Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Published: August 17, 2015 doi: 10.3791/52959
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Introduction

Proteomic eksperimenter som bruker massespektrometri (MS) kan være konstruert for å bruke enten ikke-målrettede (hagle) eller målrettede metoder. Discovery proteomikk generelt er avhengig av bottom-up hagle MS, enten ved hjelp av en tradisjonell dataavhengig oppkjøpet modus, eller ved å bruke en av de nyutviklede datauavhengig teknikker (for eksempel MS E, SWATH) 1,2. Hagle proteomikk er et kraftig verktøy for høy gjennomstrømming peptid identifikasjon og relativ kvantifisering, men det er generelt uegnet for absolutt kvantifisering eller for målretting små, definert sett (~ titalls) av proteiner. MS metode som oftest brukes for målrettede proteomforskning er valgt reaksjon overvåkning (SRM) på grunn av sin høye følsomhet, hastighet og dynamisk område 3-5. Alternativer til SRM inkluderer parallell reaksjon overvåking, som tar fordel av høy oppløsning, full MS skanning 6.

SRM er vanligvis utføres ved hjelp av en nano-flow reversed-fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-nano-LC) instrument koblet til en nano-elektrospray ionisering (nano-ESI) ionekilden er koblet til en trippel kvadrupol massespektrometer (QQQ-MS). I et typisk eksperiment, blir prøveproteiner proteolytisk spaltet, og de resulterende peptider separeres kromatografisk, desorberes, og ionisert. De resulterende forløper-ioner m / z filtrert av det første kvadrupol (Q1) og fragmentert i den andre kvadrupol (q2) ved å kollidere dem med en kollisjon gass. De resulterende fragmentioner er m / z-filtreres i det tredje kvadrupol (Q3), og kvantifiseres ved en dynode. Hver forløper og fragment ionepar er referert til som en overgang, og hver overgang overvåkes for en bestemt tidsperiode (oppholdstiden, vanligvis 2-50 msek). Under LC-SRM, de Qqq-MS blar gjennom en forhåndsdefinert liste over overganger (driftssyklus er vanligvis ≤3 sek), og et kromatogram av hver overgang er produsert.

Alternativ strategkaper for protein kvantifisering vanligvis bruker immunoassays som punkt blotter, Western blot, ELISA, antistoff mikromatriser, reversfaseemulsjoner protein microarrays, microfluidic immunoassays, digitale ELISAer og mikrobaserte immunoassays 7. De beste immunanalyser kan bli vesentlig mer følsomme enn LC-SRM, og prøvekapasitet av immunanalyser kan være betydelig høyere enn for LC-SRM 5. Imidlertid kan utvikle immunoanalyser være dyrt og / eller tidskrevende, og de ​​resulterende analyser kan være utsatt for kryss-reaktivitet og / eller interferens, uforenlig med celle / vev lyse / homogenisering metoder, og / eller ikke mottagelig for multiplekses 5,8. Noen av disse problemene kan løses ved å koble antistoff, og MS-baserte teknikker. For eksempel kan målproteiner bli beriket ved hjelp immunopresipitering før proteolyse og LC-SRM 9-12. Alternativt benytter SISCAPA teknikken immunpresipitering etterkant proteolyse på peptid level 13,14. I tillegg til immunoenrichment strategier, kan immunodepletion av høye overflod proteiner brukes til å øke LC-SRM følsomhet ved å redusere interferensen ved coeluting analytter 15,16.

MS-baserte protein kvantifisering kan deles inn i relativ og absolutt kvantifisering, og også inn i etikett-fri og stabil isotop merking (f.eks, metabolsk merking, kjemisk merking og tung-merkede proteiner og peptider interne standarder). Etikettfrie teknikker kan være nyttig for kvantifisering relativ protein, men er uegnet for nøyaktig absolutt kvantifisering. Til sammenligning har merkingsteknikker reduseres feilen tilknyttet prøvepreparering og MS varians, og blir ofte brukt for relativ protein kvantifisering 17. For eksempel, stabile isotoper merket proteomet (SILAP) standarder utarbeidet med en kultivert human cellelinje aktivert relativ kvantifisering av potensielle biomarkører via LC-SRM av humant serum 18. Nøyaktig absolutt protein kvantifisering av MS krever at renset, kvantifisert, isotopisk merket protein eller peptid interne standarder bli tilsatt-inn biologiske prøver før MS. Inkorporering av tunge isotopen merkede interne standarder i en LC-SRM arbeidsflyt muliggjør absolutt kvantifisering som har vist seg å være meget reproduserbar og overførbar mellom laboratorier 16,19.

Stabile isotoper merket intern standard for protein absolutt kvantifisering av MS er peptid-standarder fremstilles ved hjelp av fast fasesyntese 20, proteiner sammensatt av sammenkjedede protease-spaltbar peptid krav 21, og full-lengde protein krav 22. Målprotein kovalent modifikasjon og ufullstendig prøvepreparering (dvs. ufullstendig prøven lysering og homogenisering, og ufullstendige protein oppløseliggjøring, denaturering, alkylering, og proteolyse) kan undergrave nøyaktig kvantifisering. Intern protein standarder er minst sannsynlig å bli påvirket av de fleste av disse potensielle problemene, men de er vanligvis den mest vanskelig å tilberede. Et alternativ er å analysere hvert mål-protein ved hjelp av flere interne standarder peptid som er utformet for å omfatte amino- og karboksy-terminale flankerende innfødte rester. Uavhengig av hvilken type av intern standard blir benyttet, bør det tilsatt-i de biologiske prøvene på et så tidlig tidspunkt under som mulig prøvepreparering. I tillegg bør flere prøveprepareringsteknikker (f.eks forskjellige denatureringsbetingelser) skal testes. Bruken av flere ortogonale eksperimentelle teknikker (eksperimentell kryss-validering) er en levedyktig strategi for å overvinne størst potensial kvantifisering utfordrer 23-25.

LC-SRM kvantifisering av proteiner er en svært fleksibel teknikk som har vært brukt i en lang rekke anvendelser. Spesielt, har det blitt brukt til å studere peptid og protein biomarkører innenforkliniske prøver som serum, kjerne biopsier, og tynn nål aspirates 5. LC-SRM har også blitt brukt for å måle støkiometrien av proteinkomplekser 5,26, for å detektere botulinum nervegifter 27, for å kvantifisere protein fosforylering dynamikken på signalveier 5, samt kvantifisering av endringer i protein 28 konformasjon.

Vårt laboratorium bruker LC-SRM å kvantifisere signalproteiner som formidler makro kjemotaksis å støtte utviklingen av kjemotaksis sti simuleringer. Den generelle ordningen med protokollen (figur 1) begynner med rangering av tentative mål peptider. Deretter blir rå peptid eksterne standarder syntetisert og brukt til å utvikle LC-SRM-analyser for kvalitative analyser av biologiske prøver. Hvis det oppdages den biologiske prøven-avledet målpeptid blir renset tunge merkede interne peptid standarder utarbeidet for kvantitativ LC-SRM. Denne protokollen kan brukes til accurately kvantifisere proteiner fra et bredt spekter av biologiske prøver, og til å støtte undersøkelser av en rekke forskjellige protein mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne metoden er tidligere beskrevet 56.

