Bioengineering

Solid Lipid Nanopartikler (SLNs) for Intracellulær målretting Applications

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Nanopartikkel-baserte levering kjøretøy har vist store løftet for intracellulære rettet mot applikasjoner, og gir en mekanisme for å spesifikt endre cellesignalering og genuttrykk. Disse kjøretøyene kan lastes med legemidler, proteiner og nukleinsyrer som er utformet for å påvirke cellulære responser og oppnå en ønsket effekt i målvev. Mange typer nanocarriers er uttømt for terapeutisk og diagnostisk nytte blant lipider, polymerer, silisium og magnetiske materialer. Disse systemene er attraktive på grunn av deres potensial for lokalisert levering av legemidler, økt terapeutisk konsentrasjon i målvev, og reduksjon av systemisk toksisitet.

Solid lipid nanopartikler (SLNs) er et godt studert eksempel på en nanopartikkel levering system som har dukket opp som en lovende stoffet levering kjøretøy de siste årene. SLNs lett kan formuleres for flere bruksområder, inkludert bio-sensing ^en, kosmetikk ^2, og therapeutic levering ^3-7. Deres nytte stammer fra det faktum at de består utelukkende av ikke-toksiske resorberbare, lipider, noe som resulterer i forbedret biokompatibilitet. I løpet av syntesen kan lipofile legemidler bli innlemmet i SLN kjøretøyer, for derved å øke medikamentløseligheten og egnethet for parenteral administrering. SLN biler også bidra til å stabilisere innkapslede therapeutics, redusere deres fornedrelse og rydding, og maksimere terapeutisk virkning. Disse kjøretøyene er spesielt godt egnet for langtidsvirkende, kontrollerte frigjørende preparater på grunn av deres stabilitet ved kroppstemperatur ^3,4,8,9. Viktigere, innkapsling av narkotika i lipid nanopartikler endrer iboende farmakokinetiske profiler av stoffet molekyler. Dette gir en potensiell fordel ved å tillate kontrollert frigjøring av legemidler med en smal terapeutisk indeks. Frigjøringshastigheten av SLN-innlemmet therapeutics kan være innstilt basert på lipid nedbrytningshastigheten eller stoffet diffusjonshastigheten ilipidmatriks.

SLNs er ofte konstruert for å hope seg opp i konkrete målet vev. For eksempel, deres størrelse (typisk større enn 10 nm) potenserer retensjon i sirkulasjonen, hvor det lekk vaskulaturen av tumorvev letter avsetning. I tillegg har rute for administrering partikkel vist seg å endre biofordelingen med potensial for å målrette bestemte fysiologiske strukturer som lymfeknuter ^10,11. Ved deponering i målvev, oppnå hensiktsmessige cellulære interaksjoner og eventuell internalisering av nanopartikler er utfordrende på grunn av evnen til cellemembraner for selektivt å kontrollere strømmen av ioner og molekyler inn i og ut av cellen ^12. For å lette cellulært opptak, er det mulig å modifisere nanocarriers med spesifikke ligander, inkludert peptider, små molekyler, og monoklonale antistoffer ^13,14. Flere mekanismer, inkludert både passiv penetrasjon og aktiv transport av nanopartiklerover cellemembranen er tidligere blitt beskrevet ^3,12,15. Generelt har det blitt demonstrert at celle-interaksjoner nanopartikkel blir påvirket av de fysiokjemiske egenskaper av nanopartikler, inkludert størrelse, form, overflateladning og overflatekjemi, i tillegg til cellespesifikke parametre som celletype eller cellesyklus fase ^12.

En tidligere undersøkelse demonstrerte syntesen av sub-10 nm SLNs for topiske ¹⁶ og biomarkør deteksjon søknader ¹ ved hjelp av faseinversjonstemperaturen (PIT) metode ^17. Dette er en mild syntese metode hvor ^to sammensetningen forblir konstant, mens temperaturen gradvis endret. Kontinuerlig omrøring av den oppvarmede oppløsning, når den kjøles til romtemperatur fører til en nanoemulsion. Denne prosessen resulterer i syntese av SLNs med ^en mindre partikkelstørrelse enn det som tidligere er rapportert ved bruk av forskjellige fremgangsmåter for syntese av lipid nanoparticles ^17-22. Den resulterende størrelse skala, mindre enn 20 nm, gir en fordel for intracellulære målretting anvendelser på grunn av øket overflateareal, og potensialet for forbedrede cellulære interaksjoner.

En skjematisk av SLNs, designet for å levere et fluorescerende fargestoff eller terapeutisk, er vist i figur 1. De SLNs består av et lipid indre (f.eks lineær alkan), slik at inkorporering av lipofile forbindelser (for eksempel fargestoffer eller terapeutiske midler), og et overflateaktivt middel utvendig (for eksempel, lineær ikke-ionisk overflateaktivt middel) omgitt av vann. I denne studien ble SLNs lastet med et fluorescerende fargestoff, og brukt som en modell for å undersøke partikkel-celle-interaksjoner. Primære humane dermale fibroblaster og muse dendrittiske celler ble eksponert for fargestoff-lastet SLN over tid for å karakterisere interaksjoner med hensyn til toksisitet og partikkelopptak. A 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium-bromid (MTT) assay ble utilized for å etablere hensiktsmessige doseringsnivåer. Fluorescens mikroskopi og flowcytometri ble to metoder benyttet for å undersøke partikkelopptak in vitro.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av SLN viser de viktigste bestanddelene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Behandling av SLNs

Syntese av SLNs
Merk: Bruk PIT metoden ^1,17,20 å forberede sub-20 nm SLNs ^1.
1. Bruk aseptisk teknikk, BioReagents eller cellekultur karakteren reagenser, og sterile materialer (dvs. pipetter, spatler, hetteglass, etc.).
2. Bruk en biosikkerhet kabinett for syntese av SLNs (figur 2).
3. Kombiner 0,6 mg av fluorescerende fargestoff (Nile Red (NIR), er NIR-konsentrasjon ca. 0,3 mg / ml) og 0,10 g av heneikosan (Lipid, 5 vekt / vekt% lipid-konsentrasjon) i en ampulle (15 ml), ko-smelte ved 90 ° C, og rør.
4. Legg 0,11 g polyoksyetylen (10) oleyleter (overflateaktivt middel, 5,5 vekt / vekt% overflateaktivt middel-konsentrasjon). Ko-smelte den resulterende blanding ved 90 ° C og rør.
5. Legg 1,79 g sterilt vann til blandingen, varme til 90 ° C, og rør til et gjennomsiktig nanoemulsion dannes.
  Merk: Under fortsatt omrøring og kontrollert kjøling, SLNs er opprettet. Disse forhold forårsaker en inversjon av vann-i-olje-emulsjon til en olje-i-vann-emulsjon. Lipofile molekyler som NIR partisjon til lipid dråper.
6. Tilbered en nanoemulsion i parallell uten å legge det fluorescerende fargestoff, for å tjene som en kontrollprøve. Kombiner 0,10 g heneikosan og 0,11 g polyoksyetylen (10) oleyleter inn i en ampulle (15 ml) ko-smelte ved 90 ° C, og rør.
  1. Legg 1,79 g sterilt vann til blandingen, varme til 90 ° C, og rør til et gjennomsiktig nanoemulsion dannes.
7. Ytterligere sterilisere hver nanoemulsion med en steril 0,2 mikrometer filter.
Figur 2. Skjematisk av syntese av SLNs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Partikkelstørrelse og Polydispersity
1. Bruk av dynamisk lysspredning (DLS) for å måle partikkelstørrelsen og polydispersiteten av de SLNs ¹ ved hjelp av en glass kyvette og et instrument som måler partikkelstørrelse.
2. Før målinger av prøvene, måling av partikkelstørrelsen på to kjente standarder å følge produsentens protokoll for standarder preparatet og måling.
3. Fyll glass kyvetten med 1,5 ml av standardløsningen og måle standardoppløsningen ved bruk av de samme målebetingelser som prøvene.
  Merk: Forrige trinn ble gjentatt for hver standard.
4. Måle prøvene som ble fremstilt. For hver bruker de følgende eksperimentelle parametere: en driftstid på 100 sek, brytningsindeksen til vann (1,33), viskositet av vann ved 20 ° C (1,002 mPa sek).
  Merk: Denne teknikken bruker frekvensforskjøvet lys til å måle størrelsen på nanopartikler.
5. Rapportere gjennomsnittlig partikkeldiameter og polydispergerbarhet på particle størrelsesfordeling.
Smeltepunkt og latent varme fra smelte
1. Bruk en kalorimeter (DSC) er utstyrt med en auto-sampler og flytende nitrogen kjøling kilde for å undersøke den termiske oppførselen til SLNs ^1.
2. Pipette de som forberedt SLNs i en 40 mL aluminiumspanne med en masse på ca 25 mg og hermetisk forsegle pan ved hjelp av en universell crimper trykk for å minimere tap av fuktighet under DSC skanningen.
3. Måle hver nanoemulsion fra fem til 80 ° C.
4. Rapport smeltepunktet og den latente varme for smelting fra DSC plottet, hvor dalen representerer smeltepunktet og integralet av arealet under kurven i DSC plottet dividert med den mengde materiale som representerer det latente varme for smelting.

2. SLNs Interaksjon med fibroblaster og dendrittiske celler

Culture of Primary humane fibroblaster
1. Kultur primære menneskelige fibroblasts i henhold til produsentens instruksjoner i flytende medium for kulturen i menneske dermale fibroblaster (medium 106), supplert med lav serum vekst supplement (LSGS) kit. Opprettholde celler i en fuktig atmosfære ved 37 ° C, _5% CO2 og subkultur ved å nå 80% konfluens.
2. For både MTT og bildeanalyse, frø celler i en 96-brønns plate ved en densitet på 2 x 10 ⁴ celler per brønn, og la den ekvilibrere ved 37 ° CO / N før SLN eksponering.
3. Ved tid null, fortynn SLNs i komplett medium som vist (figur 4), med hensyn til lipid-konsentrasjon, og tilsett 10 ul per brønn for å gjenskape hver brønn i 96-brønns plate.
4. Opprettholde cellene ved 37 ° C, _5% CO2, i løpet av inkubasjonsperioden.
MTT Toxicity Analyse
1. Etter 24 timers inkubasjon med SLNs, bestemme cellulær levedyktighet ved anvendelse av MTT-analysen, i henhold til produsentens protokoll. </ li>
2. Vask cellene en gang og legge til friskt medium til hver brønn (100 ul / brønn). Drepe kontrollbrønner ved inkubering i en 70% metanol-løsning i 10 min før bytte ut med ferskt medium.
3. Legg MTT-reagens (10 ul pr brønn) til hver brønn på mikroplate og inkuberes O / N ved 37 ° C.
4. Etter O / N inkubasjon, oppløse intracellulære formazin krystaller med den medfølgende såpevann (100 mL per brønn) i henhold til produsentens protokoll.
5. Etter 3 timers inkubering ved romtemperatur, få absorbansverdier ved en målebølgelengde på 570 nm ved bruk av en mikroplateleser.
  Note: MTT-reagens som brukes, bør være mindre enn 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyl-tetrazoliumbromid.
Fluorescensmikroskopi
1. På bestemte tidspunkter etter dosering av fibroblaster med SLN, vaske fibroblaster to ganger med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) og feste i 10 minutter med kald 70% metanol.
2. Etter 10 min, Erstatte metanol med PBS og ta bilder ved hjelp av en invertert mikroskop, ved hjelp av et band pass (BP) 690/50 nm filter sett.
Culture of Mouse Bone Marrow dendrittiske celler
1. Induserer mus benmargavledede dendrittiske celler (BMDC) som tidligere beskrevet ^23,24. I korthet plate enkeltcellesuspensjoner av C57BL / 10 benmargen i 100 mm petriskåler ved 2 x 10 ⁶ / plate med rekombinant murin granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF, 300 U / ml) og rekombinant murint IL-4 (B-celle-stimulerende faktor, 200 U / ml). Endre media hver 3 dager.
2. På dag 7, tilsett NIR-lastede SLNs til retter til en sluttkonsentrasjon på 0,5 og 5,0 ug / ml lipid og opprettholde cellene i et 37 ° C, _5% CO2 inkubator for den ønskede lengden på eksponeringen.
3. Samle celler fra rettene ved å aspirere alle medier i platen, samle det i en 50 ml tube, etterfulgt av grundig vask av platen (for å løsne løst annonseHerent celler) med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 4 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Samle den oppnådde cellesuspensjonen i det samme 50 ml tube.
Vurdering av SLNs innlemmelse via flowcytometrisystemer
1. Bestemme konsentrasjonen av cellesuspensjonen oppnådd i punkt 2.4.3 og fordele 3x10 ⁵ celler i en 12 mm x 75 mm rundbunnet FACS rør.
2. Vask cellene ved tilsetning av 1 ml PBS og deretter sentrifugering av rørene i 5 min ved 400 x g ved en temperatur på 4 ° C.
3. Kast supernatanten og resuspender pelleten med 100 ul PBS / 2 mM EDTA / 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (farging buffer) inneholdende anti-CD11c-FITC monoklonalt antistoff (0,25 ug / ml endelig). Inkuber i 30 minutter på is i mørket.
4. Vask cellene med 1 ml PBS og deretter sentrifugere rørene i 5 min ved 400 x g ved en temperatur på 4 ° C.
5. Kast supernatanten og resuspender hverpellet med 400 mL av flekker buffer. Cellene er nå klar for overtakelse av prøvene med et flowcytometer (muligens utstyrt med blå og røde lasere).
6. Ved hjelp av flowcytometri analyse programvare, vurdere graden av inkorporering av SLNs av DC ved gating på bestanden av CD11c + celler (FITC positive) og sammenligne intensiteten av SLNs-forbundet fluorescens (målt i PerCP-Cy5.5 eller APC kanaler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PIT-metoden ble brukt for å syntetisere SLNs og faseinversjonstemperaturen ble bestemt ved anvendelse av en vann-bad. Prøvene ble oppvarmet langsomt og forsiktig omrørt inntil oppløsningen viste seg klar. Faseinversjonstemperaturen for SLNs gjort ved hjelp heneikosan lipid er 45 ° C. Tabell 1 oppsummerer partikkelstørrelse, polydispersitet, smeltepunkt og latent varme for smelting for SLNs. De SLNs syntetisert ved hjelp av de prosessbetingelser som er beskrevet ovenfor førte til kontroll SLNs og NIR-lastet SLNs med en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 18,59 og 16,87 nm og med en polydispersitet på 5,83 og 4,47, respektivt (figur 3). Stabiliteten av SLNs dispersjonen ble overvåket ved måling av partikkelstørrelse i løpet av 6 dager ved to forskjellige lagringstemperaturer (4 og 23 ° C). Partikkelstørrelsen forandret seg ikke i løpet av 6 dager (data ikke vist).

Den termiske oppførselen til SLNs ble investigrerte ved hjelp av differensial scanning kalorimetri. De syntetiserte SLNs har et smeltepunkt på 38,0 (± 0,4) og 36,8 (± 0,2) ° C for kontroll SLNs og NIR-lastet SLNs, respektivt. I motsetning til dette, er smeltepunktet for størstedelen lipid 40,0 ° C, hvilket indikerer undertrykkelse av smeltepunktet for SLNs i forhold til den samlede mengde lipid. Som forventet, senge små dimensjoner og høye overflateareal-til-volum-forhold trykke nanopartikkelsmeltepunkt ^1. Dessuten er den latente varme av smelter for kontroll SLNs og NIR-lastet SLNs 5,1 (± 0,2), og 4,0 (± 0,1) J / g, respektivt. Disse resultatene tyder på at nivået av krystallinitet av SLNs påvirkes av nyttelasten, hvor NIR-lastede SLNs viste en lavere krystallinitet sammenlignet med kontroll SLNs.

Figur 3
Figur 3. Partikkelstørrelsesfordelingentypiske nanoemulsions. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Prøve	Particle Size (nm)	Polydispergerbarhet	Smeltepunkt (° C)	Latent Heat over Melting (J / g)
SLNs (Control)	18.59	5,83	38,0 ± 0,4	5.1 ± 0.2
NIR-SLNs	16.87	4,47	36,8 ± 0,2	4.0 ± 0.1

Tabell 1. Oppsummering av de fysiske egenskaper og termisk oppførsel av kontroll SLNs og NIR-lastet SLNs inkludert partikkelstørrelse, polydispergerbarhet, smeltepunkt og latent smelting.

For å undersøke interaksjonen mellom partiklene og cellemodeller, doserings begrensninger av SLN som direkte brukes til primærceller i kultur, ble først etablert. Ved hjelp av et MTT-assay, ble dose-respons-effekt på cellulær metabolisme måles, hvor økende partikkelkonsentrasjon som resulterte i en reduksjon av cellulær levedyktighet (med hensyn til de ubehandlede kontrollceller). Det var ingen observert forskjell i toksisitet mellom celler eksponert for SLN alene versus NIR-lastet SLN på disse forhåndsbestemte doser. Parallelt ble cellene undersøkt visuelt for tilslutning til vevskulturpolystyren og bilder ble tatt for å vise både representative cellulær morfologi og opptaket av fluorescerende partikler over tid (figur 5). Ved hjelp av en dose lik 5 ug / ml lipid (ca. 80% cellulær levedyktighet) partikkelopptaket ble observert etter 2 timer etter eksponering.

ys ">

Figur 4. Levedyktigheten av primære humane dermale fibroblaster etter 24 timers inkubering med nanopartikler. Levedyktigheten ble målt ved hjelp av et MTT-assay, og data som representerer prosent levedyktige celler i forhold til ubehandlede kontroller. Konsentrasjoner representerer vekt / volum lipid. Data reflekterer minst tre uavhengige eksperimenter, utført i tre eksemplarer. Feilfelt indikere standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Primære humane dermale fibroblaster etter (A) og 2 (B) 24-timers inkubering med NIR-lastede nanopartikler. Nanopartikkel-konsentrasjon er lik 5 mg / ml lipid.Bildene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter, utført i to eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Basert på resultatene av dosebegrensnings studier ble sammenhengen mellom dose SLNs og nivå av inkorporering i murine BMDC undersøkt. Disse cellene er ansett som den beste in vitro modell av flere DC undergrupper eksisterende in vivo og gi rom for grunnleggende forskning nivå undersøkelser av både cellulære og molekylære effekter av beregnet manipulasjoner. BMDC forble ubehandlet eller utsettes O / N til enten 0,5 eller 5,0 ug / ml lipid av NIR-lastede SLNs (tilsvarende til human-fibroblast, bruk av 50 ug / ml lipid resulterte i mindre enn 10% levedyktige celler) og nivået av nanopartikkel inkorporering bestemt ved å måle intensiteten av fluorescens i NIR BMDCs via flowcytometri. En direkte correning mellom konsentrasjonen av SLNs brukes og mengden av fluorescens vurdert i BMDCs ble observert (figur 6A). En analyse av den kinetiske NIR belastede SLNs innlemmelse viste en meget hurtig opptak av BMDC. SLN fluorescerende signal var allerede tydelig etter en time av eksponering, mens plateauing på rundt 5 timer eksponering (figur 6B).

Figur 6
Figur 6. SLN inkorporering av dendrittiske celler korrelerer med konsentrasjon av eksponeringen. (A) murin benmarg-avledede dendrittceller (BMDC) ble eksponert O / N til NIR-SLNs, ved at konsentrasjonen av lipid angitt, og nivået av inkorporering vurderes via flowcytometri. Histogram overlegg er alle inngjerdet på CD11c + befolkningen. (B) Kinetic av SLN innlemmelse av BMDC. Celler ble eksponert for NIR-SLNs (5pg / ml) for den angitte tid og nivået av fluorescens (på inngjerdet CD11c + celler) ble vurdert ved flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien ble syntesen av SLNs og deres egnethet for intracellulære rettet mot programmer utforsket. Disse biokompatible nanopartikler har vist lovende som levering kjøretøy for flere bruksområder, inkludert levering av legemidler, gene silencing, og vaksineteknologi ^25-30. Ultra-små SLNs ble syntetisert ved hjelp av en lettvinte prosess, og deres samhandling med primær hudceller og primære immunceller ble utforsket. SLNs ble utformet for å inkludere innkapsling av et fluorescerende fargestoff (NIR), som fungerte som en modell terapeutisk last.

PIT-metoden ble anvendt for å syntetisere SLN, og de resulterende partikkelegenskaper (partikkel-størrelse, polydispersitet, smeltepunkt, og latent varme for smelting) ble evaluert ved hjelp av dynamisk lysspredning og differensial scanning kalorimetri. Partikkelstørrelse og polydispergerbarhet analyse viste syntese av ultra-små SLNs med smal polydispergerbarhet, ideelt for intracellulær targeting applikasjoner. Som tidligere rapportert, kan partikkelstørrelse spille en viktig rolle på cellulære interaksjoner ^12. Størrelsen av nanopartikler har vist seg å ha en dramatisk virkning, påvirker opptaket effektivitet, internalise valg vei, intracellulær lokalisering og cytotoksisitet ^12. Noen av de generelle trendene med hensyn til celle-nanopartikkel interaksjoner dokumentert i litteraturen er: kritisk størrelse kan variere med celletype og overflateegenskaper nanopartikler og små nanopartikler har høyere sannsynlighet for å bli internalisert av passiv up-ta enn store ¹² . Termisk analyse av partiklene i denne studien viste en annen grad av krystallinitet (dvs. latent varme for smelting) mellom kontroll SLNs og de som er lastet med NIR fargestoff. Krystalliniteten av SLNs redusert på grunn av tilsetningen av det fluorescerende fargestoff, som fungerer som en urenhet. Krystalliniteten av det terapeutiske avgivelsessystem har vist seg å be en viktig faktor som påvirker leveransen og dose ^31. En reduksjon i krystalliniteten av SLN kjøretøyet kan påvirke parametere som terapeutisk lastekapasitet og medikamentfrigjøringskinetikken ^31. PIT metoden er en mer skånsom synteseteknikk i sammenligning med andre metoder, med den begrensning at bare lipofile medikamenter kan bli inkorporert inn i partiklene. Til tross for denne begrensning, SLNs syntetisert ved hjelp av denne fremgangsmåten er svært biokompatible, noe som gjør deretter passende levering plattform for mange anvendelser i biomedisinsk forskning.

Effekten av SLN interaksjon på human hud-fibroblast-levedyktighet ble analysert ved hjelp av et MTT-assay. En doseavhengig reduksjon i levedyktighet ble observert med økende konsentrasjoner av SLN. Under SLN syntesen lipidpartiklene stabilisert med et overflateaktivt middel lag. Ettersom partikkelstørrelsen avtar, overflatearealet øker, og det gjør også potensialet for celleoverflate cellulære interaksjoner og eksponering to det overflateaktive lag, som kan skade cellemembraner. Disse eksperimentene tillot bestemmelse av doserings konsentrasjon ved hvilken cellulært opptak av partikler kunne observeres samtidig unngå en betydelig reduksjon i cellelevedyktighet på grunn av membran avbrudd. MTT-analyse er en kvantitativ teknikk som kan bredt anvendt for å forstå mobil helse. Parallelt ble celler undersøkt ved hjelp av fluorescens mikroskopi for å visual fluorescensen av lasten fluorescerende fargestoff, NIR. Ved hjelp av denne teknikk, ble partikkelopptak observert etter bare 2 timers inkubasjon med humane fibroblaster. Fluorescensmikropskopi gir kvalitativ informasjon knyttet til mobilnettet morfologi og kjennetegn. Hensyn må tas for å unngå overdreven bakgrunnsfarging og avbildning av gjenstander. I tillegg, som musemodeller er vanligvis førstevalget for inngående cellulære og molekylære undersøkelser, analyserte vi samspillet mellom SLNs og museceller. Spesielt en storinteresse ligger i bruken av nanopartikler for selektiv og kontrollert frigjøring av medikamenter som ville endre virkemåten for immunsystemet. Følgelig flow cytometri ble anvendt for å måle opptaket av partikler av mus dendrittiske celler. Disse data bekreftet at fagocyttiske celler som dendritiske celler kan tolerere en lignende rekke SLNs konsentrasjon (med redusert levedyktighet ble observert ved 50 pg / ml lipid som med humane dermale fibroblaster) og nivået av inkorporering korrelerer direkte med konsentrasjonen av SLN eksponering. Videre DC viste en meget rask innarbeiding av SLNs, noe som tyder på at denne pasientgruppen kan representere et verdifullt mål via SLN formidlet medisintilførsel.

Denne studien omfatter en beskrivelse av en fremgangsmåte for syntese av ultra-små populasjoner av biokompatible nanopartikler, så vel som flere in vitro-metoder som for å vurdere deres cellulære interaksjoner. I fremtidige studier, ytterligere analyserkan anvendes for ytterligere å karakterisere partikkel-celleinteraksjoner, og til slutt lede en vellykket utvikling av terapeutiske nanocarriers. Disse kan omfatte studier av medikamentfrigjøringskinetikk, analyse av mobilnettet tropisme, måling av pro-inflammatoriske cytokin nivåer, og analyse av mobilnettet transcriptomic endringer over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).