög genomströmning av kvantitativa LC-SRM gör det till ett kraftfullt verktyg för grundforskning och biomedicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1 M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC coated silica capillary, 50 µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , 4th edn, Elsevier. (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. Peptide synthesis and applications. , 2nd edn, Humana Press Springer. (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070107.pdf (2001).
- Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration; Revision 1 (draft). Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A.
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al.
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. Amino acid analysis : methods and protocols. , Humana Press. (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th edn, Wiley-Blackwell. (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J.
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16. S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. Mol Cell Proteomics. , Forthcoming.
