Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Published: August 17, 2015 doi: 10.3791/52959
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Introduction

Proteomische experimenten massaspectrometrie (MS) gebruikt kan worden ontworpen om hetzij niet-gerichte (shotgun) of gerichte methoden. Discovery proteomics in het algemeen via bottom-up shotgun MS, hetzij een traditionele data-afhankelijke acquisitiemodus, of door één van de recent ontwikkelde data-onafhankelijke technieken (bijvoorbeeld MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel voor high-throughput peptide identificatie en relatieve kwantificatie, maar het is doorgaans ongeschikt voor absolute kwantificering of targeting kleine gedefinieerd sets (~ tientallen) van eiwitten. De MS methode meestal gebruikt voor gerichte proteomics is selected reaction monitoring (SRM) vanwege zijn hoge gevoeligheid, snelheid en dynamisch bereik 3-5. Alternatieven voor SRM omvatten parallelle reactie monitoring, die gebruik maakt van een hoge resolutie, volledige MS scannen 6.

SRM wordt gewoonlijk uitgevoerd met een nano-flow galmsed-phase high-performance liquid chromatography (nano-RP-LC) instrument gekoppeld met een nano-electrospray ionisatie (nano-ESI) ion source verbonden met een drievoudige quadrupool massaspectrometer (QqQ-MS). In een typisch experiment worden monstereiwitten proteolytisch geknipt en de resulterende peptiden chromatografisch gescheiden gedesorbeerd en geïoniseerd. De resulterende voorloper ionen m / z gefilterd door de eerste quadrupool (Q1) en gefragmenteerde in de tweede quadrupool (Q2) door botsing ze met een botsing gas. Het resulterende fragment ionen m / z-gefilterd in de derde quadrupool (Q3) en gekwantificeerd met een dynode. Elke precursor en fragment ionenpaar wordt aangeduid als een overgang, en elke overgang wordt gecontroleerd op een bepaalde periode (de wachttijd; meestal 2-50 msec). In LC-SRM, de QqQ-MS wordt naar het vooraf gedefinieerde lijst van overgangen (de duty cycle typisch ≤3 sec) en een chromatogram van elke overgang wordt geproduceerd.

Alternatieve strategven voor eiwithoudende kwantificering maken gewoonlijk gebruik van immunoassays zoals dot blots, Western blots, ELISA's, antilichaam microarrays, omgekeerde fase proteïne microarrays, microfluïdische immunoassays, digitale ELISA en microbolletjes gebaseerde immunoassays 7. De beste immunoassays kunnen aanzienlijk gevoeliger dan LC-SRM en monsterdoorvoer immunoassays aanzienlijk hoger dan die van LC-SRM 5 zijn. Echter, de ontwikkeling immunoassays duur en / of tijdrovend en de resulterende assays kunnen kwetsbaar voor kruisreactiviteit en / of interferentie, onverenigbaar met cel / weefsel lysis / homogeniseren methoden en / of niet vatbaar multiplexen 5,8. Sommige van deze problemen kunnen worden aangepakt door het koppelen van antilichaam en MS-gebaseerde technieken. Zo kunnen doeleiwitten worden verrijkt met behulp van immunoprecipitatie voorafgaand aan proteolyse en LC-SRM 9-12. Als alternatief kan de SISCAPA techniek maakt gebruik van immunoprecipitatie na proteolyse in het peptide level 13,14. Naast strategieën immunoenrichment, kan immunodepletie hoge overvloed eiwitten worden gebruikt om LC-SRM gevoeligheid te verhogen door het verminderen van interferentie door coeluting analyten 15,16.

MS-eiwitten gekwantificeerd kan worden onderverdeeld in relatieve en absolute kwantificatie en eveneens in-label vrij en stabiele isotopen (bijvoorbeeld metabolisch merken, chemische labeling en zware-gemerkt eiwit en peptide interne standaarden). Label-free technieken kunnen nuttig zijn voor de relatieve eiwit kwantificatie zijn, maar zijn niet geschikt voor nauwkeurige absolute kwantificatie. Ter vergelijking zijn labeltechnieken foutenbronnen bij monstervoorbereiding en MS variantie verminderd en worden vaak gebruikt voor relatieve kwantificatie eiwit 17. Bijvoorbeeld, stabiele isotoop gemerkte proteoom (SILAP) standaarden bereid met een gekweekte menselijke cellijn ingeschakeld relatieve kwantificering van potentiële biomarkers via LC-SRM van humaan serum 18. Accurate absolute eiwit kwantificering door MS vereist dat gezuiverd, gekwantificeerd, isotopisch gemerkt eiwit of peptide interne standaarden worden spiked-in biologische monsters voorafgaande aan MS. De opname van zware isotoop gelabelde interne standaarden in een LC-SRM workflow maakt absolute kwantificatie waarvan is aangetoond zeer reproduceerbare en overdraagbaar laboratoria 16,19 zijn.

Stabiele isotopen gelabelde interne standaarden voor de absolute kwantificering van eiwit MS omvatten peptide standaarden bereid met vaste fase synthese 20, eiwitten uit aaneengeschakelde protease splitsbare peptide standaarden 21 en full-length eiwitstandaards 22. Doelproteïne covalente modificatie en onvolledige monstervoorbereiding (dwz onvolledige sample lysis en homogenisering, en onvolledige eiwit oplosbaar, denaturatie, alkylering en proteolyse) kan accurate kwantificering ondermijnen. Interne pProtein normen het minst waarschijnlijk worden beïnvloed door de meeste van deze potentiële problemen, maar deze zijn meestal de meest moeilijk te bereiden. Een alternatief is om elk doelwit eiwit met meerdere interne peptide standaarden die zijn ontworpen om amino- en carboxy-eindstandige natieve flankerende resten omvatten analyseren. Ongeacht welk type interne standaard wordt gebruikt, moet worden spiked-in biologische monsters in een zo vroeg punt tijdens de voorbehandeling mogelijk. Ook moet meerdere monstervoorbereiding technieken (bijvoorbeeld verschillende denaturatie omstandigheden) worden getest. Het gebruik van meerdere orthogonale experimentele technieken (experimentele cross-validatie) is een haalbare strategie voor het overwinnen van de meeste potentiële kwantificering daagt 23-25.

LC-SRM kwantificering van eiwitten is een zeer flexibele techniek die is gebruikt in vele verschillende toepassingen. Met name is het gebruikt om peptide en proteïne biomarkers studie binnenklinische monsters zoals serum, kern biopsies en naaldopzuigingen 5. LC-SRM is ook gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen 5,26 meten, botulinum neurotoxinen 27 detecteren, te kwantificeren proteïne fosforylatie dynamiek binnen signaalwegen 5 en wijzigingen in eiwitconformatie 28 kwantificeren.

Ons laboratorium gebruikt LC-SRM de signalering eiwitten die chemotaxis van macrofagen mediëren de ontwikkeling van chemotaxis traject simulaties ondersteunen kwantificeren. De algemene regeling van het protocol (figuur 1) begint met de rangschikking van de voorlopige targetpeptiden. Vervolgens worden ruwe peptide externe standaarden gesynthetiseerd en LC-SRM assays voor kwalitatieve analyses van biologische monsters te ontwikkelen. Als het biologisch monster afgeleid doelwit peptide wordt gedetecteerd, worden gezuiverd heavy-gelabelde interne peptide normen opgesteld voor de kwantitatieve LC-SRM. Dit protocol kan worden gebruikt om ACcurately kwantificeren eiwitten uit diverse biologische monsters, en onderzoeken van diverse eiwit targets ondersteunen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Deze methode is eerder beschreven 56.

