Bioengineering

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Nanopartikler-baserede levering køretøjer har vist meget lovende for intracellulære målretning applikationer, der giver en mekanisme til specifikt at ændre cellulær signalering og genekspression. Disse køretøjer kan indlæses med lægemidler, proteiner og nukleinsyrer til formål at påvirke cellulære reaktioner og opnå en ønsket virkning i målvæv. Mange typer af nanocarriers er blevet udforsket til terapeutisk og diagnostisk fordel, herunder lipider, polymerer, silicium og magnetiske materialer. Disse systemer er attraktive på grund af deres potentiale til lokaliseret lægemiddelafgivelse, øget terapeutisk koncentration i målvæv, og reduktion af systemisk toksicitet.

Faste lipide nanopartikler (SLNs) er en velundersøgte eksempel på en nanopartikel leveringssystem, der er opstået som et lovende lægemiddel afgivelsesvehikel i de seneste år. SLNs kan let formuleres til flere applikationer, herunder bio-sensing ^1, kosmetik ^2, og therapeutic levering ^3-7. Deres anvendelighed skyldes det faktum, at de er sammensat udelukkende af resorberbare, ikke-toksiske lipider, hvilket resulterer i øget biokompatibilitet. Under syntesen, kan lipofile lægemidler inkorporeres i SLN køretøjer, og derved øge lægemiddelopløselighed og egnethed til parenteral indgivelse. SLN køretøjer også bidrage til at stabilisere indkapslede lægemidler, reducere deres nedbrydning og clearance, og maksimere terapeutisk virkning. Disse køretøjer er særligt velegnet til langtidsvirkende, præparater med kontrolleret frigivelse på grund af deres stabilitet ved kropstemperatur ^3,4,8,9. Det er vigtigt, indkapsling af lægemidler i lipidnanopartikler ændrer de iboende farmakokinetiske profiler af lægemiddelmolekyler. Dette giver en potentiel fordel ved at tillade kontrolleret frigivelse af lægemidler med et snævert terapeutisk indeks. Frigivelseshastigheden af SLN-inkorporeret terapeutiske kan indstilles på grundlag af lipid nedbrydningshastigheden eller lægemidlet diffusionshastigheden ilipidmatrix.

SLNs er ofte konstrueret til at ophobe sig i bestemte målvæv. For eksempel, deres størrelse (typisk større end 10 nm) potenserer retention i kredsløbet, hvor utætte vaskulatur tumorvæv letter deposition. Desuden har rute for partikel administration vist sig at ændre biodistribution med potentiale til at målrette specifikke fysiologiske strukturer, såsom lymfeknuder ^10,11. Efter aflejring i målvæv, opnå passende cellulære interaktioner og eventuel internalisering af nanopartikler er udfordrende på grund af evnen af cellemembraner til selektivt at styre strømmen af ioner og molekyler ind og ud af cellen ^12. For at lette celleoptagelse, er det muligt at modificere nanocarriers med specifikke ligander, herunder peptider, små molekyler og monoklonale antistoffer ^13,14. Flere mekanismer, herunder både passiv penetration og aktiv transport af nanopartiklerover cellemembranen tidligere er blevet beskrevet ^3,12,15. Generelt er det blevet påvist, at celle-interaktioner nanopartikler er påvirket af de fysisk-kemiske egenskaber af nanopartikler herunder størrelse, form, overflade ladning og overfladekemi, foruden cellespecifikke parametre såsom celletype eller cellecyklusfase ^12.

En tidligere undersøgelse viste, syntesen af sub-10 nm SLNs for topiske ^{16 og} biomarkør afsløring applikationer ¹ hjælp faseomlejringstemperaturen (PIT) metode ^17. Dette er en blid syntese metode, hvor ² sammensætningen forbliver konstant, medens temperaturen gradvist ændres. Kontinuerlig omrøring af den opvarmede opløsning, efterhånden som den afkøles til stuetemperatur resulterer i en nanoemulsion. Denne proces resulterer i syntesen af SLNs med mindre partikelstørrelse ^1, end man tidligere rapporteret anvendelse af forskellige fremgangsmåder til syntese af lipid nanoparticles ^17-22. Den resulterende størrelse skala, mindre end 20 nm, giver en fordel for intracellulære målretning applikationer på grund af forøget overfladeareal og potentialet for forbedrede cellulære interaktioner.

En skematisk afbildning af SLNs, designet til at levere et fluorescerende farvestof eller terapeutisk, er vist i figur 1. De SLNs består af et lipid indre (f.eks lineær alkan) at tillade inkorporering af lipofile forbindelser (f.eks, farvestoffer eller terapeutiske) og et overfladeaktivt udvendige (f.eks lineær ionisk overfladeaktivt middel) omgivet af vand. I denne undersøgelse blev SLNs fyldt med et fluorescerende farvestof og anvendes som model til at undersøge partikel-celle-interaktioner. Primære humane dermale fibroblaster og mus dendritiske celler blev udsat for farvestof-loaded SLN over tid med henblik på at karakterisere interaktioner med hensyn til toksicitet og partikel-optagelse. A 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) assay blev UtiZed for at etablere passende dosering niveauer. Fluorescensmikroskopi og flowcytometri var to metoder, der anvendes til at undersøge partikel optagelse in vitro.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af SLN viser de store bestanddele. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Behandling af SLNs

Syntese af SLNs
Bemærk: Brug PIT metode ^1,17,20 at forberede sub-20 nm SLNs ^1.
1. Brug aseptisk teknik, bioreagenser eller cellekultur reagenser, og sterile materialer (dvs. pipetter, spatler, hætteglas etc.).
2. Brug en biosikkerhed skab til syntese af SLNs (figur 2).
3. Kombiner 0,6 mg fluorescerende farvestof (Nile Red (NIR), NIR koncentrationen er ca. 0,3 mg / ml) og 0,10 g heneicosan (Lipid, 5 vægt / vægt% lipidkoncentration) i et hætteglas (15 ml), co-smelter ved 90 ° C, og omrør.
4. Tilføj 0,11 g polyoxyethylen (10) -oleylether (overfladeaktivt middel, 5,5 vægt / vægt% koncentration af overfladeaktivt middel). Co-smelte den resulterende blanding ved 90 ° C og omrør.
5. Tilføj 1,79 g sterilt vand til blandingen, opvarmes til 90 ° C og omrøres, indtil en gennemsigtig nanoemulsion dannes.
  Bemærk: Under fortsat omrøring og kontrolleret afkøling, SLNs er oprettet. Disse betingelser forårsage en inversion af vand-i-olie-emulsionen til en olie-i-vand-emulsion. Lipofile molekyler såsom NiR partition til lipid dråber.
6. Forbered en nanoemulsion parallelt uden at tilføje det fluorescerende farvestof, med henblik på at tjene som en kontrolprøve. Kombiner 0,10 g heneicosan og 0,11 g polyoxyethylen (10) -oleylether i et hætteglas (15 ml) co-smelten ved 90 ° C, og omrør.
  1. Tilføj 1,79 g sterilt vand til blandingen, opvarmes til 90 ° C og omrøres, indtil en gennemsigtig nanoemulsion dannes.
7. Yderligere sterilisere hver nanoemulsion anvendelse af en steril 0,2 um filter.
Figur 2. Skematisk af syntese af SLNs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Partikelstørrelse og Polydispersity
1. Brug dynamisk lysspredning (DLS) til at måle partikelstørrelsen og polydispersitet af SLNs ¹ ved hjælp af en glaskuvette og et instrument til at måle partikelstørrelse.
2. Før målingerne af prøverne, måle partikelstørrelser på to kendte standarder ved at følge fabrikantens protokol til standarderne forberedelse og måling.
3. Fyld glaskuvette med 1,5 ml standardopløsning og måle standardopløsning anvendelse af de samme målebetingelser som prøverne.
  Bemærk: Forrige skridt blev gentaget for hver standard.
4. Mål prøverne som fremstillet. For hver, bruge følgende eksperimentelle parametre: en køretid på 100 sek, brydningsindeks af vand (1,33), viskositet vand ved 20 ° C (1,002 mPa sek).
  Bemærk: Denne teknik bruger frekvensforskudte lys til at måle størrelsen af nanopartiklerne.
5. Rapporter den gennemsnitlige partikeldiameter og polydispersitet partikel størrelsesfordeling.
Smeltepunkt og latente Melting
1. Brug et differential (DSC) udstyret med en auto-sampler og flydende nitrogen køling kilde til at undersøge den termiske opførsel af SLNs ^1.
2. Pipettere de som fremstillede SLNs i en 40 pi aluminium gryde med en masse på ca. 25 mg og hermetisk forsegle gryden ved hjælp af en universel crimper presse for at minimere fugttab under DSC-scanning.
3. Mål hver nanoemulsion fra 5 til 80 ° C.
4. Rapporter smeltepunkt og den latente smeltevarme fra DSC plot, hvor dalen repræsenterer smeltepunkt og integralet af arealet under kurven i DSC plot divideret med mængden af materiale repræsenterer den latente smeltevarme.

2. SLNs Interaktion med fibroblaster og dendritiske celler

Kultur af primære humane fibroblaster
1. Kultur primære humane fibroblasts ifølge producentens instruktioner i flydende medium til dyrkning af humane dermale fibroblaster (medium 106), suppleret med den lave supplement serum vækst (LSGS) kit. Opretholde celler i en fugtig atmosfære ved 37 ° C, _5% CO2 og subkultur efter at have nået 80% konfluens.
2. For både MTT og billedbehandling analyse, frø celler i et 96-brønds plade ved en tæthed på 2 x 10 ⁴ celler per brønd, og lad det ækvilibrere ved 37 ° CO / N før SLN eksponering.
3. Ved tiden nul, fortyndes SLNs i komplet medium som angivet (figur 4), med hensyn til lipidkoncentration og tilsættes 10 pi per brønd til hver replikere godt i 96-brønds plade.
4. Opretholde celler ved 37 ° C, _5% CO2, i inkubationstiden.
MTT Toksicitet Assay
1. Efter 24 timers inkubation med SLNs, fastlægge cellulær levedygtighed ved hjælp af MTT-assayet, ifølge fabrikantens protokol. </ li>
2. Vask cellerne én gang og tilføje frisk medium til hver brønd (100 pl / brønd). Dræbe kontrolbrønde ved inkubation i en 70% methanol-opløsning i 10 minutter før udskiftning med frisk medium.
3. Tilføj MTT-reagens (10 pi per brønd) til hver brønd i mikropladen og inkuberes O / N ved 37 ° C.
4. Efter O / N inkubation opløse intracellulære formazin krystaller med den medfølgende rengøringsmiddel (100 pi per brønd) i henhold til producentens protokol.
5. Efter 3 timer inkubation ved stuetemperatur, opnå absorbansværdier ved en måling bølgelængde på 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
  Bemærk: MTT-reagens anvendes, bør være mindre end 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromid.
Fluorescensmikroskopi
1. På specifikke tidspunkter efter dosering af fibroblaster med SLN, vaske fibroblasterne to gange med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseres i 10 minutter med kold 70% methanol.
2. Efter 10 minUdskift methanol med PBS og tage billeder ved hjælp af et omvendt mikroskop, ved hjælp af et band pass (BP) 690/50 nm filter sæt.
Culture of Mouse Bone Marrow dendritiske celler
1. Inducerer muse knoglemarvafledte dendritiske celler (BMDC) som tidligere beskrevet ^23,24. Kort fortalt, plade enkelt celle suspensioner af C57BL / 10 knoglemarven i 100 mm petriskåle ved 2 x 10 ⁶ / plade med rekombinant murint granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF, 300 U / ml) og rekombinant murin IL-4 (B-celle-stimulerende faktor, 200 U / ml). Skift medier hver 3. dag.
2. På dag 7, tilsættes NiR-fyldte SLNs til skålene i en slutkoncentration på 0,5 og 5,0 ug / ml lipid og vedligeholde cellerne i et 37 ° C, _5% CO2 inkubator i den ønskede længde af eksponering.
3. Indsamle celler fra skålene ved at suge alle medier i pladen, opsamles i en 50 ml rør, efterfulgt af grundig vask af pladen (for at fjerne løst adHerent celler) med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 4 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Saml den opnåede cellesuspension i samme 50 ml rør.
Vurdering af SLNs Inkorporering via flowcytometri
1. Bestemme koncentrationen af cellesuspensionen opnået i punkt 2.4.3 og distribuere 3x10 ⁵ celler i en 12 mm x 75 mm rundbundet FACS rør.
2. Vask cellerne ved tilsætning af 1 ml PBS og derefter centrifugere rør i 5 minutter ved 400 xg, ved en temperatur på 4 ° C.
3. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes med 100 pi PBS / 2 mM EDTA / 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (farvning buffer) indeholdende anti-CD11-FITC monoklonalt antistof (0,25 ug / ml endelig). Der inkuberes i 30 minutter på is i mørke.
4. Vask cellerne med 1 ml PBS og centrifugeres rørene i 5 minutter ved 400 xg, ved en temperatur på 4 ° C.
5. Kassér supernatanten og resuspender hverpelletere med 400 pi farvning buffer. Cellerne er nu klar til overtagelse af prøverne med et flowcytometer (muligvis udstyret med blå og røde lasere).
6. Brug flowcytometri analyse software, vurdere omfanget af inkorporering af SLNs af DC ved gating på populationen af CD11c + celler (FITC positive) og sammenligne intensiteten af SLNs-associerede fluorescens (målt i PerCP-Cy5.5 eller APC-kanaler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PIT fremgangsmåde blev anvendt til at syntetisere SLNs og faseomlejringstemperaturen blev bestemt under anvendelse af et vandbad. Prøverne blev langsomt opvarmet og omrørt forsigtigt, indtil opløsningen viste sig klart. Faseomlejringstemperaturen for SLNs fremstillet ved anvendelse heneicosan lipid er 45 ° C. Tabel 1 opsummerer partikelstørrelsen, polydispersitet, smeltepunkt og latent smeltevarme for SLNs. De SLNs syntetiseres ved anvendelse af forarbejdningsbetingelserne beskrevet ovenfor resulterede i kontrol SLNs og NiR-fyldte SLNs med en gennemsnitlig partikeldiameter på 18,59 og 16,87 nm og med en polydispersitet på 5,83 og 4,47, (figur 3). Stabiliteten af SLNs dispersion blev overvåget ved måling af partikelstørrelsen over 6 dage ved to forskellige opbevaringstemperaturer (4 og 23 ° C). Partikelstørrelsen ændredes ikke over 6 dage (data ikke vist).

Den termiske opførsel af SLNs var Investigated anvendelse af differentiel scanningskalorimetri. De syntetiserede SLNs har et smeltepunkt på 38,0 (± 0,4) og 36,8 (± 0,2) ° C til kontrol SLNs og NiR-fyldte SLNs hhv. I modsætning hertil smeltepunktet for størstedelen lipid er 40,0 ° C, hvilket indikerer undertrykkelsen af smeltepunktet for SLNs forhold til bulk lipid. Som forventet, indespærring til små dimensioner og højt overfladeareal-til-volumen-forholdet nedtrykke nanopartikel smeltepunkt ^1. Desuden den latente smeltevarme til kontrol SLNs og NiR-fyldte SLNs er 5,1 (± 0,2) og 4,0 (± 0,1) J / g, hhv. Disse resultater viser, at omfanget af krystallinitet af SLNs påvirkes af nyttelasten, hvor NIR-fyldte SLNs viste en lavere krystallinitet i sammenligning med kontrolplanterne SLNs.

Figur 3
Figur 3. Partikelstørrelsesfordeling aftypiske nanoemulsioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Prøve	Partikelstørrelse (nm)	Polydispersitet	Smeltepunkt (° C)	Latent smeltevarme (J / g)
SLNs (kontrol)	18.59	5,83	38,0 ± 0,4	5,1 ± 0,2
NiR-SLNs	16,87	4.47	36,8 ± 0,2	4,0 ± 0,1

Tabel 1. Oversigt over de fysiske egenskaber og termiske opførsel af kontrol SLNs og NiR-fyldte SLNs herunder partikelstørrelse, polydispersitet, smeltepunkt og latente smeltning.

For at udforske samspillet mellem partikler og cellulære modeller, begrænsningerne af SLN dosisjustering som anvendes direkte til primære celler i kultur, blev først etableret. Ved anvendelse af en MTT-assay, blev dosis-respons virkning på cellulær metabolisme måles, hvor et stigende partikelkoncentration resulterede i et fald i cellulær levedygtighed (med hensyn til de ubehandlede kontrolceller). Der var ingen observeret forskel i toksicitet mellem celler udsat for SLN alene versus NiR-loaded SLN på disse forudbestemte doser. Sideløbende blev cellerne visuelt for tilslutning til vævskultur polystyren og billeder blev taget for at demonstrere både repræsentativ cellulære morfologi og optagelsen af fluorescerende partikler over tid (figur 5). Ved hjælp af en dosis på 5 ug / ml lipid (ca. 80% cellulær levedygtighed) partikel optagelse blev observeret ved 2 timer efter eksponering.

ys ">

Figur 4. Levedygtighed af primære humane dermale fibroblaster efter 24 timers inkubation med nanopartikler. Levedygtighed blev målt under anvendelse af et MTT-assay, og data repræsenterer procent levedygtige celler med hensyn til ubehandlede kontroller. Koncentrationer repræsenterer vægt / volumen lipid. Data afspejler mindst tre uafhængige eksperimenter, der udføres in triplo. Fejlsøjler angiver standardfejlen af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. primære humane dermale fibroblaster efter (A) 2 og (B) 24 timers inkubation med NiR-nanopartikler. Nanopartikel koncentration er lig med 5 ug / ml lipid.Billeder er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, udført i to eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Baseret på resultaterne af begrænsning undersøgelser den dosis, blev sammenhængen mellem dosis af SLNs og niveauet for iblanding i murine BMDC undersøgt. Disse celler er almindeligt anset for den bedste in vitro model af flere DC delmængder eksisterende in vivo og give mulighed for grundlæggende undersøgelser af både cellulære og molekylære virkninger af beregnet manipulationer forskning niveau. BMDC blev efterladt ubehandlet eller udsættes O / N til enten 0,5 eller 5,0 ug / ml lipid af NIR-fyldte SLNs (i lighed med human fibroblast, anvendelse af 50 ug / ml lipid resulterede i mindre end 10% levedygtige celler) og niveauet af nanopartikel inkorporering bestemmes ved måling af intensiteten NIR fluorescens i BMDCs via flowcytometri. En direkte correning mellem koncentrationen af SLNs anvendes, og mængden af fluorescens vurderet i BMDCs blev observeret (figur 6A). En analyse af den kinetiske NIR-loaded SLNs inkorporering afslørede en meget hurtig optagelse af BMDC. SLN fluorescerende signal var allerede tydelig efter 1 time af eksponering, mens plateau på omkring 5h af eksponering (figur 6B).

Figur 6
Figur 6. SLN inkorporering af dendritiske celler korrelerer med koncentrationen af eksponering. (A) Murin knoglemarvafledte dendritiske celler (BMDC) blev udsat O / N NIR-SLNs, ved koncentrationen af lipid angivet, og niveauet af inkorporering vurderes via flowcytometri. Histogram overlejringer er alle gated på CD11c + befolkning. (B) Kinetic af SLN inkorporering af BMDC. Celler blev eksponeret for NiR-SLNs (5ug / m) for den angivne tid og niveauet af fluorescens (på gated CD11c + celler) blev vurderet ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse blev syntesen af SLNs og deres anvendelighed til intracellulær målretning applikationer udforsket. Disse biokompatible nanopartikler har vist lovende som levering køretøjer til flere programmer, herunder drug delivery, gendæmpning og vaccineteknologier ^25-30. Ultra-små SLNs blev syntetiseret ved hjælp af en let proces, og deres samspil med primære hudceller og primære immunceller blev udforsket. SLNs var designet til at omfatte indkapsling af et fluorescerende farvestof (NIR), der tjente som model terapeutisk last.

PIT-metoden blev anvendt til at syntetisere SLN og de resulterende partikelegenskaber (partikelstørrelse, polydispersitet, smeltepunkt og latent smeltevarme) blev evalueret under anvendelse af dynamisk lysspredning og differentialscanningskalorimetri. Partikelstørrelse og polydispersiteten analyse afslørede syntesen af ultra-små SLNs med snæver polydispersitet, ideel til intracellulær målrende applikationer. Som tidligere rapporteret, kan partikelstørrelse spille en vigtig rolle på cellulære interaktioner ^12. Størrelsen af nanopartikler har vist sig at have en dramatisk effekt, der påvirker optagelsen effektivitet, internalisering pathway udvælgelse, intracellulær lokalisering og cytotoksicitet ^12. Nogle af de overordnede tendenser med hensyn til celle-nanopartikler interaktioner dokumenteret i litteraturen, kan nævnes: kritisk størrelse kan variere med celle type og overfladeegenskaber nanopartiklerne, og små nanopartikler har højere sandsynlighed for at blive internaliseret ved passiv up-tage end store ¹² . Termisk analyse af partiklerne i denne undersøgelse afslørede et andet niveau af krystallinitet (dvs. latent smeltevarme) mellem kontrol- SLNs og dem fyldt med NiR farvestof. Krystalliniteten af SLNs faldet som følge af tilsætning af fluorescerende farvestof, der fungerer som en urenhed. Krystalliniteten af det terapeutiske afgivelsessystem har vist sig at be en vigtig faktor, der påvirker leveringen og dosis ^31. Et fald i krystallinitet SLN køretøjet kan påvirke parametre såsom terapeutiske lasteevne og narkotika frigivelseskinetik ^31. PIT metode er en mere skånsom syntese teknik i sammenligning med andre metoder, med den begrænsning, at kun lipofile lægemidler kan inkorporeres i partiklerne. På trods af denne begrænsning, SLNs syntetiseret ved hjælp af denne metode er meget biokompatible, hvilket gør så velegnet levering platform for mange applikationer inden for biomedicinsk forskning.

Virkningerne af SLN interaktion på menneskers dermal fibroblast levedygtighed blev analyseret under anvendelse af et MTT-assay. Et dosisafhængigt fald i levedygtighed blev observeret med stigende koncentrationer af SLN. Under SLN syntese, er de lipidpartikler stabiliseret med et overfladeaktivt lag. Som partikelstørrelsen aftager, overfladeareal forøges, ligesom potentialet for celleoverflade-interaktioner og cellulære eksponering to lag af overfladeaktivt middel, der kan ødelægge cellemembraner. Disse forsøg tillod bestemmelse af dosering koncentration, ved hvilken den cellulære optagelse af partikler kunne observeres samtidig undgå et signifikant fald i cellelevedygtighed grund membransprængning. MTT-analyse er en kvantitativ teknik, der kan anvendes bredt til at forstå cellulære sundhed. Sideløbende blev celler undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at visualisere fluorescens af lasten fluorescerende farvestof, NIR. Med denne teknik blev partikel optagelse observeret efter kun 2 timer af inkubation med humane fibroblaster. Fluorescens mikroskopi giver kvalitative oplysninger relateret til cellulære morfologi og egenskaber. Skal være omhyggelig med at undgå overdreven baggrund farvning og billeddannelse af artefakter. Hertil kommer, som musemodeller er generelt det første valg for dybdegående cellulær og molekylær undersøgelser, analyserede vi samspillet mellem SLNs og murine celler. Især en storinteresse ligger i brugen af nanopartikler til selektiv og kontrolleret frigivelse af lægemidler, der ville ændre opførslen af immunsystemet. Derfor, flowcytometri var ansat til at måle optagelsen af partikler ved muse-dendritiske celler. Disse data bekræftede, at fagocytceller som dendritiske celler kan tolerere en række lignende SLNs fusion (med reduceret levedygtighed observeret ved 50 ug / ml lipid, som med humane dermale fibroblaster) og niveauet af inkorporering direkte korrelerer med koncentrationen af SLN eksponering. Desuden DC afslørede en meget hurtig indarbejdelse af SLNs, hvilket tyder på, at denne population kan udgøre et værdifuldt mål via SLN-medieret lægemiddeladministration.

Denne undersøgelse indeholder en beskrivelse af en fremgangsmåde til syntese af ultrasmå populationer af biokompatible nanopartikler, samt flere in vitro-metoder ved at vurdere deres cellulære interaktioner. I fremtidige studier, yderligere analyserkan anvendes til yderligere at karakterisere de partikel-celle-interaktioner og i sidste ende lede den succesfulde udvikling af terapeutiske nanocarriers. Disse kunne omfatte undersøgelser for lægemiddelfrigivelse kinetik, analyse af cellulær tropisme, måling af pro-inflammatoriske cytokinniveauer og analyse af cellulære transkriptomisk ændringer over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).