1. Peptide Target Selection

  1. Kompilere en liste over målproteinene, og inkluderer et lite antall renholds proteiner for normalisering over biologiske prøver, og inkluderer også en intern protein standard (f.eks ildflueluciferase). Fordøye målproteinene inn tryptiske peptider i silico bruker et verktøy som Protein Fordøyelse Simulator 29,30.
  2. Krev at peptidene er fullt tryptisk og inneholder ingen mangler trypsin spaltningsseter. Unngå peptider med nabo trypsinspalting nettsider for å unngå potensielt ufullstendig trypsin fordøyelsen 31.
  3. Krever at lengden av hvert peptid er 5-20 rester. Vurdere lengre peptider, men merk at de er generelt dyrere å syntetisere.
  4. Unngå et peptid dersom den svarer til en naturlig genetisk variant (for eksempel en enkelt-nukleotide polymorphism). Bekrefter også at trypsin nettstedene er upåvirket (trinn 1.2).
  5. Unngå et peptid om det svarer til et område av posttranslational modifikasjon (PTM). Likeledes unngår en peptid om det ville være utsatt for kjemisk modifikasjon ved LC-MS prøvepreparering. Nærmere bestemt unngå peptider utsatt for cystein og metionin oksidasjon, asparagin og glutamin deamidering, og amino-terminale glutamin dannelse av pyroglutamat. Bekreft at trypsin nettstedene er upåvirket (trinn 1.2).
    1. Videre unngår peptider som stammer fra protein amino- og carboxy-endene, fordi protein termini er utsatt for posttranslasjonell modifikasjon (amino-terminale metionin tap og acetylering, og karboksy-terminale amidering).
  6. Krever at hver målpeptid er unik for hvert mål protein. Hvis dette ikke er mulig, krever at peptidet er unik for et sett av isoformer / homologer. Unn peptider ulike leucine / isoleucin substitusjon bare avsom om de var identiske når man skal avgjøre peptid unikt fordi disse utfører nesten identisk under LC-SRM.
    1. Hvis en omfattende transcriptomic analyse av alle de biologiske prøvene er utført (f.eks RNA-seq), bestemme peptid unikhet hjelp i silikoaluminofosfater oversettelser av karakterutskriften sekvenser 32 i stedet for å bruke hele proteomet av arten.
  7. Krev at målet peptider er proteotypic. Identifisere proteotypic peptider ved hjelp av hagle massespektrometri 1,2 av de biologiske prøvene som studeres. Alternativt hente peptid identifikasjoner av proteotypic peptider fra nett proteomikk databaser som NIST massespektrometri -biblioteker 33 (http://peptide.nist.gov/), The Global Proteome Machine 34 (X HUNTER spektrale biblioteker fra http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html og GPMDB peptid identifikasjoner fra http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. Hvis kvantitativ transkripsjon nivå analyser av biologiske prøver er utført (f.eks RNA-seq, qPCR), så unngå målretting peptider som tilsvarer de relativt lav overflod transkripsjoner.
  9. Hvis det er nødvendig, ved å velge målet peptider som kan brukes for LC-SRM analyser av målprotein ortologer (f.eks, for å bestemme både de humane og muse former av et mål-protein).
  10. Velge minst to mål peptider per målprotein (hvis mulig).

2. Fremstilling av Peptide Standards

MERK: Denne delen av protokollen beskriver utarbeidelse av et sett av tjue frysetørrede peptid standarder (hvert å være en nmol i kvantitet) for nedstrøms analyser. For et annet antall peptider, eller for forskjellige peptid-mengder, det vil måtte justeres tilsvarende.

    20,37.
    1. Sikre at cysteinresidier eksterne peptid standarder carbamidomethylated (kjemisk struktur dannet av jodacetamid alkylering). I motsetning til dette, sikrer at cysteinrestene interne peptid-standarder er umodifisert (disse vil bli alkylert under tillagingen, beskrevet nedenfor).
    2. Utforme interne peptid standarder, slik at de inneholder amino- og carboxy-terminale flankerende residier innfødt (for å kontrollere for trypsin fordøyelse effektivitet; hver er typisk 3-6 rester lang).
    3. Utforme interne peptid standarder slik at de er stabile isotop-merket. Betrakt naturlig isotopisk profil av målpeptidet og massen målenøyaktighet av MS ved valg av et peptid merking strategi. Ikke bruk deutererte peptid standarder fordi peptid deutrering årsaker revers fase LC oppholdstids å skifte 38.
      Merk: Vanligvis er tryptiske peptid interne standarder syntetisert ved anvendelse av ~ 98% ren [13 C 6, 15 N 4] Arg og [13 C 6, 15 N 2] Lys inkorporert ved karboksy-termini.
    4. Rens interne peptid standarder med HPLC 39, og nøyaktig kvantifisere dem 40.
  1. Tilsett 100 ul 0,1% v / v maursyre, kan 20% volum / volum acetonitril (ACN) til hver 1 nmol lyofiliserte peptid standard for å fremstille et peptid-konsentrasjon på 10 uM (bruk forsiktighet da det lyofiliserte peptidet har en meget lav tetthet og kan lett gå tapt). Vortex prøvene i 2 min og bad sonikere dem i 5 minutter for å sikre at peptidet fullstendig oppløsning.
  2. Pool de oppløste peptider og konsentrer den resulterende blanding i en vakuum-konsentrator til et sluttvolum på 80 ul. Tilsett 20 mL av ACN for å oppløse eventuelt utfelt peptid.
    Merk: Prøven nå contains 10 uM av hvert peptid og 20% ​​volum / volum ACN.
  3. For interne peptid standarder, utarbeide en fortynningsserie for kvantitativ LC-SRM:
    1. Forbered 100 ul av en 1 pM fortynning: kombinere 90 ul av 20% volum / volum ACN og 10 pl av 10 pM peptidblandingen.
    2. Forbered 100 ul av en 100 nM fortynning: kombinere 90 ul av 20% volum / volum ACN og 10 pl av 1 pM peptidblandingen.
  4. For eksterne peptid-standarder fremstille 100 ul av en 1 mM fortynning for LC-MS ved å kombinere 90 ul av 0,1% volum / volum maursyre og 10 pl av 10 pM peptidblandingen.
    Merk: prøven inneholder nå en pM av hvert peptid, 0,1% v / v maursyre, og 2% volum / volum ACN, og er klar til å brukes for LC-analyse SRM utvikling.

3. LC-SRM Assay Utvikling

  1. Analyser blandingene av de eksterne peptid standarder (omtrent 1-10 pmol av hvert peptid pr injeksjons) ved hagle MS ved bruk av en nano-flow HPLC-systemet er koblet til en trippel kvadrupol massespektrometer (LC-QQQ-MS (/ MS)).
    1. Bruk en LC-MS system utstyrt med en kapillær kolonne pakket med C-18 media (≤5 mikrometer i diameter, ~ 200 en porene, lengde ≥10 cm, id = 50-100 mm) og en nano-ESI spissen (vanligvis produsert ved hjelp en laser-avtrekker). Sikre at hvert LC-MS løp omfatter en ~ 60 min lineær gradient (vanligvis 0-40% oppløsningsmiddel B), en kolonne regenereringstrinn (~ 80% løsningsmiddel B), og en kolonne re-ekvilibrering trinn (~ 0% Løsningsmiddel B ) (løsningsmiddel A = 0,1% volum / volum maursyre i H 2 O, oppløsningsmiddel B = 0,1% volum / volum maursyre i ACN, strømningshastighet = 200-800 nl / min, ESI spenning = 1800 V, Q3 isolasjon width = 0,7 m / z, q2 argontrykk = 1,5 mTorr).
    2. For hver forløperion skanning, dynamisk velge øverste ~ 10 mest intense forløperioner for tandem massespektrometri (MS / MS). Kjøres hver prøve in duplo, slik at to forskjellige kollisjonsenergi ramper er brukt: en optimalt utformet for å fragmentere 2 forløperioner, og den annenfor tre forløperioner 41.
    3. Utfør LC-Qqq-MS (/ MS) analyser med Q3 forløperion scanning (Q1 forløperion skanning kan føre tailing av forløperen ion toppene som følge av lavenergi argon kollisjoner i Q2).
    4. Kontroller at LC-MS systemet fungerer godt nok ved å analysere QC prøver og tekniske replikater. Hindre overføring av prøver ved hjelp av ferske LC kolonner og ved å kjøre flere blanks mellom prøvene.
  2. Analyser av de resulterende hagle LC-QQQ-MS (/ MS) data med databasesøk mot sekvensene av de eksterne standarder peptid 42. Eventuelt forkaste tvetydige peptid identifikasjoner ved hjelp av peptid identifikasjons tillit score (f.eks forventningsverdier) eller ved hjelp av statistisk modellering 42. Uansett, manuelt gjennom alle peptid identifikasjoner 43 for å sikre at de er entydige.
  3. Bruk hagle MS peptid identifikasjoner å lurekonstruere et spektrum biblioteket ved hjelp av et program som Skyline.
    1. Forbered en LC-SRM overgang listen med 3-10 mest intense overganger per forløperion (2 og 3 forløperioner; 1 og 2 fragment ioner, y-, B- og A-ioner som er ≥2 rester lang).
    2. Kast et overgangs dersom forløperen og fragment ion m / z-verdier overlapper i massen målenøyaktigheten av QQQ-MS (forløperion fragmentering kan være ufullstendig, må man ta hensyn til monoisotopic og de tunge isotopen naturlige former, så vel som det umarkerte og heavy-merket former).
    3. Tilsvarende forkaste en overgang hvis fragment ion m / z overlapper den til et annet fragment ion fra den samme forløper-ion.
  4. Bruk resulterende overgangslister for å utføre LC-SRM analyser av blandinger av de ytre peptid standarder (utføre massespektrometri som beskrevet i trinn 3.1, Q1 og Q3 isolasjon width = 0,7 m / z; holdetid = 2-50 millisekunder).
  5. Maett år om gangen anmeldelse av de resulterende LC-SRM data og slett eventuelle analyser dårlige resultater (analyse av LC-SRM data er beskrevet i punkt 5).

4. LC-SRM Analyser av biologiske prøver

  1. Forberede retter av dyrkede celler 44. Hvis flere eksperimentelle forhold blir sammenlignet, blokk og random prøvene for å redusere eventuelle systematiske skjevheter 45.
  2. For hver skål av celler, Aspirer cellekulturmediet til avfall og suspendere cellene i et serumfritt buffer 44. Hvis det er nødvendig, å vaske cellene i et serumfritt buffer for å fjerne eventuelle gjenværende ekstracellulært protein.
  3. For hver prøve, telle antall levedyktige og totalt antall celler ved hjelp av en levedyktighet flekk (f.eks trypanblått) og et hemocytometer eller en automatisk celleteller 44.
  4. Pellet cellene ved sentrifugering, og aspireres supernatantene til avfall 44 (en typisk celle-pellet volum er ~ 30 mL).
  5. Bland hver prøve ved anvendelse av forsiktig pipettering, og overføre hver til en 2 ml rør (med skrukork med en O-ring) inneholdende ~ 100 ul 0,1 mm zirkonia / silika-perler (merk at kulene kan forårsake snap-cap rør å lekke ). Lysere cellene ved virvling prøvene i 5 min ved full hastighet (dette lyserer celler ved vulsten slagene).
    1. Alternativt lysere cellene bruker en annen mekanisk metode (for eksempel ved hjelp av en fransk trykk eller homogenisering tips).
      Merk: Unngå sentrifugering cellelysater fordi dette kan pellet utfelte protein som kunne otherwise tryptically bli fordøyd og detektert av LC-MS.
  6. For de overflate denaturerte prøvene, inkubere dem ved 90 ° C i 10 minutter for å hjelpe til prøven homogenisering og proteindenaturering.
  7. Bath sonikere prøvene i 10 minutter ved romtemperatur for å hjelpe til homogenisering og proteindenaturering.
    Merk: lysater og lyseringsbuffer kan oppbevares ved -80 ° C (i lysis buffer vil være nødvendig for trinnene 4,9 og 4,13).
  8. Utfør en proteinkonsentrasjon assay 46 (for eksempel en bicinchoninic syre-analyse) av lysatene (og i lysis buffer som en kontrollforsøk).
  9. For kvalitative analyser (dvs. vil ingen interne peptid standardene nagler i prøvene), pipette 200 mikrogram (proteinmasse) av cellelysat i en fersk 1,5 ml mikro tube. For kvantitative analyser, utarbeide fire slike prøver for en stabil isotop fortynningsserie.
  10. For hver prøve, legger en intern protein standard (for eksempel </ Em>, legge ~ 5 pmol på ~ 98% ren ildflueluciferase).
  11. For kvantitative analyser, legger den stabile isotop fortynningsserie av den ekvimolare blandingen av de interne peptid-standarder (f.eks, 0, 0,2, 2, 20 pmol av hvert peptid) til prøvene.
    1. Parallelt forberede kontrollprøver ved hjelp av intern peptid standarder alene (dvs. ingen cellelysat) (for eksempel 0, 0,2, 2, 20 pmol av hvert peptid).
    2. Også fremstille kontrollprøver ved hjelp av de utvendige og innvendige peptid standarder (for eksempel: 2 pmol av hvert peptid ytre standard, og 0, 0,2, 2 og 20 pmol av hvert peptid indre standard).
      Merk: Pass på at peptid standarder er fri for maursyre som det kan forstyrre trypsin fordøyelsen.
  12. Legg lysis buffer, slik at alle prøvene er identiske volumer. Merk: Et typisk prøvevolum er 70 ul, slik at dette volum vil bli brukt til denne protokollen.
  13. Reduser protein cysteinresidier ved å legge til 0.7 ul av 1 M DTT (nylaget) til hver prøve (slutt DTT-konsentrasjonen er 10 mM) og inkubere prøvene ved 60 ° C i 30 minutter.
  14. Alkylat protein cysteiner ved å tilsette 7 mL av buffer jodacetamid (500 mM jodacetamid, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8; nylagde) til hver prøve (sluttkonsentrasjon jodacetamid er 50 mm), og inkubering av prøvene ved romtemperatur i 20 min i mørket (iodoacetamide er lysfølsom). Hvis det er nødvendig, slukke den gjenværende jodacetamid ved tilsetning av DTT til en sluttkonsentrasjon på 50 mM.
  15. For hver av prøvene denaturert ved hjelp av urea, tilsett 482 ul av 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8, slik at den endelige ureakonsentrasjonen er 1 M (trypsin blir vesentlig hemmet ved> 1 M urea 47).
  16. Tryptically fordøye proteiner til peptider.
    1. For hver prøve som inneholder cellelysat, tilsett 8 ul 0,5 ug / ul sekvense grad modifisert trypsin, slik at den endelige trypsin Konsentraterion er 01:50 (protein w: w) trypsin: prøve, og inkuber prøven ved 37 ° C i 18 timer.
    2. For hver prøve som ikke inneholder cellelysat, tilsett 0,5 pl 0,5 pg / pl sekvense grad modifisert trypsin, og inkuber prøven ved 37 ° C i 2 timer (hver av disse prøver er for kontrollforsøk, og inneholder typisk bare 10 ng -10 ug av peptid + proteinmasse).
  17. For hver av urea denaturerte prøvene, tilsett 440 ul av 2% volum / volum maursyre (slutt maursyre-konsentrasjonen er 1% v / v). Bekrefte at disse prøvene er pH ~ 3.
    1. For hvert av de overflateaktive denaturerte prøvene, tilsett 914 ul av 0,5% volum / volum TFA (slutt TFA konsentrasjonen er 0,5% v / v). Bekrefte at disse prøvene er pH ~ 1,5. Inkuber disse prøvene ved 37 ° C i 60 minutter for å hydrolysere det overflateaktive middel.
  18. Mikrosentrifuge alle prøvene ved 21 000 x g i 20 minutter ved romtemperatur for å pelletere det overflateaktive halen gruppen og en hvilken som helst annen precipitates som ville tette en C-18 SPE patron.
  19. Fast fase ekstrahere hver av supernatantene ved bruk av en engangs C-18 SPE-patron (Buffer A = 0,1% v / v maursyre, Buffer B = 0,1% v / v maursyre, 80% volum / volum ACN; ~ 100 mg C- 18 resin per patron). Tvinge de mobile faser gjennom den C-18 SPE-patron ved hjelp av en flat overflate gummi pære, ved hjelp av en ekstraksjon manifold, eller ved sentrifugering av patronen i et 15 ml sentrifugerør ved 10 x g i 5 min.
    1. Fukt kolonnen ved å anvende 1 ml av buffer B, stabilisere den ved å bruke en ml av Buffer A to ganger, påføre prøven, og vaske patronen ved å anvende 1 ml av buffer A to ganger. Eluere peptidene ved anvendelse av 1 ml av buffer B langsomt (~ 2 min).
  20. Konsentrer hvert eluat i et vakuum konsentrator til et sluttvolum på 100 pl for å fordampe ACN. Tilsett 200 ul H2O til hver prøve, og konsentrere hver i en vakuum-konsentrator til et sluttvolum på 98 ul for å fordampe bort eventuelt gjenværende ACN.
  21. Tilsett 2 mL av 5% volum / volum maursyre i ACN til hver prøve (den endelige prøven konsentrasjonene er 0,1% v / v maursyre, 2% volum / volum ACN).
    Merk: Prøvene kan oppbevares ved -80 ° C.
  22. Analysere prøvene ved hjelp av LC-SRM (som i trinn 3.4). For kvalitative LC-SRM analyser, kjører de biologiske prøvene og de eksterne peptid standarder, og analysere alle de resulterende data sammen. For kvantitativ LC-SRM analyser, drevet isotopen fortynningsserie av hver biologisk prøve, og også kjøre prøvene består av peptidet standarder alene, og analysere alle de resulterende data sammen.

5. LC-SRM dataanalyse

MERK: Peptide identifisering og kvantifisering kan svært forenklet og delvis automatisert ved hjelp av programvare som Skyline, men det er fortsatt sterkt anbefalt at alle data merknad manuelt gjennomgått. Dessuten er det best å utelukke proteinnivået informasjon under manuell Annotasjon av LC-SRM data for å unngå skjevhet.

  1. For hvert peptid identifikasjon, bekrefter at formen på hver overgang elueringsprofil er omtrent Gaussian. For hver overgang, bekrefter at elueringsprofilen er produktet av flere signaler målt ved MS-detektor (dvs. det er ikke et produkt av en eller to tilfeldige pigger av MS støy).
  2. For hvert peptid identifikasjon, sikre at hele peptid elueringsprofil er valgt. Unngå manuelt justere Elueringsprofilen grensene for delkomponenter av peptid identifikasjon (heavy-merkede peptid form, den umerkede form, individuelle forløperioner, og enkelte overganger).
  3. Bekrefte at hver overgang elueringsprofilen har et signal-til-støy-forhold (S / N) ≥3. Merk: "Noise" refererer til tilfeldig MS støy, ikke reproduserbare signalet fra coeluting analytter. Kromatogram glatte funksjoner kan i stor grad hjelpe analysen av støyende data.
  4. For hvert peptid identifikasjon,bekrefter at alle overgangene har nesten identiske elueringsprofiler (ikke bare like rush apex ganger, de elueringsprofiler kan ha ulike amplituder).
  5. For LC-SRM analyser av en stor mengde av peptidet standarder (typisk ≥100 fmol av hvert peptid), bekrefter at de tilsvarende peptid elueringsprofiler er meget intens (typisk s / n ≥100), og at peptid identifikasjoner er entydig. Merk: Disse meget trygg identifikasjoner vil være avgjørende for identifisering av de tilsvarende biologisk prøve-avledede peptider.
  6. For hvert peptid identifikasjon, bekrefter at de relative overgangs intensiteter matche de av selvsikkert identifisert peptid standard. Hvis det er nødvendig, kast støyende, relativt lav intensitet overgang elueringsprofiler, men bekrefter at ingen av de relativt intense overganger mangler. Se bort fra relativt intense overgangs elueringsprofiler som er vesentlig og utvetydig berørt av en coeluering forurensning.
  7. For hvert peptid identifikasjon, anslå sannsynligheten for at det ble produsert tilfeldig av bakgrunnssignal (tilfeldig MS støy pluss reproduserbar signal fra coeluting analytter).
    1. Anslår denne sannsynligheten manuelt ved å undersøke hele LC-SRM kromatogram og estimere det unike i hvert peptid identifikasjon. Produsere et sett med trygge peptid identifikasjoner som har en anslått falsk funnrate (FDR) på 5%. Bruk strengere kriterier (f.eks FDR ≤1%) hvis en høyere tillit satt av identifikasjoner er nødvendig (bruk av løsere kriterier ikke er anbefalt).
    2. Alternativt kan du bruke mProphet algoritmen 48 eller revisjonen algoritmen 49, men manuelt gjennom resultatene.
  8. For hvert peptid identifikasjon, bekrefter at den observerte elueringstiden er konsistent med hydrofobisiteten av peptidet (Skyline er utformet for å utføre denne beregning).
  9. For hvert peptid, bekrefter atsin elueringstid er konsistent på tvers av LC går.
    MERK: LC-SRM analyser noen ganger gi elueringsprofiler som er systematisk skjevt mellom kjøringer. Systema skift er å forvente etter instrument endringer som erstatter en kolonne. Videre kan tidlig eluerte peptider være tilbøyelige til å forskyve (spesielt hvis kolonnen er lagt i nærheten av kapasitet), og man eluerer sen peptider kan også være utsatt for skiftende. Peptid identifikasjon er nå fullført.
  10. For å forbedre peptid kvantifisering, reinspect hvert peptid identifikasjon og kastes en overgang elueringsprofilen hvis det er særlig støyende forhold til de andre overgang elueringsprofiler av peptidet identifikasjon. Kast et overgangs elueringsprofilen hvis dens relative intensitet overgang er feil (i forhold til standard peptid).
  11. Inspisere grensene for hver forløper ion og overgangs elueringsprofilen. Om nødvendig må justere Elueringsprofilen grenser for å beskjære bort bakgrunnssignal (eller til jegmprove bakgrunn signal estimering).
  12. For hver interne standard peptid, sjekke om det er forurenset med en detekterbar mengde lys peptid (bestemt ved LC-SRM analyser av de interne peptid standardene alene, som beskrevet ovenfor). Deretter kaste noen lette peptid elueringsprofiler som ble betydelig svekket av lys-peptid forurensning innenfor de interne peptid standarder.
  13. Kvantifisere hver overgang elueringsprofil ved å beregne sin LC toppområdet. Eventuelt trekke den estimerte bakgrunnssignal. Kvantifisere hvert peptid elueringsprofil ved å summere de tilsvarende overgangs kvantifisering av verdier (i det følgende, er dette referert til som "Sum_Peak_Area" verdi). For hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area verdi, beregne biologisk prøve peptid molar overflod ved hjelp av data fra LC-SRM av interne eller eksterne peptid standarder (bruk kun de overgangene som ble vellykket kvantifisert av både biologisk prøve peptidLC-SRM og som av peptidet standard).
    1. Kvantifisering ved hjelp av eksterne peptid standarder (anbefales ikke):
      1. Plotte eksterne peptidstandard Sum_Peak_Area verdier versus ekstern peptidstandard mold overflod verdier. Fremstille en standardkurve ved å tilpasse en lineær regresjon til data (typisk, skal kun den lineære komponent av det dynamiske område kan brukes, en hvilken som helst ikke-lineære komponenter som skal brukes med ekstrem forsiktighet). For hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area verdi, kan du bruke standardkurven til å beregne peptid molar overflod.
        Merk: Denne kvantifisering metoden anbefales ikke fordi det krever at prøveopparbeidelse og LC-SRM være demonstrability robust fordi de biologiske prøvene og eksterne peptid standardene utvikles og analyseres ved LC-SRM separat. Også det ikke høyde for matrix effekter (effekter på grunn av komponenter i et annet land enn analyttprøve).
    2. Kvantifisering internpeptid standarder (anbefales):
      1. For hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area verdi og tilsvarende heavy-merket intern peptid standard Sum_Peak_Area verdi, beregne lys / tunge forhold. Bruk av dette forholdet som et mål på tilsvarende lampe / tung peptid molar ratio overflod å beregne den molare mengde av den biologiske prøven peptid. Nærmere bestemt, er lik den biologiske prøven peptid molar mengde intern standard peptid molar mengde multipliseres med lys / tung Sum_Peak_Area forhold.
      2. For hver replikat og biologisk målpeptid, identifisere den lineære området for LC-SRM kvantifisering ved å opprette en standardkurve ved anvendelse av en lineær regresjon. Spesielt plotte intern peptid standard molar overflod verdier versus tung / lett Sum_Peak_Area ratio verdier (merk at den biologiske prøven massen er konstant over datasettet). Krever at hver biologisk prøve peptid Sum_Peak_Area verdi innenfor det lineære området (typically, skal kun den lineære komponent av det dynamiske område kan brukes; noen ikke-lineær komponent bør brukes med ekstrem forsiktighet). Likeledes utføre dette trinnet for hver målpeptid overgang.
        Merk: Analytt kvantifisering av LC-Qqq-SRM skal være lineær over et stort dynamisk omfang (~ 10 000). På den lave enden, vil bakgrunnssignal (tilfeldig MS støy pluss reproduserbar signal fra coeluting analytter) redusere kvantifisering nøyaktighet og presisjon. På high end, vil detektoren metning føre linearitet (til slutt, kan dette føre til elueringsprofiler å være flat start på et bestemt signal intensitet).
  14. Hvis det er hensiktsmessig, å utføre en global normalisering tvers av prøvene, slik som en sentral tendens til normalisering 50, for å korrigere for små forskjeller i prøvemengde før den spiking-in av de interne peptid standarder. Om nødvendig, bruk bare renhold proteiner fra trinn 1.1.
  15. Hvis det er nødvendig, tilregner mangler quantification verdier 51,52.
    Merk: Det er feil å bare erstatte manglende verdier med halvparten av nedre grense for kvantifisering (LLOQ) eller halve deteksjonsgrense (LOD) fordi det kan kunstig redusere kvantifisering varians, og kan resultere i en statistisk test (for eksempel en ANOVA ) produsere et falskt positivt resultat (en type I-feil). Men ignorerer manglende verdier kan også være problematisk. For eksempel, hvis en halv de sanne overflod verdiene er under LOD, og ​​den andre halvparten er over LLOQ, da den midlere observert overflod ville overvurdere den midlere sanne overflod.
  16. Sikre at analysene tilfredsstille bredt aksepterte retningslinjer for LC-SRM 23-25. Spesielt, krever at variasjonskoeffisienten for kvantifisering av verdier er typisk ≤25% for kliniske analyser, og ≤35% for prekliniske analyser 25. For LC-SRM analyser knyttet til helsetjenester eller veterinær produkter eller tjenester som er å bli vurdert for regulatorisk approval, krever at analysene tilfredsstille strengere krav til presisjon slike analyser: "The presisjon bestemt ved hvert konsentrasjonsnivå bør ikke overstige 15% av variasjonskoeffisienten (CV), bortsett fra LLOQ, hvor den ikke bør overstige 20% av CV "23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utviklingen av prediktive beregnings modeller av signaloverføringsreaksjonsveier er en av de fundamentale mål for systembiologi 53. Dessverre, selv for signalveier som har blitt studert mye og har en høy klinisk betydning, er det fortsatt ikke generelt mulig å kvantitativt forutsi pathway atferd som respons på forstyrrelser (f.eks, dette er sant for MAPK / ERK vei 54). Nylig, en etterforskning ansatt målrettede proteomikk, transcriptomics, og beregningsorientert modellering og simulering for å studere musemakrofag kjemotaksis signalveien 56. Fokus for undersøkelsen var sfingosin-1-fosfat medierte kjemotaksi av RAW 264,7 celler (en mus monocytt- / makrofagcellelinje linje). For å lette veien modellering, ble LC-SRM analyser utviklet og utført for å måle den absolutte overflod av kjemotaksis pathway proteiner i RAW 264,7 celler. De resulterende overflod verdiene var brukd som parametrene av modellen pathway.

Den generelle forsøksordning (figur 1) begynte med en liste over mål proteiner, som inkluderte G i2, en heterotrimeric G-protein α-subenheten. Suksessen med den generelle protokollen er sterkt avhengig av valget av peptid mål som er proteotypic og quantotypic, slik som YDEAASYIQSK. Blandinger av eksterne peptid standarder ble utarbeidet og analysert av hagle LC-Qqq-MS (/ MS). Den resulterende YDEAASYIQSK tandem massespektrum var sammensatt av flere fragmentioner, og det hadde en lav bakgrunn (figur 2). Spektrene ble brukt til å komponere LC-SRM target lister som inneholder de ti mest intense fragmentioner per forløperion.

En blanding av 409 ytre peptid-standarder ("JPT409") ble analysert i triplikat ved kvalitativ LC-SRM (data ikke vist). Denne prøven inkluderte tre G i2 peptider, og identifisering av alle tre vardømt til å være trygg. Deretter RAW 264,7 biologiske prøver (replikater "raw1" og "raw2") og JPT409 prøve ble hver analysert i duplikat (to LC-SRM tekniske replikat) ved kvalitativ LC-SRM (disse seks LC-SRM-analyser ble utført som på samme måte som mulig). Den YDEAASYIQSK peptid ble trygt identifisert i alle seks analyser (3A - C). De YDEAASYIQSK overgangsintensitets mønstre var konsistente på tvers av seks LC-SRM analyser, og disse var omtrent lik den hagle LC-MS (/ MS) mønster ("Bibliotek" gjenskape i Figur 3C).

Mønsteret av overgangs intensiteter alene ikke alltid er tilstrekkelig for trygg identifisering av et peptid. Peptidet hydrofobisitet og måles LC retensjonstid må være konsekvent. Dessuten må de eksterne peptid standarder og de tilsvarende biologisk prøve peptider har ca.like tilbakeholdelsestider. Hydrofobi (estimert ved hjelp av SSRCalc versjon 3.0 100 algoritme 55) og observert retensjonstid på YDEAASYIQSK ble funnet å være konsistent (figur 4A). Også, YDEAASYIQSK retensjonstid ble målt ved bruk av både RAW 264,7 analysene og analysene av de ytre peptid standarder, og alle de retensjonstider tidsverdiene var tilnærmet lik (figur 4B).

Mesteparten av den kvalitative LC-SRM analyser av biologiske prøver var vellykket, så tilsvarende heavy-merket, renset, kvantifisert interne peptid standarder ble utarbeidet og piggete-inn RAW 264,7 cellelysater. Isotop fortynningsserier LC-SRM ble brukt til å analysere prøver som består av de interne peptid standarder alene (sample "R0"), den interne og eksterne peptid standarder (sample "R1"), og seks RAW 264,7 biologiske replikater (samples "R2" - "R7"). To different protein-denatureringsmidler ble anvendt for å teste for eventuelle protein oppløseliggjøring, denaturering, alkylering, og / eller fordøyelsesproblemer som kan undergrave nøyaktig målprotein kvantifisering (samples R2-R4 brukes urea, og prøvene R5-R7 anvendt RapiGest SF). De lette og tunge former YDEAASYIQSK inneholdt nesten identisk overgangsintensitetsmønster og elueringsprofiler (5a - c). LC-SRM summert toppareal-forhold ble brukt som et mål på relativ peptid overflod, og YDEAASYIQSK forhold ble brukt til å beregne G-i2 overflod verdier i enheter av kopier pr RAW 264,7 celle. Parallelt ble en andre G i2 intern standard peptid (IAQSDYIPTQQDVLR) ble brukt til å utføre kvantitative G i2 LC-SRM analyser av samme RAW 264,7 prøver, og de ​​to analysene produsert svært lignende G i2 overflod målinger over hele den biologiske replikater (figur 5D). Avtalen av de to G i2 LC-SRM assays var nøyaktig og presis.

Totalt, 35 proteiner ble kvantifisert ved hjelp 58 interne peptid standarder (tabell 1). Spesielt de LC-SRM analyser av den interne protein standard (ildflueluciferase; Trinn 4.11) var nøyaktig og presis. Den omfattende sett av Skyline data fra denne undersøkelsen er tilgjengelig på Panorama online LC-SRM database (i Manes_RAW_Chemotaxis mappe på https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view).

Figur 1
Figur 1:. Oversikt over protokollen Tre tentative mål peptider for G i2 (a heterotrimeric G-protein α-subenheten) ble valgt for ekstern peptid standard syntese. Disse var analytegnes av hagle LC-MS (/ MS) for å utvikle tre i2 G LC-SRM analyser, og disse analyser ble brukt for å utføre kvalitative analyser av biologiske prøver. Alle tre G i2 målet peptider ble identifisert, og to ble valgt for intern peptid standard forberedelse. Trypsin-spaltbare "JPT-tagger" ble brukt for å kvantifisere de interne peptid standarder med UV spektrofotometri. De interne peptid som ble brukt til å utføre kvantitative G i2 LC-SRM analyser av RAW 264,7 prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Shotgun LC-MS (/ MS) Det avbildede massespektrum stammer fra analysene av en av de G-i2 ytre peptid standarder (YDEAASYIQSK). For dette forløperion, de ti mest intense overganger ble valgt for LC-SRM (eksklusiv a1 1+ fragment ion grunn av sin korte lengde). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Kvalitativ LC-SRM av G i2 Den YDEAASYIQSK kromatogrammet fra JPT409 analyser inneholdt en meget lav bakgrunn og peptidet ble identifisert med sikkerhet (A). De tilsvarende RAW 264,7 analyser resulterte i mer bakgrunnssignalet, men peptidet identifikasjons fremdeles var entydig (B). De relative overgangsintensitets mønstre var konsistente på tvers av alle seks LC-SRM-analyser (to tekniske replikater av tre uavhengige utvalg), og disse var omtrent simiLar til tilsvarende hagle LC-MS (/ MS) mønster ("Bibliotek" replikere) (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Peptid retensjonstid prognose, og variasjonen over driver en lineær regresjon ble beregnet ved å bruke den estimerte hydrofobisitet og måles kvalitativt LC-SRM elueringstid av alle de mål peptider, og de ​​anslåtte og målte Elueringstidene for YDEAASYIQSK var konsistente (A). . I tillegg, konsistensen av den observerte elueringstiden av hvert peptid på tvers av LC-SRM-analyser ble bestemt. Elueringstidene for YDEAASYIQSK spredte en rekke ~ 40 sekunder, noe som var i samsvar med den presisjon av LC-SRM instrument som ble anvendt (verdieneer toppen apex tid +/- full bredde på halv-max, og også den fulle bredden i bunnen av peak) (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Fig. 5: Kvantitativ LC-SRM av G i2 Overgangen kromatogrammer av den biologiske prøve peptid (A) og den interne standard peptid (B) hadde konsistente relative intensiteter overgang, og ble summert (C) (angitt er "R2" -analyse for YDEAASYIQSK ved anvendelse av 10 fmol intern standard peptid). De lette og tunge elueringsprofiler var konsistente (C), og forholdet mellom arealet under disse kurvene ble brukt som et mål på LIGht / heavy peptid overflod. En andre G i2 intern standard peptid (IAQSDYIPTQQDVLR) ble brukt for kvantitativ LC-SRM i parallell, og de ​​resulterende G i2 overflod verdier var konsistente over både biologiske seks replikater og de ​​to target peptider (totalt, n = 12 og CV = 8,38 %) (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td> 68467
Uniprot Tiltredelse Target Protein Target Peptide Overflod (fmol / ug) Overflod (kopier / celle, normalisert) CV
P08659 Luciferase (UV ved 280 nm) 23,824 n / a n / a
P08659 Luciferase VVDLDTGK 24,103 n / a 7%
P08659 Luciferase VVPFFEAK 24,717 n / a 4%
P60710 Actin, cytoplasma 1 IWHHTFYNELR 760,448 61762598 3%
P16858 GAPDH LISWYDNEYGYSNR 357,803 28906524 14%
P06151 Laktatdehydrogenase LLIVSNPVDILTYVAWK 129,623 10633145 30%
P99024 Tubulin β 5 ALTVPELTQQVFDAK 78,765 6398971 3%
P20152 Vimentin SLYSSSPGGAYVTR 121,100 9807488 10%
P60766 CDC42 DDPSTIEK 86,647 6957317 27%
P60766 CDC42 QKPITPETAEK 26,475 2153669 6%
Q8C3J5 DOCK2 ETLYETIIGYFDK 1,459 118539 15%
Q8C3J5 DOCK2 ISSSPTHSLYVFVR 1,795 143440 33%
Q8BPU7 ELMO1 ALTTKPSSLDQFK 2,302 186754 7%
Q8BPU7 ELMO1 SAIDISILQR 1,244 99728 25%
Q8BGM0 FGR GAYSLSIR 1,099 89473 17%
Q8BGM0 FGR WTAPEAALFGR 0,319 24766 6%
P27601 Gα 13 GIHEYDFEIK 0,843 15%
P27601 Gα 13 VFLQYLPAIR 1,295 106176 23%
P08752 Gα (i) 2 IAQSDYIPTQQDVLR 10,900 885701 2%
P08752 Gα (i) 2 YDEAASYIQSK 9,774 790616 9%
Q9DC51 Gα (k) EYQLNDSASYYLNDLDR 6,574 537862 15%
Q9DC51 Gα (k) ISQTNYIPTQQDVLR 3,504 285784 10%
P62874 Gβ 1 AGVLAGHDNR 17,078 1385578 4%
Q9CXP8 Gγ 10 DALLLGVPAGSNPFR 2,167 179178 36% P63213 Gγ 2 EDPLLTPVPASENPFR 3,284 266360 8%
Q80SZ7 Gγ 5 VSQAAADLK 6,087 493512 6%
P08103 HCK GPVYVPDPTSSSK 1.143 93044 12%
P08103 HCK IIEDNEYTAR 0,944 77147 19%
P43406 Inte α V AGTQLLAGLR 0,276 22264 32%
P43406 Inte α V SHQWFGASVR 0,443 34235 5%
P25911 LYN VIEDNEYTAR 1,461 119377 1. 3%
Q5SW28 PI3K regulatoriske 5 AGFPGILDTASPGK 0,301 24331 11%
Q8K3B3 PI3K regulatoriske α LYEEYTR 0,472 38592 16%
Q8K3B3 PI3K regulatoriske α TWNVGSSNR 0,524 42697 12%
Q8K3B3 PI3K regulatoriske α VLSEIFSPVLFR 0,440 35902 20%
Q5U3K7 PI3K regulatoriske β DTPDGTFLVR 0,188 15262 30%
Q5U3K7 PI3K regulatoriske β IAEIHESR 0,282 22561 1. 3%
Q0VGQ5 PI3K α LINLTDILK 0.102 8494 38%
Q8CI98 PI3K δ HEVQEHFPEALAR 0,178 14566 22%
Q8CI98 PI3K δ ITEEEQLQLR 0,481 38709 24%
Q9ES52 PIP3 5-fosfatase 1 IVVLAKPEHENR 0,486 39194 19%
Q9ES52 PIP3 5-fosfatase 1 LSQLTSLLSSIEDK 2,056 167123 7%
Q69ZK0 PIP3 avhengig Rac GEF 1 DSVLSYTSVR 0,647 52712 32%
Q69ZK0 PIP3 avhengig Rac GEF 1 NQLLLALLK 0,354 27425 5%
Q9CQE5 RGS 10 ASSQVNVEGQSR 2.460 199782 4%
Q9CQE5 RGS 10 WASSLENLLEDPEGVQR 20,647 206005 11%
Q9CX84 RGS 19 AEANQHVVDEK 0,495 39753 21%
Q9CX84 RGS 19 LIYEDYVSILSPK 0,846 68481 22%
B9EKC3 Rho GAP 5 DGLAQELANEIR 0,448 34653 10%
Q99PT1 Rho GDI 1 SIQEIQELDK 3,156 267063 16%
Q99PT1 Rho GDI 1 VAVSADPNVPNVIVTR 37,077 3006168 5%
Q61599 Rho GDI 2 LNYKPPPQK 37,975 3086596 3%
Q61599 Rho GDI 2 YVQHTYR 21,436 1711908 47%
Q61210 Rho GEF 1 FDGAEGSWFQK 2,149 176139 47%
Q61210 Rho GEF 1 SGLELEPEEPPGWR 2,911 236483 8%
Q9QUI0 RhoA QVELALWDTAGQEDYDR 43,500 3532438 8%
P70336 ROCK2 GAFGEVQLVR 0,527 42800 23%
P70336 ROCK2 IYESIEEAK 1.011 83794 33%
P70336 ROCK2 LEGWLSLPVR 0,573 48259 22%
Q8R0X7 S1P lyase 1 AGYPLEKPFDFR 1,787 147043 27%
Q8R0X7 S1P lyase 1 TPEIVAPESAHAAFDK 3,562 291791 18%

Tabell 1: Kvantitative LC-SRM av RAW 264,7 celleproteiner Trettifem RAW 264,7 celleproteiner ble kvantifisert ved hjelp femtiåtte interne peptid standarder og seks biologiske replikater.. Fem av målproteinene ble housekeeping proteiner (aktin, GAPDH, laktatdehydrogenase, tubulin, og vimentin), og ble kvantifisert aktivere normalisering over biologiske prøver (trinn 1.1). I tillegg ble en intern standard protein nagler i hver cellelysat og kvantifisert ved LC-SRM (4,765 pmol av ildflue luciferase per 200 ug prøven; 98% rent ved SDS-PAGE; kvantifisert spektrofotometrisk ved 280 nm; trinn 4.11). De CV-verdiene ble beregnet på tvers av de seks biologiske replika hjelp av globalt norm overflod verdier (med unntak av luciferase; Trinn 5,15).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Absolute protein kvantifisering er avgjørende for et svært variert spekter av biomedisinske applikasjoner som biomarkør validering og signaltransduksjonsbane modellering. Nylig har målrettede proteomikk ved hjelp av LC-SRM dratt nytte av forbedringer til en rekke teknologier, inkludert peptid standard forberedelse, HPLC, Qqq-MS, og LC-SRM dataanalyse. Derfor har det blitt en kraftig alternativ til immunoassays. Immunoanalyser kan være ekstremt sensitiv og high-throughput, men utvikling av en robust immunoassay kan være svært utfordrende fordi immunanalyser kan bli utsatt for kryss-reaktivitet og / eller interferens, uforenlig med celle / vev lyse / homogenisering metoder, og / eller ikke mottagelig for å multiplekses 5,8. For eksempel er den mest omfattende test for kryssreaksjon for å utføre immunologisk bruker prøver som stammer fra genet knockouts, noe som kan være utfordrende å forberede seg.

Denne protokollen beskriver målet Peptide utvalg, LC-SRM analysen utvikling, kvalitativ og kvantitativ LC-SRM, og LC-SRM dataanalyse. Den ble brukt til å måle den absolutte mengde av 36 kjemotakse pathway proteiner i RAW 264,7 celler 56, men dens anvendelighet strekker seg langt utover dette spesielle bruksområdet. Selv om det er designet for å kvantifisere proteiner i cellen pellets, kan den justeres for analyse av andre biologiske prøver (f.eks biofluids) og andre SRM mål (f.eks fosforpeptidene). For eksempel endrer homogenisering og / eller protein fordøyelse protokollen kan forbedre oppløseliggjøring, denaturering, alkylering, fordøyelse, og kvantifisering av spesielt vanskelige målproteiner (f.eks proteiner membran), eller kanskje aktivere analyse av spesielt utfordrende prøver (f.eks prøver inneholder <100 pg proteinmasse).

Den innledende utvalg av målet peptider er kritisk, men kan være tidkrevende. For Hundreds av målproteiner kan en ad hoc poengsum brukes for hver kriterier, og de ​​tentative mål peptider kan rangeres basert på summen av resultatet, som har blitt gjort tidligere 56. Alternativt kan denne analysen automatiseres ved hjelp PeptidePicker, et web-grensesnitt som forenkler målpeptid valg 30 (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/).

Etter at mål-peptidene er blitt valgt, og LC-SRM-analyser er blitt utviklet, er det kritisk at kvalitative LC-SRM analyser av de biologiske prøvene utføres fordi selv en meget proteotypic og quantotypic peptid ikke vil være synlig hvis proteinet uttrykkes ved nivåer under sensitivitetsterskelen av instrumentet, eller dersom bakgrunnsinterferens er spesielt problematisk. En annen dimensjon av separasjon (f.eks sterk kationbytter-HPLC, høy pH reversert-fase HPLC, og gel-fri elektroforese) kan øke proteomikk dybde, men vil krevebetydelig mer instrument tid og dataanalyse. Alternativt kan en berikelse strategi (f.eks peptid og protein-nivå immunoenrichment og cellefraksjonering) forbedre proteomikk dybde, og immunodepletion av svært rike proteiner kan brukes til å redusere interferensen ved coeluting analytter.

LC-SRM på ~ titalls prøver for ~ hundrevis eller ~ tusenvis av overganger vanligvis krever omfattende instrument tid. Selv om det ikke ble brukt i denne studien, LC-SRM planlegging (måle overganger under pre-spesifiserte elueringstid windows) muliggjør analyse av flere overganger per løp. Dessuten reduserer planlegging SRM driftssyklus i løpet relativt ledige perioder av LC gradient, og dette kan resultere i forbedret peptid identifikasjon og kvantifisering. Imidlertid krever planlegging at peptidet elueringstiden sik- bestemmes fra en kvalitativ LC-analyse SRM. Subtile endringer i prøveopparbeidelse, LC-MS instrument,eller LC-MS metoden kan føre til planlegging for å beskjære eller helt glipp av målet peptider. For eksempel ble den biologiske prøven YDEAASYIQSK elueringsprofiler litt forskjøvet i forhold til de av ekstern standard peptid (figur 4B), muligens på grunn av matrise effekter.

Oppsummert er en steg-for-steg-protokollen presenteres for utvikling og anvendelse av LC-SRM for absolutt protein kvantifisering. Absolutt mengdebestemmelse av proteiner ved LC-SRM er allerede blitt vist å være reproduserbare mellom laboratorier 16,19. Proteomikk teknologier, inkludert (for eksempel automatisering) væskekromatografi dataanalyse prøveopparbeidelse,, massespektrometri, og, blir bedre raskt, og gjør det mulig for LC-SRM å bli praktisk for storskala forskning og kliniske applikasjoner. Spesifisitet, sensitivitet, nøyaktighet, reproduserbart, og høy gjennomstrømming av kvantitative LC-SRM gjør det til et kraftig verktøy for grunnforskning og biomedisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade Fisher A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit Fisher 23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm BioSpec Products 11079101z
Bestatin hydrochloride Sigma B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) Lonza 12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 Gibco 15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11550
Cell culture L-glutamine Sigma G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Gibco 10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v Lonza 17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers Nexcelom Bioscience CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules Fisher A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep Marienfeld-Superior 0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2 Mediatech 25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id Polymicro Technologies 1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene SUN SRI 200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone SUN SRI 500-061
Luciferase, from Photinus pyralis Sigma L9506-1MG
Pepstatin A EMD Millipore 516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) EMD Chemicals 9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail Roche 04906837001
RapiGest SF Waters 186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge Waters WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position Waters WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb Fisher 03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
SpeedVac vacuum concentrator Fisher SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Tube decapper for Micronic tubes USA Scientific 1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile Sarstedt 72.694.006
Urea Sigma U0631-500g
Water, LC-MS grade Fisher W6-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
  2. Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
  3. Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
  4. Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
  5. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
  6. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
  7. Wild, D. The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , 4th edn, Elsevier. (2013).
  8. Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
  9. Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
  10. Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
  11. Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
  12. Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
  13. Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
  14. Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
  15. Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
  16. Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
  17. Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
  18. Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
  19. Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
  20. Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. Peptide synthesis and applications. , 2nd edn, Humana Press Springer. (2013).
  21. Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
  22. Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
  23. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070107.pdf (2001).
  24. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration; Revision 1 (draft). Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf (2013).
  25. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
  26. Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
  27. Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
  28. Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
  29. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  30. Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
  31. Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
  32. Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
  33. Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
  34. Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
  35. Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
  36. Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
  37. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
  38. Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
  39. Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
  40. Alterman, M. A., Hunziker, P. Amino acid analysis : methods and protocols. , Humana Press. (2012).
  41. Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
  42. Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
  43. Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
  44. Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th edn, Wiley-Blackwell. (2010).
  45. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
  46. Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
  47. Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
  48. Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
  49. Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
  50. Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
  51. Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16. S5 (2012).
  52. Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
  53. Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
  54. Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
  55. Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
  56. Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. Mol Cell Proteomics. , Forthcoming.

Tags

Biokjemi absolutt kvantifisering væskekromatografi massespektrometri valgte reaksjon overvåking stabile isotoper fortynningsserier målrettede proteomikk triple quadrupole
Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manes, N. P., Mann, J. M.,… More

Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10.3791/52959 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter