Bioengineering

الصلبة الدهون النانوية (SLNs) لاستهداف التطبيقات بين الخلايا

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

وقد أظهرت وسائل إيصالها القائم على جسيمات متناهية الصغر وعودا كبيرة للتطبيقات التي تستهدف الخلايا، وتوفير آلية لتغيير وجه التحديد الإشارات الخلوية والتعبير الجيني. هذه المركبات يمكن تحميلها مع المخدرات، والبروتينات، والأحماض النووية مصممة للتأثير الاستجابات الخلوية وتحقيق التأثير المطلوب في الأنسجة المستهدفة. تم استكشاف العديد من أنواع nanocarriers لفائدة علاجية وتشخيصية بما في ذلك الدهون، والبوليمرات، والسيليكون، والمواد المغناطيسية. هذه النظم هي جذابة نظرا لقدرتها على العقاقير الموضعية، وزيادة التركيز العلاجي في الأنسجة المستهدفة، والحد من سمية جهازية.

النانوية الدهون الصلبة (SLNs) هي مثال مدروسة لنظام تسليم جسيمات متناهية الصغر التي برزت باعتبارها واعدة المركبات تسليم المخدرات في السنوات الأخيرة. SLNs يمكن أن تصاغ بسهولة لتطبيقات متعددة ^بما في ذلك 1 الاستشعار البيولوجية، ومستحضرات التجميل ^2، ورتسليم herapeutic ^3-7. تنبع فائدتها من حقيقة أنها تتألف بالكامل من resorbable، والدهون غير سامة، مما أدى إلى تعزيز توافق مع الحياة. خلال التوليف، ويمكن إدراج الأدوية محبة للدهون في المركبات SLN، وبالتالي زيادة القابلية للذوبان في المخدرات وصلاحيتها للبالحقن. سيارات SLN يساعد أيضا على تحقيق الاستقرار العلاجات مغلفة، والحد من تدهورها وإزالة الألغام، وتعظيم العمل العلاجي. هذه المركبات بشكل خاص مناسبة تماما لطويل المفعول، والأعمال التحضيرية تسيطر عليها الافراج عن نظرا لاستقرارها في درجة حرارة الجسم ^3،4،8،9. الأهم من ذلك، تغليف الأدوية النانوية في الدهون يغير ملامح الدوائية الجوهرية للجزيئات الدواء. وهذا يوفر ميزة محتملة من خلال السماح بإطلاق سراح تسيطر المخدرات مع مؤشر العلاجي الضيق. معدل الإفراج عن العلاجات-أدرجت SLN يمكن ضبطها على أساس معدل التحلل الدهني أو معدل انتشار المخدرات فيمصفوفة الدهون.

وغالبا ما المهندسة SLNs تتراكم في الأنسجة المستهدفة المحددة. على سبيل المثال، حجمها (عادة أكبر من 10 نانومتر) يقوي الاحتفاظ في الدورة الدموية، حيث الأوعية الدموية المتسرب من نسيج الورم يسهل ترسب. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تبين أن طريقة التعاطي الجسيمات لتغيير biodistribution مع القدرة على استهداف البنى فسيولوجية معينة مثل الغدد الليمفاوية ^10،11. على ترسب في الأنسجة المستهدفة، وتحقيق التفاعلات الخلوية المناسبة واستيعاب نهاية المطاف النانوية يشكل تحديا نظرا لقدرة أغشية الخلايا للسيطرة بشكل انتقائي تدفق الأيونات والجزيئات داخل وخارج الخلية ^12. لتسهيل امتصاص الخلوية، فمن الممكن تعديل nanocarriers مع بروابط معينة بما في ذلك الببتيدات، جزيئات صغيرة، والاجسام المضادة ^13،14. العديد من الآليات بما في ذلك اختراق السلبي والنقل النشط النانويةعبر غشاء الخلية قد تم وصفها سابقا ^3،12،15. بشكل عام، وقد ثبت أن تفاعلات الخلايا جسيمات متناهية الصغر تتأثر الخصائص الفيزيائية للجسيمات النانو بما في ذلك الحجم والشكل، وتهمة السطحية والكيمياء السطحية، بالإضافة إلى المعلمات خلية محددة مثل نوع من الخلايا أو الخلية مرحلة دورة ^12.

أظهر تحقيق سابق توليف الفرعية 10 SLNs نانومتر للالموضعية ^{16 و} العلامات البيولوجية التطبيقات كشف ¹ باستخدام طريقة درجة الحرارة مرحلة انقلاب (PIT) ^17. هذه هي طريقة تركيب لطيف حيث ² يبقى التكوين المستمر بينما يتم تغيير درجة الحرارة تدريجيا. التقليب المستمر من الحل ساخنة، لأنه يبرد إلى نتائج RT في nanoemulsion. ينتج عن هذه العملية في تركيب SLNs مع حجم أصغر الجسيمات ¹ من ذلك ذكرت سابقا باستخدام أساليب مختلفة لتركيب الدهون نانoparticles ^17-22. مقياس حجم الناتج أقل من 20 نانومتر، ويوفر ميزة لتطبيقات استهداف الخلايا نتيجة لزيادة مساحة السطح والإمكانات لتعزيز التفاعلات الخلوية.

A التخطيطي SLNs، وتهدف إلى تقديم صبغة الفلورسنت أو العلاجية، ويظهر في الشكل 1. تتكون SLNs من الدهون الداخلية (على سبيل المثال، ألكان الخطية) السماح بإدماج المركبات محبة للدهون (على سبيل المثال، والأصباغ أو المداواة) والخارجي السطحي (السطحي غير أيوني على سبيل المثال، وخطي) تحيط بها المياه. في هذه الدراسة، تم تحميلها SLNs مع صبغة الفلورسنت وتستخدم كنموذج للتحقيق في التفاعلات خلية الجسيمات. تعرضت الخلايا الليفية الجلدية الإنسان الأساسية والخلايا الجذعية الماوس لتحميل صبغ SLN على مر الزمن من أجل توصيف التفاعلات فيما يتعلق سمية وامتصاص الجسيمات. وكان 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) -2،5-diphenylphenyltetrazolium بروميد (MTT) فحص utiliزد من أجل تحديد مستويات الجرعات المناسبة. كانت المجهري مضان والتدفق الخلوي اثنين من الأساليب المستخدمة لفحص امتصاص الجسيمات في المختبر.

الشكل 1. رسم تخطيطي للSLN تبين المكونات الرئيسية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجهيز SLNs

توليف SLNs
ملاحظة: استخدام أسلوب PIT ^1،17،20 لإعداد الفرعية 20 نانومتر SLNs ^1.
1. استخدام تقنية العقيم، bioreagents أو زراعة الخلايا الكواشف الصف، والمواد المعقمة (أي الماصات، ملاعق، قارورة، وما إلى ذلك).
2. استخدام الوزراء للسلامة الأحيائية لتركيب SLNs (الشكل 2).
3. الجمع بين 0.6 ملغ من صبغة الفلورسنت (النيل الأحمر (نير)، وتركيز نير ما يقرب من 0.3 ملغ / مل) و 0.10 غرام من Heneicosane (الدهن، 5 وزن / وزن٪ تركيز الدهون) في قارورة (15 مل)، وشارك في تذوب في 90 ° C، ويقلب.
4. إضافة 0،11 ز البولي أوكسي إتيلين (10) الأثير أوليل (السطحي، 5.5 وزن / وزن٪ تركيز بالسطح). شارك في إذابة الخليط الناتج على 90 ° C ويقلب.
5. إضافة 1.79 غرام من الماء المعقم إلى الخليط، والحرارة إلى 90 درجة مئوية، ويحرك حتى يتم تشكيل nanoemulsion شفافة.
  ملاحظة: في ظل استمرار التحريك والتبريد للرقابة، SLيتم إنشاء نانوثانية. هذه الشروط تتسبب في انقلاب من مستحلب الماء في الزيت إلى مستحلب النفط في المياه. جزيئات محبة للدهون مثل نير قسم إلى قطرات الدهون.
6. إعداد nanoemulsion بالتوازي دون إضافة صبغة الفلورسنت، وذلك لتكون بمثابة عينة السيطرة. الجمع بين 0.10 غرام من Heneicosane و 0.11 غرام البولي أوكسي إتيلين (10) الأثير أوليل إلى قارورة (15 مل) المشارك تذوب في 90 ° C، ويقلب.
  1. إضافة 1.79 غرام من الماء المعقم إلى الخليط، والحرارة إلى 90 درجة مئوية، ويحرك حتى يتم تشكيل nanoemulsion شفافة.
7. وعلاوة على ذلك تعقيم كل nanoemulsion باستخدام معقم 0.2 ميكرون التصفية.
الشكل 2. تخطيطي لتركيب SLNs. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
حجم الجسيمات وبولydispersity
1. استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS) لقياس حجم الجسيمات والتشتت المتعدد من SLNs ^{1 باستخدام} كوفيت الزجاج وأداة مصممة لقياس حجم الجسيمات.
2. قبل قياسات للعينات، وقياس أحجام الجسيمات اثنين من المعايير المعروفة التالية بروتوكول الشركة المصنعة لإعداد وقياس معايير.
3. ملء كفيت الزجاج مع 1.5 مل من محلول قياسي وقياس الحل قياسي باستخدام شروط القياس نفس العينات.
  ملاحظة: وقد تكرر الخطوة السابقة لكل معيار.
4. قياس العينات وإعدادها. لكل، استخدم المعلمات التجريبية التالية: وقت التشغيل 100 ثانية، ومعامل انكسار الماء (1.33)، واللزوجة من الماء عند 20 درجة مئوية (1.002 ميجا باسكال · ثانية).
  ملاحظة: يستخدم هذا الأسلوب تردد تحول من الضوء لقياس حجم الجسيمات النانوية.
5. الإبلاغ عن متوسط قطرها الجسيمات والتشتت المتعدد للحزبشركة كلي حجم التوزيع.
ذوبان نقطة والكامنة للحرارة الانصهار
1. استخدام مسعر المسح التفاضلي (DSC) مجهزة لصناعة السيارات في أخذ العينات ومصدر تبريد النيتروجين السائل للتحقيق في السلوك الحراري للSLNs ^1.
2. ماصة كما أعدت-SLNs إلى الألومنيوم عموم 40 ميكرولتر مع كتلة من ما يقرب من 25 ملغ و بإحكام اغلاق المقلاة باستخدام الصحافة المكشكش العالمي للحد من فقدان الرطوبة أثناء الفحص DSC.
3. قياس كل nanoemulsion 5-80 ° C.
4. الإبلاغ عن نقطة انصهار والحرارة الكامنة لانصهار من مؤامرة DSC، حيث يمثل وادي درجة انصهار وتكامل المنطقة تحت المنحنى في المؤامرة DSC مقسوما على كمية المواد تمثل الحرارة الكامنة لانصهار.

2. SLNs التفاعل مع الخلايا الليفية والخلايا الجذعية

ثقافة الابتدائية الخلايا الليفية الإنسان
1. ثقافة فاي البشري الأساسيbroblasts وفقا لتعليمات الشركة الصانعة في الوسط السائل لثقافة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (المتوسطة 106)، على أن تستكمل مع انخفاض ملحق النمو المصل (LSGS) عدة. الحفاظ على الخلايا في جو مرطب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _{2 و} ثقافة فرعية عند بلوغ 80٪ التقاء.
2. لكل من MTT والتحليل والتصوير، وخلايا البذور في لوحة 96-جيدا، في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر، والسماح للتوازن عند 37 درجة CO / N قبل التعرض SLN.
3. في وقت الصفر، وتمييع SLNs في المتوسط كاملة كما هو مبين (الشكل 4)، فيما يتعلق تركيز الدهون، وإضافة 10 ميكرولتر لكل بئر لكل تتكاثر بشكل جيد في لوحة 96-جيدا.
4. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2، خلال فترة الحضانة.
MTT سمية الفحص
1. بعد 24 ساعة من الحضانة مع SLNs، وتحديد الجدوى الخلوية باستخدام فحص MTT، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </ لى>
2. غسل خلايا مرة واحدة وإضافة متوسطة جديدة إلى كل بئر (100 ميكرولتر / جيد). قتل آبار المراقبة التي يحتضنها في حل الميثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة قبل استبدال مع المتوسط الطازجة.
3. إضافة كاشف MTT (10 ميكرولتر لكل بئر) إلى كل بئر من صفيحة ميكروسكوبية واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
4. بعد O / N الحضانة، وإذابة البلورات formazin الخلايا مع محلول منظف المقدمة (100 ميكرولتر لكل بئر) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
5. بعد 3 ساعات من الحضانة في RT، الحصول على قيم الامتصاصية في الطول الموجي قياس 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
  كاشف MTT المستخدمة يجب أن تكون أقل من 1٪ (وزن / حجم) 3- (4،5-dimethylthiazolyl-2) -2، بروميد 5-ثنائي-نتروبلو: مذكرة.
مضان المجهر
1. في نقطة زمنية محددة بعد الجرعات من الخلايا الليفية مع SLN، وغسل الخلايا الليفية مرتين مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) وإصلاح لمدة 10 دقيقة مع بارد 70٪ الميثانول.
2. بعد 10 دقيقةاستبدال الميثانول مع برنامج تلفزيوني والتقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب، وذلك باستخدام تمريرة الفرقة (BP) 690/50 نانومتر تصفية مجموعة.
ثقافة خلايا الفأر نخاع العظم الجذعية
1. حمل الماوس العظام المستمدة من نخاع الخلايا الجذعية (BMDC) كما هو موضح سابقا ^23،24. لفترة وجيزة، تعليق خلية لوحة واحدة من C57BL / 10 نخاع العظام في 100 ملم أطباق بتري في 2 × 10 ⁶ / لوحة مع المؤتلف الفئران عامل تحفيز مستعمرة الكريات البيضاء بلعم (GM-CSF، 300 U / مل)، والفئران المؤتلف IL-4 (خلية B عامل تحفيز، 200 U / مل). تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام.
2. في يوم 7، إضافة SLNs نير تحميلها على الأطباق في تركيز النهائي من 0.5 و 5.0 ميكروغرام / مل الدهون والحفاظ على خلايا في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ حاضنة للطول المطلوب من التعرض.
3. جمع الخلايا من الأطباق بواسطة الشفط جميع وسائل الإعلام في لوحة، وجمع ذلك في أنبوب 50 مل، تليها الغسل الكامل من لوحة (لطرد إعلان فضفاضةخلايا herent) مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 4 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA). جمع تعليق خلية تم الحصول عليها في نفس أنبوب 50 مل.
تقييم SLNs التأسيس عن طريق التدفق الخلوي
1. تحديد تركيز تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في النقطة 2.4.3 وتوزيع 3x10 ^{5 خلايا} إلى 12 مم × 75 مم أسفل جولة FACS أنبوب.
2. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني ومن ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق في 400 x ج، عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. تجاهل طاف و resuspend بيليه مع 100 ميكرولتر من PBS / 2 ملي EDTA / 0.1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) (العازلة تلطيخ) التي تحتوي على مكافحة CD11c و-FITC الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (0.25 ميكروغرام / مل النهائي). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
4. غسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق في 400 x ج، عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
5. تجاهل وطاف resuspend كلبيليه مع 400 ميكرولتر من العازلة تلطيخ. الخلايا هي الآن جاهزة للشراء من العينات مع الكريات تدفق (ربما مجهزة ليزر زرقاء وحمراء).
6. باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل، وتقييم مستوى إدماج SLNs بواسطة DC بواسطة المعزولة على سكان CD11c و+ الخلايا (FITC إيجابي) والمقارنة بين شدة المرتبطة SLNs مضان (المقاسة في القنوات PerCP-Cy5.5 أو APC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام أسلوب PIT لتجميع SLNs وتم تحديد درجة الحرارة مرحلة انعكاس باستخدام حمام مائي. كانت النماذج تسخن ببطء وتحريكها بلطف حتى ظهر حل واضح. درجة الحرارة المرحلة انعكاس لSLNs التي تستخدم فيها الدهون heneicosane 45 ° C. ويلخص الجدول 1 حجم الجسيمات، والتشتت المتعدد، نقطة انصهار والحرارة الكامنة لانصهار لSLNs. أدى SLNs تصنيعه باستخدام ظروف التصنيع المذكورة أعلاه في SLNs السيطرة وSLNs نير محملة متوسط قطرها الجسيمات من 18.59 و16.87 نانومتر ومع التشتت المتعدد من 5.83 و 4.47 على التوالي (الشكل 3). تم رصد استقرار تشتت SLNs من قبل قياس حجم الجسيمات على مدى 6 أيام في درجتي حرارة التخزين المختلفة (4 و 23 ° C). وقال إن حجم الجسيمات لم تتغير على مدى 6 أيام (لا تظهر البيانات).

السلوك الحراري للSLNs كان investigATED باستخدام المسح التفاضلي قياس الكالوري. وSLNs توليفها لديهم درجة انصهار 38.0 (± 0.4) و 36.8 (± 0.2) درجة مئوية لSLNs السيطرة وSLNs نير تحميلها، على التوالي. في المقابل، فإن نقطة انصهار للدهون الجزء الأكبر هو 40.0 درجة مئوية، مما يدل على قمع درجة انصهار SLNs المتعلقة الدهون بكميات كبيرة. كما هو متوقع، والحبس لأبعاد صغيرة وارتفاع سطح نسبة المساحة إلى حجم كساد نقطة جسيمات متناهية الصغر ذوبان ^1. وعلاوة على ذلك، والحرارة الكامنة لانصهار لSLNs السيطرة وSLNs نير محملة هي 5.1 (± 0.2)، و 4.0 (± 0.1) J / ز، على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن مستوى التبلور من SLNs يتأثر الحمولة، حيث أظهر SLNs نير تحميلها على التبلور أقل بالمقارنة مع SLNs السيطرة.

الشكل (3)
الشكل 3. الجسيمات توزيع حجمnanoemulsions نموذجية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينة	حجم الجسيمات (نانومتر)	التشتت المتعدد	ذوبان نقطة (° C)	الحرارة الكامنة للذوبان (J / ز)
SLNs (التحكم)	18.59	5.83	38.0 ± 0.4	5.1 ± 0.2
نير-SLNs	16.87	4.47	36.8 ± 0.2	4.0 ± 0.1

الجدول 1. ملخص من الخصائص الفيزيائية والسلوك الحراري للSLNs السيطرة وSLNs نير محملة بما في ذلك حجم الجسيمات، والتشتت المتعدد، نقطة انصهار والحرارة الكامنة ل ذوبان.

من أجل استكشاف التفاعلات بين الجزيئات ونماذج الخلوية، والقيود جرعة من SLN تطبق بشكل مباشر على الخلايا الأولية في الثقافة، لأول مرة. باستخدام فحص MTT، وقد تم قياس تأثير الجرعة والاستجابة على الأيض الخلوي، حيث أدت زيادة تركيز الجسيمات إلى انخفاض في قابلية الخلوية (مع الاحترام للخلايا السيطرة غير المعالجة). لم يكن هناك اختلاف الملحوظ في سمية بين الخلايا المعرضة لSLN وحده مقابل SLN نير محملة على هذه الجرعات المحددة مسبقا. في موازاة ذلك، كانت خلايا فحص البصر للانضمام إلى ثقافة البوليسترين الأنسجة وأخذت الصور لإظهار كل من التشكل الخلوي التمثيلي وامتصاص الجزيئات الفلورسنت على مر الزمن (الشكل 5). باستخدام جرعة تساوي 5 ميكروغرام / مل الدهون لوحظ (حوالي 80٪ الخلوي الجدوى) امتصاص الجسيمات من قبل 2 ساعة بعد التعرض.

يس ">

الرقم 4. قابلية الخلايا الليفية الجلدية الإنسان الابتدائية بعد 24 ساعة الحضانة مع النانوية. وقد تم قياس الجدوى باستخدام فحص MTT، وتمثل البيانات خلايا قابلة للحياة في المئة فيما يتعلق ضوابط غير المعالجة. تركيزات تمثل وزن / حجم الدهون. وتعكس البيانات لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة، أجريت في ثلاث نسخ. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. الأولية الخلايا الليفية الجلد البشري بعد (A) 2 و (B) 24 ساعة الحضانة مع النانوية نير تحميلها. تركيز الجسيمات النانوية يساوي 5 ميكروغرام / مل الدهون.الصور هي تمثيلية لا تقل عن ثلاثة تجارب مستقلة، أجريت في مكررة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

واستنادا إلى نتائج الدراسات الحد الجرعة، تم التحقيق العلاقة بين جرعة من SLNs ومستوى التأسيس في الفئران BMDC. وتعتبر هذه الخلايا على نطاق واسع أفضل لاعب في نموذج المختبر من عدة مجموعات فرعية DC الموجودة في الجسم الحي، والسماح للتحقيقات الأساسية المستوى البحثي بين كل من المؤثرات الخلوية والجزيئية من التلاعب المقصود. تركت BMDC غير المعالجة أو يتعرض O / N إما 0.5 أو 5.0 ميكروغرام / الدهون مل من SLNs نير تحميل (على غرار الخلايا الليفية الإنسان، أدى استخدام 50 ميكروغرام / الدهون مل في خلايا قابلة للحياة أقل من 10٪) ومستوى جسيمات متناهية الصغر التأسيس يحدد عن طريق قياس كثافة من نير مضان في BMDCs عبر التدفق الخلوي. A كور المباشرlation بين تركيز SLNs المستخدم وكمية من مضان المقررة في BMDCs لوحظ (الشكل 6A). وكشف تحليل الحركية من نير محملة SLNs التأسيس لامتصاص السريع جدا BMDC. كانت إشارة الفلورسنت SLN بالفعل واضحة بعد 1 ساعة من التعرض، في حين plateauing في جميع أنحاء 5H التعرض (الشكل 6B).

الشكل (6)
تعرضت الرقم 6. SLN التأسيس من قبل الخلايا الجذعية يرتبط مع تركيز التعرض. (A) عظام الفئران المستمدة من نخاع الخلايا الجذعية (BMDC) O / N لنير-SLNs، في تركيز الدهون المشار إليها، ومستوى التأسيس تقييم عبر التدفق الخلوي. هي بوابات تراكب الرسم البياني جميع على CD11c و+ السكان. (B) الحركية التأسيس SLN التي كتبها BMDC. تعرض الخلايا لنير-SLNs (5ميكروغرام / مل) للمرة المحدد ومستوى مضان (على CD11c وبوابات + الخلايا) والمقررة من قبل التدفق الخلوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، تم استكشاف توليف SLNs وتطبيقها للتطبيقات التي تستهدف الخلايا. وقد أظهرت هذه الجسيمات النانوية حيويا وعد بوصفها وسائل إيصال لتطبيقات متعددة بما في ذلك تسليم المخدرات، إسكات الجينات والتقنيات لقاح ^25-30. تم توليفها SLNs الصغيرة جدا باستخدام عملية السطحية، واستكشفت تفاعلاتها مع خلايا الجلد الابتدائية والخلايا المناعية الأولية. وقد صممت SLNs لتشمل التغليف من صبغة الفلورسنت (نير)، الذي كان بمثابة البضائع العلاجية نموذجية.

وتم استخدام المنهج PIT لتجميع SLN وخصائص الجسيمات الناتجة (حجم الجسيمات، والتشتت المتعدد، نقطة انصهار، والكامنة حرارة انصهار) تم تقييمها باستخدام ديناميكية تشتت الضوء والمسح التفاضلي قياس الكالوري. حجم الجسيمات وتحليل التشتت المتعدد كشف توليف SLNs الصغيرة جدا مع التشتت المتعدد ضيق، والمثل الأعلى للهدف داخل الخلاياجي التطبيقات. كما ذكرت سابقا، يمكن أن حجم الجسيمات تلعب دورا مهما في التفاعلات الخلوية ^12. وقد تبين حجم الجسيمات النانوية أن يكون لها تأثير كبير، والتأثير على كفاءة امتصاص، واستيعاب اختيار المسار، وتوطين داخل الخلايا، وسمية الخلايا ^12. بعض الاتجاهات العامة فيما يتعلق تفاعلات الخلايا جسيمات متناهية الصغر موثقة في الأدب تشمل: الحجم الحرج يمكن أن تختلف مع نوع من الخلايا وسطح خصائص الجسيمات النانوية، والجسيمات النانوية الصغيرة لديها أعلى احتمال أن يكون داخليا من قبل السلبي يصل تأخذ من الشركات الكبيرة ¹² . وكشف التحليل الحراري للجسيمات في هذه الدراسة مستوى مختلف من التبلور (أي الحرارة الكامنة لانصهار) بين SLNs السيطرة وتلك محملة نير الصبغة. انخفض التبلور من SLNs يرجع ذلك إلى إضافة صبغة الفلورسنت، الذي يعمل بمثابة النجاسة. وقد تبين أن تبلور نظام تقديم العلاج إلى bالبريد أحد العوامل الهامة التي تؤثر على تسليم وجرعة ^31. انخفاض في التبلور من السيارة SLN يمكن أن تؤثر المعلمات مثل قدرة التحميل العلاجية وحركية تحرر الدواء ^31. طريقة PIT هو أسلوب تجميع أكثر لطيف بالمقارنة مع الطرق الأخرى، مع القيود التي يمكن إدراجها الأدوية فقط محبة للدهون في الجزيئات. وعلى الرغم من هذا القيد، SLNs تصنيعه باستخدام هذه الطريقة وحيويا للغاية، مما يجعل منصة تسليم ثم مناسبة للعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية.

وقد تم تحليل آثار التفاعل SLN على الإنسان قابلية الجلد الخلايا الليفية باستخدام فحص MTT. ولوحظ وجود انخفاض تعتمد على الجرعة في البقاء مع زيادة تركيزات SLN. خلال التوليف SLN، واستقرت جزيئات الدهون مع طبقة السطحي. كما يقلل من حجم الجسيمات، ويزيد من مساحة السطح، وكذلك إمكانية التفاعلات سطح الخلية والخلوية التعرض رس طبقة السطحي، والذي قد يؤدي إلى تلف أغشية الخلايا. هذه التجارب سمحت تحديد تركيز الجرعات التي امتصاص الخلايا للجسيمات يمكن ملاحظة مع تجنب حدوث انخفاض كبير في بقاء الخلية بسبب اضطراب الغشاء. تحليل MTT هو أسلوب الكمية التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لفهم الصحة الخلوية. في موازاة ذلك، تم فحص الخلايا باستخدام المجهر مضان لتصور مضان من صبغة الفلورسنت البضائع، نير. باستخدام هذه التقنية، وقد لوحظ امتصاص الجسيمات إلا بعد 2 ساعة من الحضانة مع الخلايا الليفية الإنسان. يوفر مضان المجهر المعلومات النوعية المتعلقة مورفولوجيا والخصائص الخلوية. يجب توخي الحذر لتجنب تلطيخ الخلفية المفرط والتصوير من القطع الأثرية. بالإضافة إلى ذلك، كنماذج الماوس عادة ما تكون الخيار الأول للفي عمق الخلوية والجزيئية التحقيقات، قمنا بتحليل التفاعل بين SLNs وخلايا الفئران. على وجه الخصوص، عظيمالمصلحة تكمن في استخدام الجسيمات النانوية من أجل إطلاق سراح انتقائي وتسيطر المخدرات التي من شأنها أن تعديل سلوك النظام المناعي. ونتيجة لذلك، التدفق الخلوي كان يعمل لقياس امتصاص الجزيئات التي خلايا فأر شجيري. وأكدت هذه البيانات أن الخلايا البلعمية مثل الخلايا الجذعية يمكن أن يتسامح مع مجموعة مماثلة من تركيز SLNs (مع انخفاض قابلية رصدت في 50 ميكروغرام / مل الدهون كما هو الحال مع الخلايا الليفية الجلدية الإنسان) ومستوى التأسيس يرتبط بشكل مباشر مع تركيز التعرض SLN. وعلاوة على ذلك، كشفت DC التأسيس السريع جدا من SLNs، مما يوحي بأن هذه الفئة من السكان قد تمثل هدفا ثمينا عبر SLN بوساطة تسليم المخدرات.

وتشمل هذه الدراسة وصفا للطريقة لتركيب السكان الصغيرة جدا من الجسيمات النانوية حيويا، فضلا عن العديد من في المختبر الطرق التي يمكن من خلالها تقييم التفاعلات الخلوية. في الدراسات المستقبلية، فحوصات إضافيةيمكن استخدامها لزيادة توصيف التفاعلات خلية الجسيمات وفي نهاية المطاف توجيه التنمية الناجحة للnanocarriers العلاجية. ويمكن أن تشمل هذه الدراسات من حركية الافراج عن المخدرات، وتحليل tropism الخلوي، وقياس مستويات خلوى الموالية للالتهابات، وتحليل التغيرات transcriptomic الخلوية مع مرور الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).