1. Peptide Target Selection

  1. Stel een lijst van de doeleiwitten, en zijn voorzien van een klein aantal van de huishouding eiwitten voor normalisering over biologische monsters, en ook een interne eiwit standaard (bijv vuurvliegluciferase). Digest het doelwit eiwitten in tryptische peptiden in silico behulp van een software tool zoals eiwitvertering Simulator 29,30.
  2. Vereisen dat de peptiden zijn volledig tryptic en bevatten geen ontbrekende trypsine splitsing sites. Vermijd peptiden met naburige trypsine klievingsplaatsen om potentieel onvolledige trypsine spijsvertering 31 vermijden.
  3. Vereisen dat de lengte van elk peptide 5-20 resten. Beschouw langere peptiden, maar merk op dat dit algemeen duurder te synthetiseren.
  4. Vermijd een peptide wanneer zij overeenkomt met een natuurlijke genetische variant (bijvoorbeeld een single-nucleotide polymorfisme). Ook bevestigen dat de trypsine sites zijn beïnvloed (Stap 1.2).
  5. Vermijd een peptide wanneer zij overeenkomt met een site van posttranslationele modificatie (PTM). Evenzo vermijden peptide als het gevoelig voor chemische modificatie zou zijn tijdens LC-MS monstervoorbereiding. Specifiek vermijden peptiden gevoelig voor cysteine ​​en methionine oxidatie, asparagine en glutamine deamidering en amino-eindstandige glutamine vorming van pyroglutamaat. Controleer of de trypsine sites zijn beïnvloed (Stap 1.2).
    1. Vermijd bovendien peptiden die afkomstig zijn van eiwitten amino- en carboxy-uiteinden, omdat eiwit uiteinden zijn gevoelig voor posttranslationele modificatie (amino-eindstandige methionine verlies en acetylering en carboxy-eindstandige amidering).
  6. Vereisen dat elk doel peptide uniek is voor elk doel eiwit. Als dit niet mogelijk is, dient het peptide uniek is voor een set van isovormen / homologen. Behandel peptiden die alleen verschillen door leucine / isoleucine substitutiealsof ze identiek waren bij het bepalen van peptide uniciteit, omdat deze uit te voeren bijna identiek tijdens de LC-SRM.
    1. Als een uitgebreide transcriptoom analyse van alle biologische monsters is uitgevoerd (bijvoorbeeld RNA-seq) Bepaal peptide uniek gebruik in silico vertaling van het transcript sequenties 32 in plaats van de gehele proteoom van de species.
  7. Vereisen dat de targetpeptiden zijn proteotypic. Identificeer proteotypic peptiden met shotgun massaspectrometrie 1,2 van de biologische monsters worden onderzocht. Ook halen peptide identificaties van proteotypic peptiden uit online proteomics databases zoals het NIST massaspectrometrie bibliotheken 33 (http://peptide.nist.gov/), The Global Proteome Machine 34 (X HUNTER spectrale bibliotheken van http: // www .thegpm.org / HUNTER / index.html en GPMDB peptide identificaties van http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. Wanneer kwantitatieve transcript niveau analyses van biologische monsters zijn uitgevoerd (bijvoorbeeld RNA-seq, qPCR), dan vermijd gerichte peptiden die overeenkomen met de geringe dichtheid transcripten.
  9. Indien nodig, selecte peptiden die kunnen worden gebruikt voor LC-SRM assays doelwiteiwit orthologen (bijvoorbeeld zowel de mens en de muis vormen van een doeleiwit testen).
  10. Ten minste twee targetpeptiden per doeleiwit (indien mogelijk).

2. Bereiding van Peptide Standards

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol beschrijft de bereiding van een reeks van twintig gevriesdroogde peptide normen (die elk 1 nmol in hoeveelheid) voor downstream analyses. Voor een ander aantal peptiden, of voor verschillende hoeveelheden peptide, zal dienovereenkomstig moeten worden aangepast.

    20,37.
    1. Zorg ervoor dat cysteïne residuen van externe peptide normen carbamidomethylated (de chemische structuur gevormd door iodoacetamide alkylering). Daarentegen zorgen dat cysteïneresiduen interne peptide standaarden ongemodificeerd (deze zullen gealkyleerd tijdens de voorbehandeling worden hieronder beschreven).
    2. Ontwerp interne peptide standaarden zodat ze bevatten amino- en carboxy-eindstandige flankerende natieve residuen (om te controleren voor trypsinedigestie efficiency, elk kenmerkend 3-6 residuen lang).
    3. Ontwerp interne peptide standaarden zodat ze stabiel isotoop gelabeld. Denk aan de natuurlijke isotopische profiel van het doel peptide en de massa meetnauwkeurigheid van de MS bij het selecteren van een peptide labeling strategie. Heeft gedeutereerde peptide normen niet gebruiken omdat peptide deuterering oorzaken omgekeerde fase retentie LC tijds verschuiven 38.
      Opmerking: Gewoonlijk worden tryptische peptide interne standaarden gesynthetiseerd middels ~ 98% zuiver [13 C 6, 15 N 4] Arg en [13 C 6, 15 N 2] Lys opgenomen in de carboxy-uiteinden.
    4. Zuiver interne peptide normen met HPLC 39, en ze 40 nauwkeurig te kwantificeren.
  1. Voeg 100 ul van 0,1% v / v mierenzuur, kan 20% v / v acetonitril (ACN) voor elke 1 nmol gelyofiliseerd peptide standaard peptide een concentratie van 10 uM (gebruik zorg als het gelyofiliseerd peptide een zeer lage dichtheid en kan gemakkelijk worden verloren). Vortex de monsters gedurende 2 min en bad ultrasone trillingen hen gedurende 5 minuten zodat peptide volledig is opgelost.
  2. Verzamel de opgeloste peptiden en concentreer het verkregen mengsel in een vacuümconcentrator tot een eindvolume van 80 pi. Voeg 20 ul van ACN aan een neergeslagen peptide ontbinden.
    Opmerking: Het monster nu contains 10 uM van elk peptide en 20% v / v ACN.
  3. Voor interne peptide normen, bereiden een verdunning serie voor kwantitatieve LC-SRM:
    1. Bereid 100 pi van een 1 uM verdunning: combineer 90 pi 20% v / v ACN en 10 pl van de 10 uM peptidemengsel.
    2. Bereid 100 ul van een 100 nM verdunning: combineer 90 pi 20% v / v ACN en 10 pl van de 1 uM peptidemengsel.
  4. Bij externe peptide standaarden bereiden 100 ui van een 1 uM verdunning van LC-MS combineert 90 pi 0,1% v / v mierenzuur en 10 pl van de 10 uM peptidemengsel.
    Opmerking: Het monster bevat nu 1 uM van elk peptide, 0,1% v / v mierenzuur, en 2% v / v ACN, en is klaar om te worden gebruikt voor LC-SRM assayontwikkeling.

3. LC-SRM Assay Development

  1. Analyseer de mengsels van de uitwendige peptide standaarden (ongeveer 1-10 pmol van elk peptide per injectie) door shotgun MS met een nano-flow HPLC-systeem gekoppeld aan een triple quadrupool massaspectrometer (LC-QqQ-MS (/ MS)).
    1. Gebruik een LC-MS systeem voorzien van een capillaire kolom gepakt met C-18 media (≤5 urn diameter, ~ 200 Â poriën, lengte ≥10 cm, id = 50-100 um) en een nano-ESI tip (meestal geproduceerd met behulp Een laser-puller). Zorg ervoor dat elke LC-MS run omvat een ~ 60 min lineaire gradiënt (gewoonlijk 0-40% oplosmiddel B) een regeneratiekolom stap (~ 80% Oplosmiddel B) en een kolom re-equilibratie stap (~ 0% oplosmiddel B ) (oplosmiddel A = 0,1% v / v mierenzuur in H 2 O, oplosmiddel B = 0,1% v / v mierenzuur in ACN, stroomsnelheid = 200-800 nl / min, ESI voltage = 1800 V, Q3 isolatie width = 0,7 m / z, q2 argondruk = 1,5 mTorr).
    2. Voor elke voorloper ion scan, selecteert dynamisch de top ~ 10 meest intense voorloper ionen voor tandem massaspectrometrie (MS / MS). Run elk monster in duplo zodat twee verschillende botsingsenergie hellingen gebruikt: een optimaal ontworpen fragment 2 precursorionen, en de anderevoor 3 voorloper ionen 41.
    3. Voer de LC-QqQ-MS (/ MS) analyses met behulp van Q3 voorloper ion scannen (Q1 voorloper ion scannen kan tailing van de voorloper ion pieken als gevolg van lage-energie-argon botsingen in Q2 veroorzaken).
    4. Zorg ervoor dat de LC-MS systeem adequaat uitvoeren door het analyseren van QC monsters en technische repliceert. Voorkom monster overdracht met behulp van vers gemaakt LC kolommen en door het uitvoeren van meerdere spaties tussen de monsters.
  2. Analyseer de resulterende shotgun LC-QqQ-MS (/ MS) gegevens met behulp gegevensverzamelingzoeken tegen de sequenties van de externe standaard 42 peptide. Eventueel weggooien dubbelzinnige peptide identificaties met de peptidenidentificatie vertrouwen scores (bijv verwachtingswaarden) of met behulp van statistische modellen 42. Ongeacht handmatig alle peptide identificaties 43 teneinde te waarborgen dat zij alle eenduidig.
  3. Gebruik de shotgun MS peptide identificaties te construct een spectrum bibliotheek met behulp van een software programma zoals Skyline.
    1. Bereid een LC-SRM overgang lijst met de 3-10 meest intense overgangen per voorloper ion (+2 en +3 voorloper ionen, +1 en +2 fragmentionen, Y-, b- en a-ionen die ≥2 residuen lang).
    2. Gooi overgang wanneer de precursor en fragment ionen m / z waarden overlappen in de massa meetnauwkeurigheid van de QqQ-MS (precursorion fragmentatie soms onvolledig, niet om de mono-isotopische en de zware natuurlijke isotoop vormen, alsmede de ongelabelde bestuderen en heavy-gelabelde vormen).
    3. Evenzo gooi overgang wanneer het fragment ion m / z overlapt een ander fragment ion van dezelfde precursor ion.
  4. Gebruik de omschakeling de lijsten te voeren LC-SRM analyse van het mengsel van de uitwendige peptide standaarden (voer massaspectrometrie zoals beschreven in stap 3.1, Q1 en Q3 isolatie width = 0,7 m / z, rusttijd = 2-50 msec).
  5. Malijks herzien de resulterende LC-SRM gegevens en verwijder alle slecht presterende assays (de analyse van LC-SRM data wordt beschreven in hoofdstuk 5).

4. LC-SRM Testen van biologische monsters

  1. Bereid de gerechten van de gekweekte cellen 44. Als er meerdere experimentele omstandigheden worden vergeleken, blok en willekeurig de monsters om eventuele systematische fouten 45 te verminderen.
  2. Voor elk gerecht van de cellen, zuigen de cel kweekmedium te verspillen en schorten de cellen in een serum vrije buffer 44. Indien nodig, was de cellen in een serumvrij buffer om alle overblijvende extracellulaire eiwitten te verwijderen.
  3. Voor elk monster, tel het aantal levensvatbare en totale cellen met een levensvatbaarheid kleuring (bijvoorbeeld trypan blauw) en een hemocytometer of geautomatiseerde celteller 44.
  4. Pellet de cellen door centrifugeren, en zuig de supernatant om afval 44 (typisch celpellet volume ~ 30 pi).
  5. Meng elk monster met zachte pipetteren en dragen elk een 2 ml buisje (met een schroefdop met een O-ring) bevattende ~ 100 ul van 0,1 mm zirconia / silica beads (merk op dat de kralen snap-cap buizen kunnen gaan lekken ). Lyse van de cellen door vortexen de monsters gedurende 5 minuten op volle snelheid (dit lyseert de cellen door kraal slaan).
    1. Als alternatief lyseren van de cellen met een andere mechanische methode (bijvoorbeeld met behulp van een Franse pers of homogenisering tips).
      Opmerking: Vermijd centrifugeren cellysaten omdat dit zou kunnen pellet neergeslagen eiwit dat kan otherwise tryptically worden verteerd en gedetecteerd met LC-MS.
  6. Voor de oppervlakteactieve gedenatureerde monsters te incuberen bij 90 ° C gedurende 10 min om te proeven homogenisatie en eiwitdenaturatie te staan.
  7. Bath ultrasone trillingen de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur homogenisatie en eiwitdenaturatie te staan.
    Opmerking: De lysaten en lysis buffer kan bij -80 ° C worden bewaard (de lysis buffer nodig zal zijn voor Steps 4,9 en 4,13).
  8. Voer een eiwitconcentratie assay 46 (bijvoorbeeld een bicinchoninezuur assay) van de lysaten (en de lysis buffer als controle-experiment).
  9. Kwalitatieve analyse (dat wil zeggen dat geen interne peptide standaarden worden spiked-in de voorbeelden), pipet 200 ug (eiwitmassa) cellysaat in een schoon 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor kwantitatieve analyse Bereid vier genomen monsters voor een stabiele isotoop verdunningsreeks.
  10. Voor elk monster, voeg een interne eiwit standaard (bijvoorbeeld </ Em>, voeg ~ 5 pmol van ~ 98% zuiver vuurvliegluciferase).
  11. Voor kwantitatieve analyse, voeg de stabiele isotoop verdunningsreeks van de equimolair mengsel van het interne peptide standaarden (bijvoorbeeld 0, 0,2, 2, 20 pmol van elk peptide) aan de monsters.
    1. Tegelijkertijd bereiden controlemonsters met behulp van de interne peptide normen alleen (dat wil zeggen, geen cellysaat) (bv, 0, 0,2, 2, 20 pmol van elke peptide).
    2. Tevens worden controlemonsters met de externe en interne peptide standaarden (bijvoorbeeld: 2 pmol van elke externe peptidenstandaard en 0, 0,2, 2, en 20 pmol van elk intern peptide standaard).
      Opmerking: Zorg ervoor dat de peptide normen zijn vrij van mierenzuur als het kan interfereren met de trypsine spijsvertering.
  12. Voeg lysis buffer zodat alle monsters identiek volumes. Noot: een monstervolume 70 pl, zodat dit volume worden gebruikt voor dit protocol.
  13. Verminder eiwit cysteïne residuen door het toevoegen van 0.7 pl 1 M DTT (vers bereid) aan elk monster (de uiteindelijke DTT concentratie 10 mM) en incuberen van de monsters bij 60 ° C gedurende 30 min.
  14. Alkylate eiwit cystines door toevoeging 7 pl gebufferde joodaceetamide (500 mM joodaceetamide, 1 M HEPES ∙ NaOH pH 8; vers bereid) aan elk monster (de uiteindelijke concentratie joodaceetamide 50 mM) en incuberen van de monsters bij kamertemperatuur gedurende 20 min in het donker (iodoacetamide is lichtgevoelig). Eventueel doven de resterende joodacetamide door toevoeging DTT tot een eindconcentratie van 50 mM.
  15. Voor elk van de monsters gedenatureerd middels urea, voeg 482 ul van 100 mM HEPES ∙ NaOH pH 8 zodat de uiteindelijke ureum bevat 1 M (trypsine significant geremd bij> 1 M ureum 47).
  16. Tryptically verteren de eiwitten in peptiden.
    1. Voor elk monster dat cellysaat bevat, voeg 8 ul van 0,5 ug / ul sequencing kwaliteit gemodificeerd trypsine zodat de uiteindelijke trypsine concentration 01:50 (eiwit w: w) trypsine: monster en incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 18 uur.
    2. Voor elk monster dat cellysaat bevat, voeg 0,5 pl 0,5 ug / ul sequencing rang gemodificeerd trypsine en incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 2 uren (elk van deze monsters voor controle-experimenten, en gewoonlijk bestaan ​​uit 10 ng -10 ug peptide + eiwitmassa).
  17. Voor elk van de ureum- gedenatureerde monsters, voeg 440 ul van 2% v / v mierenzuur (de uiteindelijke concentratie van mierenzuur is 1% v / v). Bevestigen dat deze monsters zijn pH ~ 3.
    1. Voor elk van de oppervlakte-gedenatureerde monsters, voeg 914 ul van 0,5% v / v TFA (het TFA uiteindelijke concentratie 0,5% v / v). Bevestigen dat deze monsters zijn pH ~ 1.5. Incubeer deze monsters bij 37 ° C gedurende 60 minuten om het oppervlak te hydrolyseren.
  18. Microcentrifuge alle monsters bij 21.000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om het oppervlak staartgroep en andere prec pelletipitates dat een C-18 SPE-cartridge zou verstoppen.
  19. Vaste fase extraheren elk van de supernatanten onder toepassing van een wegwerp C-18 SPE-patroon (Buffer A = 0,1% v / v mierenzuur, Buffer B = 0,1% v / v mierenzuur, 80% v / v ACN; ~ 100 mg C- 18 hars per cartridge). Force de mobiele fase via C-18 SPE cartridge met een platte opgedoken rubber bulb, middels een extractie verdeelstuk of door centrifugeren van het patroon in een 15 ml centrifugebuis bij 10 x g gedurende 5 min.
    1. Bevochtig de kolom door toepassing van 1 mi buffer B, evenwicht door toepassing van 1 ml van buffer A tweemaal het monster toe te passen, en was het patroon door toepassing van 1 ml van buffer A tweemaal. Elueer de peptiden door toepassing van 1 mi buffer B langzaam (~ 2 min).
  20. Concentreer elk eluaat in een vacuümconcentrator tot een eindvolume van 100 pl weg verdampen ACN. Voeg 200 ul van H 2 O aan elk monster en concentreer elk in een vacuümconcentrator tot een eindvolume van 98 pl weg verdampen mogelijke reresterende ACN.
  21. Voeg 2 ul van 5% v / v mierenzuur in ACN aan elk monster (het eindmonster concentraties 0,1% v / v mierenzuur, 2% v / v ACN).
    Opmerking: De monsters kunnen bij -80 ° C worden bewaard.
  22. Analyseer de monsters met behulp van LC-SRM (zoals in stap 3.4). Voor kwalitatieve LC-SRM analyseert, lopen de biologische monsters en de externe peptide normen, en analyseren van alle van de resulterende gegevens samen. Voor kwantitatieve LC-SRM analyseert, lopen de isotoop verdunningsreeks van elk biologisch monster, en lopen ook de monsters bestaande uit de peptide normen alleen, en analyseren van alle van de resulterende gegevens samen.

5. LC-SRM Data Analysis

OPMERKING: Peptide identificatie en kwantificatie kan sterk worden vereenvoudigd en deels geautomatiseerd met behulp van software zoals Skyline, maar het is nog steeds sterk aanbevolen dat alle gegevens annotatie handmatig worden beoordeeld. Ook is het het beste om eiwitgehalte informatie tijdens handmatige annot sluitenatie van de LC-SRM data om vertekening te voorkomen.

  1. Voor elk peptide identificatie, bevestigen dat de vorm van elke overgang elutieprofiel is ongeveer Gauss. Voor elke overgang, bevestigen dat het elutieprofiel is het product van meerdere signalen gemeten door de MS-detector (dat wil zeggen, niet het product van één of twee willekeurige pieken MS ruis).
  2. Voor elk peptide identificatie, ervoor te zorgen dat het hele peptide elutieprofiel is geselecteerd. Vermijd het handmatig aanpassen van het elutieprofiel grenzen van subonderdelen van het peptide identificatie (de zware-gelabelde peptide vorm, de niet-gelabelde vorm, individuele voorloper ionen en individuele overgangen).
  3. Bevestig dat elke overgang elutieprofiel een signaal-ruisverhouding (S / N) ≥3. Opmerking: "Noise" verwijst naar willekeurig MS lawaai, niet om het signaal reproduceerbaar uit coeluting analyten. Chromatogram smoothing functies kan enorm helpen bij het analyseren van luidruchtige gegevens.
  4. Voor elk peptide identificatiebevestigen dat alle overgangen bijna identieke elutieprofielen (niet alleen gelijke top bedraagt ​​keer, de elutieprofielen kunnen verschillende amplitudes hebben).
  5. Voor LC-SRM analyse van een grote hoeveelheid van het peptide standaarden (gewoonlijk ≥100 fmol van elk peptide), bevestigen dat het overeenkomstige peptide-elutie-profielen zijn zeer intens (meestal s / n ≥100), en dat de peptide identificaties ondubbelzinnig. Opmerking: Deze zeer zekere identificatie wordt cruciaal voor de identificatie van de betrokken biologische monster afgeleide peptiden.
  6. Voor elk peptide identificatie, bevestigen dat de relatieve overgang intensiteiten overeenkomen met die van het vertrouwen geïdentificeerde peptide standaard. Eventueel weggooien noisy relatief lage intensiteit overgang uitwasprofielen maar bevestigen dat geen enkele betrekkelijk intense overgangen ontbreken. Negeer relatief intense overgang elutieprofielen die aanzienlijk en ondubbelzinnig worden beïnvloed door een coeluerende verontreiniging.
  7. Voor elk peptide identificatie, schatten de kans dat het willekeurig werd geproduceerd door de achtergrond signaal (willekeurige MS ruis plus reproduceerbare signaal van coeluting analyten).
    1. Schat deze kans handmatig door onderzoek van de gehele LC-SRM chromatogram en het schatten van de uniciteit van elk peptide identificatie. Maak een set van vertrouwen peptide identificaties dat naar schatting valse ontdekking tarief (FDR) van 5% heeft. Gebruik strengere criteria (bv FDR ≤1%) als een hoger vertrouwen set van identificaties is vereist (het gebruik van looser criteria wordt niet aanbevolen).
    2. U kunt ook de mProphet algoritme 48 of de audit-algoritme 49, maar handmatig de resultaten te bekijken.
  8. Voor elk peptide identificeren, bevestigen dat de waargenomen elutietijd strookt met de hydrofobiciteit van het peptide (Horizon is ontworpen om deze berekening uit te voeren).
  9. Voor elk peptide, bevestigen datzijn elutietijd is consistent in de LC loopt.
    OPMERKING: LC-SRM analyses soms elutieprofielen die systematisch worden scheef tussen runs produceren. Systematische verschuivingen te verwachten na instrument veranderingen zoals het vervangen van een kolom. Ook kan vroeg eluerende peptiden gevoelig voor verschuiving (vooral als de kolom dichtbij de capaciteit is geladen), en laat eluerende peptiden kunnen ook gevoelig zijn voor verschuiving. Peptide identificatie is nu voltooid.
  10. Om peptide kwantificering verbeteren reinspect elk peptide identificatie en een overgang elutieprofiel niet gebruiken als het bijzonder luidruchtig vergelijking met de andere overgang elutieprofielen van de peptidenidentificatie. Gooi overgang elutieprofiel als de relatieve intensiteit overgang onrechte (in vergelijking met de peptide standaard).
  11. Inspecteer de grenzen van elk precursor ion en overgang elutieprofiel. Eventueel voorzichtig het elutieprofiel grenzen aanpassen om af te snijden achtergrondsignaal (of improve achtergrond signaal schatting).
  12. Voor elk intern standaard peptide, controleer of verontreiniging met een detecteerbare hoeveelheid licht peptide (bepaald volgens de LC-SRM analyse van het interne peptide standaarden staan ​​hierboven beschreven). Vervolgens gooi geen licht peptide elutieprofielen die aanzienlijk werden aangetast door licht-peptide besmetting binnen de interne peptide normen.
  13. Kwantificeer elke overgang elutieprofiel door het berekenen van de LC piekoppervlak. Indien nodig, aftrekken van de geschatte achtergrond signaal. Kwantificering van elk peptide elutieprofiel door het optellen van de overeenkomstige overgang kwantificering waarde (hierna, wordt dit aangeduid als "Sum_Peak_Area" value). Voor elk biologisch monster peptide Sum_Peak_Area waarde, het berekenen van de biologische monster peptide kies overvloed met behulp van gegevens van LC-SRM van interne of externe peptide normen (gebruik alleen de overgangen die met succes werden gekwantificeerd door zowel de biologische monster peptideLC-SRM en die van de peptide standaard).
    1. Kwantificering met behulp van externe peptide standaarden (niet aanbevolen):
      1. Zet de externe peptide standaard Sum_Peak_Area waarden versus de externe peptide standaard molaire overvloed waarden. Produceer een standaard curve door het aanbrengen van een lineaire regressie van de gegevens (meestal, mag alleen de lineaire component van het dynamisch bereik worden gebruikt, elke niet-lineaire component moet worden gebruikt met uiterste voorzichtigheid). Voor elk biologisch monster peptide Sum_Peak_Area waarde, gebruik maken van de standaard curve aan het peptide molaire overvloed berekenen.
        Opmerking: Deze kwantificering methode wordt niet aanbevolen omdat het vereist dat de monstervoorbereiding en LC-SRM zijn aantoonbaarheid robuust, omdat de biologische monsters en externe peptide normen worden opgesteld en geanalyseerd door LC-SRM afzonderlijk. Ook is het niet goed voor matrix effecten (effecten als gevolg van componenten van een ander dan het analysemonster).
    2. Kwantificering met behulp van internepeptide normen (aanbevolen):
      1. Voor elk biologisch monster peptide Sum_Peak_Area waarde en de bijbehorende zware-gelabelde interne peptide standaard Sum_Peak_Area waarde, het berekenen van de licht / zware ratio. Met deze verhouding als een maat voor de corresponderende lichte / zware peptide molaire isotopenverhouding de molaire hoeveelheden van de biologisch monster peptide te berekenen. Specifiek, het biologische monster peptide kies overvloed gelijk is aan de inwendige peptide standaard molaire overvloed vermenigvuldigd met de licht / zware Sum_Peak_Area ratio.
      2. Voor elke biologische repliceren en targetpeptide identificeren het lineaire bereik van de LC-SRM kwantificering door een standaardcurve met behulp van een lineaire regressie. Specifiek, plot van de interne peptide standaard molaire overvloed waarden versus de zware / lichte Sum_Peak_Area verhouding waarden (er rekening mee dat het biologische monster massa constant over de dataset). Vereisen dat elk biologisch monster peptide Sum_Peak_Area waarde binnen het lineaire bereik (typically, worden alleen de lineaire component van het dynamische bereik te gebruiken; elke niet-lineaire component moet worden gebruikt met uiterste voorzichtigheid). Ook het uitvoeren van deze stap voor elk doelpeptide overgang.
        Opmerking: Analyte kwantificering door LC-QqQ-SRM moet lineair zijn over een breed dynamisch bereik (~ 10.000). Aan de lage kant, zal de achtergrond signaal (willekeurige MS ruis plus reproduceerbare signaal van coeluting analyten) kwantificering nauwkeurigheid en precisie te verminderen. Op de high-end, zal detector verzadiging lineariteit leiden (uiteindelijk, dit kan leiden tot elutieprofielen plat vanaf een bepaalde intensiteit van het signaal te zijn).
  14. Eventueel is, een globale normalisering over de monsters, zoals een centrale tendens normalisatie 50, om te corrigeren voor kleine verschillen in hoeveelheid van het monster vóór de spiking in het interne peptide standaarden. Indien nodig, gebruik dan alleen de huishouding eiwitten uit stap 1.1.
  15. Indien nodig, toerekenen ontbreekt quantification waarden 51,52.
    Opmerking: Het is onjuist om gewoon te vervangen ontbrekende waarden met de helft van de ondergrens van kwantificering (LLOQ) of de helft van de detectielimiet (LOD), omdat daarmee kunstmatig zou verminderen kwantificering variantie, en kan resulteren in een statistische toets (bijvoorbeeld een ANOVA ) produceren van een vals positief resultaat (een type I fout). Echter, het negeren ontbrekende waarden kunnen ook problematisch zijn. Als bijvoorbeeld de helft werkelijke overvloed waarden onder de aantoonbaarheidsgrens en de andere helft boven het LLOQ, dan is de gemiddelde waargenomen overvloed zou overschatten betekenen ware overvloed.
  16. Zorg ervoor dat de testen voldoen aan de algemeen aanvaarde richtlijnen voor LC-SRM 23-25. Met name dient de variatiecoëfficiënt van de kwantificering waarden typisch ≤25% voor klinische analyses, en ≤35% voor niet-klinische assays 25. Voor LC-SRM assays met betrekking tot de gezondheidszorg of veterinaire producten of diensten die in aanmerking komen voor regelgeving appRoval, eisen dat de tests voldoen aan de strengere nauwkeurigheidseisen voor dergelijke testen: "De precisie bepaald op elk concentratieniveau mag niet meer dan 15% van de variatiecoëfficiënt (CV), behalve voor de LLOQ, waar het niet hoger mag zijn dan 20% van de CV "23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De ontwikkeling van voorspellende computationele modellen van signaaltransductieroutes is een van de fundamentele doelstellingen van de systeembiologie 53. Jammer genoeg, zelfs voor signaalroutes die uitgebreid bestudeerd en hebben een hoge klinische significantie is nog niet algemeen mogelijk voorspellingen te pathway gedrag in reactie op verstoringen (bijv Dit geldt voor de MAPK / ERK-route 54). Onlangs, een onderzoek in dienst gerichte proteomics, transcriptomics en computationele modellering en simulatie om de muis macrofagen chemotaxis signaleringsroute 56 bestuderen. De focus van het onderzoek werd sfingosine-1-fosfaat-gemedieerde chemotaxis van RAW 264.7 cellen (muis monocyt / macrofaag cellijn). Om pathway modellering vergemakkelijken, werden LC-SRM assays ontwikkeld en uitgevoerd om de absolute rijkdom van de chemotaxis pathway eiwitten in RAW 264.7 cellen te meten. De verkregen waarden werden gebruikt overvloedd als parameters van de pathway model.

De totale experimentele schema (figuur 1) begonnen met een lijst van doeleiwitten die G i2, een heterotrimeer G-eiwit α-subunit inbegrepen. Het succes van de algemene protocol is sterk afhankelijk van de keuze van peptide doelen die proteotypic en quantotypic zijn, zoals YDEAASYIQSK. Mengsels van externe peptide normen werden opgesteld en door de shotgun LC-QqQ-MS (/ MS) geanalyseerd. De resulterende YDEAASYIQSK tandemmassaspectrum bestond uit verschillende fragment ionen, en het had een lage achtergrond (figuur 2). De spectra werden gebruikt voor het LC-SRM doel lijsten met de top tien van meest intense fragmentionen per voorloper ion componeren.

Een mengsel van 409 externe peptide standaarden ("JPT409") werd in drievoud geanalyseerd op kwalitatieve LC-SRM (data niet getoond). Deze steekproef omvatte drie G i2 peptiden, en de identificatie van alle drie wasgeoordeeld vertrouwen te zijn. Vervolgens RAW 264.7 monsters (biologische replicaten "raw1" en "raw2") en de JPT409 steekproef werden elk geanalyseerd in duplo (twee LC-SRM technische repliceert) door kwalitatieve LC-SRM (deze zes LC-SRM analyses werden uitgevoerd zoals op dezelfde wijze als mogelijk). De YDEAASYIQSK peptide werd vol geïdentificeerd in alle zes analysen (figuren 3A - C). De YDEAASYIQSK overgang intensiteit patronen waren consistent in de zes LC-SRM analyses, en deze waren ongeveer vergelijkbaar met de shotgun LC-MS (/ MS) patroon (de "Library" repliceren van figuur 3C).

Het patroon van de overgang intensiteiten alleen is niet altijd voldoende voor de zekere identificatie van een peptide. De peptide hydrofobiciteit en gemeten LC retentietijd moeten consequent zijn. Bovendien moet de buitenwand peptide en de overeenkomstige biologische monster peptiden ongeveer hebbengelijke tijden retentie. De hydrofobiciteit (geschat met de SSRCalc versie 3,0 100 A algoritme 55) en waargenomen retentietijd van YDEAASYIQSK bleken consistent (figuur 4A) zijn. Ook was de retentietijd YDEAASYIQSK tijd gemeten met zowel de RAW 264,7 analyse en de analyse van de externe peptide standaarden en alle retentietijd waarden waren ongeveer gelijk (Figuur 4B).

Het merendeel van de kwalitatieve LC-SRM analyses van de biologische monsters waren succesvol, dus overeenkomstige zwaar-label, gezuiverd, gekwantificeerd interne peptide normen werden opgesteld en spiked-in RAW 264.7 cellysaten. Isotopendilutie series LC-SRM werd gebruikt om monsters bestaande uit de interne peptide standaarden alone (sample "R0 '), de interne en externe peptide standaarden (sample" R1 "), en zes RAW 264.7 biologische repliceert (samples" R2 "analyseren - 'R7'). Twee different eiwit denaturerende middelen werden gebruikt om te testen voor mogelijke eiwitten oplosbaar, denaturatie, alkylering en / of digestie problemen die kunnen aantasten accurate kwantificering doeleiwit (samples R2-R4 gebruikte ureum en samples R5-R7 gebruikt RapiGest SF). De lichte en zware vormen van YDEAASYIQSK bevatte bijna identieke overgang intensiteit patronen en elutieprofielen (figuren 5A - C). LC-SRM gesommeerde piekoppervlakken werden gebruikt als een maat voor relatieve abundantie peptide en de YDEAASYIQSK verhoudingen werden gebruikt voor G i2 overvloed berekenen in eenheden kopieën per RAW 264.7 cellen. Daarnaast werd een tweede G i2 interne peptidenstandaard (IAQSDYIPTQQDVLR) werd gebruikt om kwantitatieve G i2 LC-SRM assays van dezelfde RAW 264.7 monsters uitgevoerd en de beide assays verkregen zeer soortgelijk G i2 overvloed metingen over alle biologische repliceert (fig 5D). Het akkoord van de twee G i2 LC-SRM assays accuraat en nauwkeurig zijn.

In totaal werden 35 eiwitten gekwantificeerd met 58 interne peptide standaarden (Tabel 1). Met name de LC-SRM testen van de interne eiwit standaard (vuurvliegluciferase; Step 4,11) waren accuraat en nauwkeurig. De uitgebreide set van gegevens Skyline van dit onderzoek is verkrijgbaar bij de Panorama online LC-SRM database (in de map Manes_RAW_Chemotaxis op https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view).

Figuur 1
Figuur 1:. Overzicht van het protocol Three voorlopige targetpeptiden voor G i2 (a heterotrimere G-eiwit α-subunit) werden geselecteerd voor externe standaard peptide synthese. Deze waren analyzed van shotgun LC-MS (/ MS) drie G i2 LC-SRM assays te ontwikkelen en deze testen werden gebruikt om kwalitatieve analyses van biologische monsters uitgevoerd. Alle drie G i2 targetpeptiden werden geïdentificeerd, en twee werden geselecteerd voor interne peptide standaard voorbereiding. Trypsine-splitsbare "JPT-Tags" werden gebruikt om de interne peptide standaarden met UV spectrofotometrie te kwantificeren. De interne peptide standaarden werden gebruikt om kwantitatieve G i2 LC-SRM assays van RAW 264.7 monsters uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Shotgun LC-MS (/ MS) De afgebeelde massaspectrum ontstaan ​​uit de analyse van een van de G i2 uitwendige peptide standaarden (YDEAASYIQSK). Hiervoor precursorion, de top tien van meest intense overgangen werden geselecteerd voor LC-SRM (exclusief de a1 1+ fragment ion vanwege de korte lengte). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3:. Kwalitatieve LC-SRM van G i2 The YDEAASYIQSK chromatogram van JPT409 analyses bevatte een zeer lage achtergrond en het peptide werd geïdentificeerd vol (A). De overeenkomstige RAW 264.7 analyses geleid tot meer achtergrondsignaal, maar de peptidenidentificatie nog eenduidig ​​(B). De relatieve overgang intensiteit patronen waren consistent in alle zes de LC-SRM-analyses (twee technische replica van drie onafhankelijke monsters), en deze waren ongeveer SimiLAR om de bijbehorende shotgun LC-MS (/ MS) patroon (de "Library" repliceren) (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Peptide retentietijd voorspelling variatie tussen runs Een lineaire regressie berekend met de geschatte hydrofobiciteit, gemeten kwalitatieve LC-SRM elutietijd van de targetpeptiden en de voorspelde en gemeten elutietijden van YDEAASYIQSK waren consistent (A). . Bovendien analyseert de samenhang van de waargenomen elutietijd van elk peptide over de LC-SRM bepaald. De elutietijd van YDEAASYIQSK overspannen verschillende ~ 40 sec, die overeenkomen met de nauwkeurigheid van de LC-SRM instrument werd toegepast (waardeszijn de top bedraagt ​​tijd +/- de volle breedte op halve-max, en ook de volle breedte aan de basis van de piek) (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5:. Kwantitatieve LC-SRM van G i2 De overgang chromatogrammen van het biologische monster peptide (A) en de interne peptidenstandaard (B) had consistente relatieve intensiteiten overgang, en werden opgeteld (C) (afgebeeld is de "R2" -analyse YDEAASYIQSK voor gebruik 10 fmol interne peptidenstandaard). De lichte en zware uitwasprofielen waren consistent (C), en de verhouding van het oppervlak onder deze curven werd gebruikt als maat voor de light / zware peptide overvloed. Een tweede G i2 interne peptidenstandaard (IAQSDYIPTQQDVLR) werd gebruikt voor de kwantitatieve LC-SRM in parallel en de resulterende G i2 abundantie waarden waren consistent in zowel de biologische zes herhalingen en twee targetpeptiden (overall, n = 12 en CV = 8,38 %) (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

<td> 68.467
UniProt Toetreding Doeleiwit Target Peptide Overvloed (fmol / ug) Overvloed (kopieën / cel, genormaliseerd) CV
P08659 Luciferase (UV bij 280 nm) 23,824 n / a n / a
P08659 Luciferase VVDLDTGK 24,103 n / a 7%
P08659 Luciferase VVPFFEAK 24,717 n / a 4%
P60710 Actine, cytoplasmatisch 1 IWHHTFYNELR 760,448 61762598 3%
P16858 GAPDH LISWYDNEYGYSNR 357,803 28906524 14%
P06151 Lactaatdehydrogenase LLIVSNPVDILTYVAWK 129,623 10633145 30%
P99024 Tubuline β 5 ALTVPELTQQVFDAK 78,765 6.398.971 3%
P20152 Vimentine SLYSSSPGGAYVTR 121,100 9.807.488 10%
P60766 CDC42 DDPSTIEK 86,647 6.957.317 27%
P60766 CDC42 QKPITPETAEK 26,475 2.153.669 6%
Q8C3J5 DOCK2 ETLYETIIGYFDK 1.459 118.539 15%
Q8C3J5 DOCK2 ISSSPTHSLYVFVR 1.795 143.440 33%
Q8BPU7 ELMO1 ALTTKPSSLDQFK 2.302 186.754 7%
Q8BPU7 ELMO1 SAIDISILQR 1.244 99.728 25%
Q8BGM0 FGR GAYSLSIR 1.099 89.473 17%
Q8BGM0 FGR WTAPEAALFGR 0.319 24.766 6%
P27601 Ga-13 GIHEYDFEIK 0,843 15%
P27601 Ga-13 VFLQYLPAIR 1.295 106.176 23%
P08752 Ga-(i) 2 IAQSDYIPTQQDVLR 10.900 885.701 2%
P08752 Ga-(i) 2 YDEAASYIQSK 9,774 790.616 9%
Q9DC51 Ga-(k) EYQLNDSASYYLNDLDR 6,574 537.862 15%
Q9DC51 Ga-(k) ISQTNYIPTQQDVLR 3.504 285.784 10%
P62874 Gp 1 AGVLAGHDNR 17,078 1.385.578 4%
Q9CXP8 Gy 10 DALLLGVPAGSNPFR 2.167 179.178 36% P63213 Gy 2 EDPLLTPVPASENPFR 3,284 266.360 8%
Q80SZ7 Gy 5 VSQAAADLK 6,087 493.512 6%
P08103 HCK GPVYVPDPTSSSK 1.143 93.044 12%
P08103 HCK IIEDNEYTAR 0,944 77.147 19%
P43406 Integrin α V AGTQLLAGLR 0.276 22.264 32%
P43406 Integrin α V SHQWFGASVR 0,443 34.235 5%
P25911 LYN VIEDNEYTAR 1.461 119.377 13%
Q5SW28 PI3K regelgeving 5 AGFPGILDTASPGK 0.301 24.331 11%
Q8K3B3 PI3K regelgeving α LYEEYTR 0,472 38.592 16%
Q8K3B3 PI3K regelgeving α TWNVGSSNR 0,524 42.697 12%
Q8K3B3 PI3K regelgeving α VLSEIFSPVLFR 0.440 35.902 20%
Q5U3K7 PI3K regelgeving β DTPDGTFLVR 0,188 15.262 30%
Q5U3K7 PI3K regelgeving β IAEIHESR 0.282 22.561 13%
Q0VGQ5 PI3K α LINLTDILK 0,102 8494 38%
Q8CI98 PI3K δ HEVQEHFPEALAR 0,178 14.566 22%
Q8CI98 PI3K δ ITEEEQLQLR 0,481 38.709 24%
Q9ES52 PIP3 5-fosfatase 1 IVVLAKPEHENR 0,486 39.194 19%
Q9ES52 PIP3 5-fosfatase 1 LSQLTSLLSSIEDK 2.056 167.123 7%
Q69ZK0 PIP3-afhankelijke Rac GEF 1 DSVLSYTSVR 0,647 52.712 32%
Q69ZK0 PIP3-afhankelijke Rac GEF 1 NQLLLALLK 0,354 27.425 5%
Q9CQE5 RGS 10 ASSQVNVEGQSR 2.460 199.782 4%
Q9CQE5 RGS 10 WASSLENLLEDPEGVQR 20,647 206.005 11%
Q9CX84 RGS 19 AEANQHVVDEK 0,495 39.753 21%
Q9CX84 RGS 19 LIYEDYVSILSPK 0,846 68.481 22%
B9EKC3 Rho GAP 5 DGLAQELANEIR 0,448 34.653 10%
Q99PT1 Rho GDI 1 SIQEIQELDK 3,156 267.063 16%
Q99PT1 Rho GDI 1 VAVSADPNVPNVIVTR 37,077 3.006.168 5%
Q61599 Rho GDI 2 LNYKPPPQK 37,975 3.086.596 3%
Q61599 Rho GDI 2 YVQHTYR 21,436 1.711.908 47%
Q61210 Rho GEF 1 FDGAEGSWFQK 2.149 176.139 47%
Q61210 Rho GEF 1 SGLELEPEEPPGWR 2.911 236.483 8%
Q9QUI0 RhoA QVELALWDTAGQEDYDR 43.500 3.532.438 8%
P70336 Rock2 GAFGEVQLVR 0.527 42.800 23%
P70336 Rock2 IYESIEEAK 1.011 83.794 33%
P70336 Rock2 LEGWLSLPVR 0,573 48.259 22%
Q8R0X7 S1P lyase 1 AGYPLEKPFDFR 1.787 147.043 27%
Q8R0X7 S1P lyase 1 TPEIVAPESAHAAFDK 3,562 291.791 18%

Tabel 1: Kwantitatieve LC-SRM van RAW 264.7 celeiwitten Vijfendertig RAW 264.7 cel eiwitten werden gekwantificeerd met behulp van achtenvijftig interne peptide normen en zes biologische herhalingen.. Vijf van de eiwitten werden housekeeping eiwitten (actine, GAPDH, lactaat dehydrogenase, tubuline en vimentine), en gekwantificeerd normalisatie door biologische monsters (stap 1,1) mogelijk. Bovendien werd een interne standaard spiked-eiwit in elk cellysaat en gekwantificeerd door LC-SRM (4,765 pmol van vuurvlieg luciferase per 200 g monster; 98% zuiver volgens SDS-PAGE; spectrofotometrisch gekwantificeerd bij 280 nm, stap 4.11). De CV-waarden werden berekend over de zes biologische replicaten met de globaal genormaliseerde overvloed waarden (met uitzondering van luciferase, stap 5.15).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Absolute eiwit kwantificering is essentieel voor een zeer divers aanbod van biomedische toepassingen zoals biomarker validatie en signaaltransductiepad modellering. Onlangs, gerichte proteomics met behulp van LC-SRM heeft geprofiteerd van verbeteringen in tal van technologieën, waaronder peptide standaard voorbereiding, HPLC, QqQ-MS en LC-SRM data-analyse. Bijgevolg is het uitgegroeid tot een krachtig alternatief voor immunoassays. Immunoassays kunnen zeer gevoelig en high-throughput, maar ontwikkeling van een robuust immunoassay kan zeer uitdagend omdat immunoassays kwetsbaar voor kruisreactiviteit en / of interferentie, onverenigbaar met cel / weefsel lysis / homogeniseren methoden kunnen zijn en / of niet vatbaar multiplexen 5,8. Bijvoorbeeld, de meest uitgebreide test voor kruisreactiviteit is de immunoassay met monsters die afkomstig van gen knockouts, die kan worden uitdagend om te bereiden voeren.

Dit protocol beschrijft doel Peptide selectie, LC-SRM assay ontwikkeling, kwalitatieve en kwantitatieve LC-SRM, en LC-SRM data-analyse. Het werd gebruikt om de absolute overvloed 36 chemotaxis pathway eiwitten in RAW 264.7 cellen 56 te meten, maar de toepasbaarheid reikt verder dan deze specifieke toepassing. Hoewel het is ontworpen om eiwitten in cel- pellets kwantificeren, kan worden aangepast voor de analyse van andere biologische monsters (bv biovloeistoffen) en andere SRM doelen (bijv fosfopeptiden). Zo veranderen de homogenisatie en / of eiwitvertering protocol aanzienlijk verbeterd solubilisatie denaturatie, alkylering, spijsvertering en kwantificatie van bijzonder moeilijk doeleiwitten (bijvoorbeeld membraaneiwitten), of kan de analyse van bijzondere uitdaging monsters (bijvoorbeeld monsters inschakelen bevattende <100 ug proteïne massa).

De eerste selectie van targetpeptiden is kritisch, maar kan tijdrovend zijn. Voor hundreds van doeleiwitten, kan een ad hoc score worden voor elk criterium, en de voorlopige targetpeptiden kan worden gerangschikt op basis van de som van de scores, zoals hiervoor is 56 uitgevoerd. Als alternatief kan deze analyse worden geautomatiseerd met behulp van PeptidePicker, een web-interface die sterk vereenvoudigt doelpeptide selectie 30 (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/).

Nadat de targetpeptiden zijn geselecteerd en LC-SRM assays zijn ontwikkeld, is het essentieel dat kwalitatief LC-SRM testen van de biologische monsters worden uitgevoerd omdat zelfs een zeer proteotypic en quantotypic peptide niet detecteerbaar zijn als het eiwit wordt tot expressie gebracht op niveaus onder de drempel van het instrument, of als de achtergrondinterferentie is vooral problematisch. Een tweede aspect van de scheiding (bijvoorbeeld sterke kation uitwisseling HPLC, high-pH omgekeerde fase HPLC en gelvrij elektroforese) kan proteoom diepte toenemen, maar vergtaanzienlijk meer instrumenttijd en gegevensanalyse. Als alternatief kan een verrijking strategie (bijvoorbeeld peptide- en proteïne-level immunoenrichment en Celfractionering) verbeteren proteoom diepte en immunodepletie van sterk overvloedige proteïnen worden gebruikt om interferentie te verminderen door coeluting analyten.

LC-SRM van ~ tientallen monsters voor ~ ~ honderden of duizenden overgangen vereist meestal uitgebreide instrument tijd. Hoewel het niet werd gebruikt voor deze studie, LC-SRM plannen (meten overgangen tijdens de pre-gespecificeerde elutietijd ramen) maakt de analyse van meer overgangen per run. Ook, rooster vermindert de SRM duty cycle betrekkelijk lege periodes van de LC gradiënt, en dit kan leiden tot een verbeterd identificatiesysteem peptide en kwantificatie. Echter, planning vereist dat het peptide elutietijd vertrouwen worden bepaald op basis van een kwalitatieve LC-SRM-analyse. Subtiele wijzigingen aan het monster voorbereiding, de LC-MS instrument,of de LC-MS-methode kan leiden tot plannen om te snijden of zelfs geheel missen targetpeptiden. Zo werden het biologische monster YDEAASYIQSK uitwasprofielen enigszins verschoven ten opzichte van die externe peptide standaard (figuur 4B), mogelijk door matrixeffecten.

Samengevat, is een stap-voor-stap protocol gepresenteerd voor de ontwikkeling en toepassing van LC-SRM voor absolute eiwit kwantificatie. Absolute kwantificatie van eiwitten door LC-SRM is reeds aangetoond reproduceerbaar tussen laboratoria 16,19 te zijn. Proteomics technologieën, waaronder monstervoorbereiding (bijv, automatisering), vloeistofchromatografie, massaspectrometrie, en de data-analyse, snel verbeteren, en wordt mogelijk LC-SRM te praktisch voor grootschalig onderzoek en klinische toepassingen. De specificiteit, gevoeligheid, nauwkeurigheid, reproduceerbaar en high-throughput van kwantitatieve LC-SRM maakt het een krachtig hulpmiddel voor het fundamenteel onderzoek en medische biologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade Fisher A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit Fisher 23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm BioSpec Products 11079101z
Bestatin hydrochloride Sigma B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) Lonza 12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 Gibco 15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11550
Cell culture L-glutamine Sigma G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Gibco 10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v Lonza 17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers Nexcelom Bioscience CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules Fisher A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep Marienfeld-Superior 0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2 Mediatech 25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id Polymicro Technologies 1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene SUN SRI 200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone SUN SRI 500-061
Luciferase, from Photinus pyralis Sigma L9506-1MG
Pepstatin A EMD Millipore 516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) EMD Chemicals 9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail Roche 04906837001
RapiGest SF Waters 186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge Waters WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position Waters WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb Fisher 03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
SpeedVac vacuum concentrator Fisher SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Tube decapper for Micronic tubes USA Scientific 1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile Sarstedt 72.694.006
Urea Sigma U0631-500g
Water, LC-MS grade Fisher W6-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
  2. Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
  3. Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
  4. Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
  5. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
  6. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
  7. Wild, D. The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , 4th edn, Elsevier. (2013).
  8. Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
  9. Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
  10. Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
  11. Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
  12. Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
  13. Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
  14. Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
  15. Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
  16. Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
  17. Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
  18. Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
  19. Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
  20. Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. Peptide synthesis and applications. , 2nd edn, Humana Press Springer. (2013).
  21. Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
  22. Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
  23. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070107.pdf (2001).
  24. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration; Revision 1 (draft). Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf (2013).
  25. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
  26. Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
  27. Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
  28. Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
  29. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  30. Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
  31. Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
  32. Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
  33. Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
  34. Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
  35. Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
  36. Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
  37. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
  38. Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
  39. Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
  40. Alterman, M. A., Hunziker, P. Amino acid analysis : methods and protocols. , Humana Press. (2012).
  41. Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
  42. Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
  43. Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
  44. Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th edn, Wiley-Blackwell. (2010).
  45. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
  46. Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
  47. Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
  48. Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
  49. Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
  50. Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
  51. Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16. S5 (2012).
  52. Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
  53. Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
  54. Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
  55. Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
  56. Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. Mol Cell Proteomics. , Forthcoming.

Tags

Biochemie absolute kwantificering vloeistofchromatografie massaspectrometrie geselecteerd reactie monitoring stabiele isotoop verdunning serie gerichte proteomics triple quadrupool
Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manes, N. P., Mann, J. M.,… More

Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10.3791/52959 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter