Bioengineering

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Vehículos de administración basados en nanopartículas han mostrado una gran promesa para aplicaciones dirigidas intracelulares, proporcionando un mecanismo para alterar específicamente la señalización celular y la expresión génica. Estos vehículos pueden ser cargados con fármacos, proteínas y ácidos nucleicos diseñados para afectar las respuestas celulares y lograr un efecto deseado en los tejidos diana. Muchos tipos de nanovehículos se han explorado para el beneficio terapéutico y de diagnóstico incluyendo lípidos, polímeros, silicio y materiales magnéticos. Estos sistemas son atractivos debido a su potencial para la entrega localizada de fármacos, aumento de la concentración terapéutica en tejidos diana, y la reducción de la toxicidad sistémica.

Nanopartículas lipídicas sólidas (GLC) son un ejemplo bien estudiado de un sistema de liberación de nanopartículas que ha surgido como un vehículo de suministro de fármaco prometedor en los últimos años. SLNs se pueden formular fácilmente para múltiples aplicaciones, incluyendo la detección de ^bio-1, cosméticos ^2, y tentrega herapeutic ^3-7. Su utilidad se deriva del hecho de que se componen enteramente de, lípidos no tóxicos reabsorbibles, resulta en una mayor biocompatibilidad. Durante la síntesis, fármacos lipófilos se pueden incorporar en vehículos SLN, lo que aumenta la solubilidad del fármaco y la idoneidad para la administración parenteral. Vehículos SLN también ayudan a estabilizar la terapéutica encapsulados, reduciendo su degradación y la limpieza, y la maximización de la acción terapéutica. Estos vehículos son particularmente bien adaptado para acción prolongada, preparaciones de liberación controlada debido a su estabilidad en ^3,4,8,9 la temperatura corporal. Es importante destacar que la encapsulación de fármacos en nanopartículas lipídicas altera los perfiles farmacocinéticos intrínsecas de las moléculas de fármaco. Esto proporciona una ventaja potencial al permitir la liberación controlada de fármacos con un índice terapéutico estrecho. La velocidad de liberación de la terapéutica incorporado SLN-puede ser sintonizado basa en la tasa de degradación de lípidos o de la tasa de difusión del fármaco en elmatriz lipídica.

SLNs son a menudo diseñados para acumularse en tejidos diana específicos. Por ejemplo, su tamaño (típicamente mayor que 10 nm) potencia la retención en la circulación, donde la vasculatura tumoral con fugas de tejido facilita la deposición. Además, la vía de administración de partículas se ha demostrado que altera la biodistribución con el potencial para apuntar estructuras fisiológicas específicas, tales como los ganglios linfáticos ^10,11. Tras la deposición en los tejidos diana, el logro de las interacciones celulares apropiadas y eventual internalización de nanopartículas es un reto debido a la capacidad de las membranas celulares para controlar selectivamente el flujo de iones y moléculas dentro y fuera de la celda ^12. Para facilitar la absorción celular, es posible modificar nanovehículos con ligandos específicos que incluyen péptidos, moléculas pequeñas, y anticuerpos monoclonales ^13,14. Varios mecanismos que incluyen tanto la penetración pasiva y transporte activo de nanopartículasa través de la membrana celular se han descrito previamente ^3,12,15. En general, se ha demostrado que las interacciones célula-nanopartículas están influenciados por las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas incluyendo el tamaño, forma, carga superficial y la química de superficie, además de los parámetros específicos de células tales como el tipo celular o fase del ciclo celular ^12.

Una investigación anterior demostró la síntesis de sub-10 GLC nm de tópicos ^{16 y} biomarcadores aplicaciones de detección de ¹ utilizando el método de la temperatura de inversión de fases (PIT) ^17. Este es un método de síntesis suave donde la composición ² se mantiene constante mientras que la temperatura se cambia gradualmente. Agitación continua de la solución calentada, mientras se enfría a los resultados de RT en una nanoemulsión. Este proceso resulta en la síntesis de GLC con tamaño de partícula menor ¹ que se informó anteriormente utilizando diversos métodos para la síntesis de lípidos nanoparticles ^17-22. La escala de tamaño resultante, a menos de 20 nm, proporciona una ventaja para aplicaciones de focalización intracelulares debido a una mayor área de superficie y el potencial para las interacciones celulares mejoradas.

A esquemática de GLC, diseñado para ofrecer un colorante fluorescente o terapéutico, se muestra en la Figura 1. Los SLNs constan de un lípido interior (por ejemplo, alcano lineal) permitiendo la incorporación de compuestos lipófilos (por ejemplo, tintes o agentes terapéuticos) y un exterior tensioactivo (tensioactivo no iónico, por ejemplo, lineal) rodeada de agua. En este estudio, SLNs se cargaron con un colorante fluorescente y se usan como un modelo para investigar las interacciones célula-partícula. Fibroblastos dérmicos humanos primarios y células dendríticas de ratones fueron expuestos a teñir-cargadas SLN lo largo del tiempo con el fin de caracterizar las interacciones con respecto a la toxicidad y la captación de partículas. A 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) ensayo fue utilized el fin de establecer los niveles de dosificación apropiados. La microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fueron dos métodos empleados para examinar la captación de partículas in vitro.

Figura 1. Esquema de GLC que muestra los componentes principales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Tramitación de GLC

Síntesis de GLC
Nota: Utilice el método PIT ^1,17,20 para preparar los sub-20 GLC nm ^1.
1. Utilice una técnica aséptica, Bioreagents o reactivos de grado de cultivo de células, y los materiales estériles (es decir, pipetas, espátulas, viales, etc.).
2. Utilice un gabinete de bioseguridad para la síntesis de GLC (Figura 2).
3. Combinar 0,6 mg de tinte fluorescente (Rojo Nilo (NIR), la concentración NiR es de aproximadamente 0,3 mg / ml) y 0,10 g de Heneicosane (lípido, 5% p / p concentración de lípidos) en un vial (15 ml), co-funde a 90 ° C, y revuelva.
4. Añadir 0,11 g de polioxietileno (10) oleil éter (tensioactivo, 5,5% p / p concentración de tensioactivo). Co-fundir la mezcla resultante a 90 ° C y remover.
5. Añadir 1,79 g de agua estéril a la mezcla, el calor a 90 ° C, y revuelva hasta que se forme una nanoemulsión transparente.
  Nota: Bajo continua agitación y enfriamiento controlado, SLSe crean Ns. Estas condiciones causan una inversión de la emulsión de agua en aceite a una emulsión aceite-en-agua. Moléculas lipofílicas como partición NiR a las gotas de lípidos.
6. Preparar una nanoemulsión en paralelo sin añadir el colorante fluorescente, con el fin de servir como una muestra de control. Combine 0,10 g de Heneicosane y 0,11 g de polioxietileno (10) oleiléter en un vial (15 ml) co-fusión a 90 ° C, y revuelva.
  1. Añadir 1,79 g de agua estéril a la mezcla, el calor a 90 ° C, y revuelva hasta que se forme una nanoemulsión transparente.
7. Además esterilizar cada nanoemulsión usando un filtro estéril de 0,2 micras.
Figura 2. Esquema de la síntesis de GLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tamaño de partícula y Polydispersity
1. Utilice dispersión dinámica de luz (DLS) para medir el tamaño de las partículas y la polidispersidad de los GLC ¹ utilizando una cubeta de vidrio y un instrumento diseñado para medir el tamaño de las partículas.
2. Antes de las mediciones de las muestras, medir los tamaños de partícula de dos estándares conocidos siguiendo el protocolo del fabricante para la preparación estándares y medición.
3. Llenar la cubeta de vidrio con 1,5 ml de solución estándar y medir la solución estándar con las mismas condiciones de medición como las muestras.
  Nota: Paso anterior se repitió para cada norma.
4. Medir las muestras como se ha preparado. Para cada uno, utilice los siguientes parámetros experimentales: una duración de 100 segundos, el índice de refracción del agua (1.33), la viscosidad del agua a 20 ° C (1.002 mPa · s).
  Nota: Esta técnica utiliza desplazada en frecuencia de luz para medir el tamaño de las nanopartículas.
5. Reporte el diámetro medio de partícula y la polidispersidad de partidistribución de tamaño de culo.
Punto de fusión y calor latente de fusión
1. Utilice un calorímetro diferencial de barrido (DSC) equipado con un muestreador automático y la fuente de enfriamiento nitrógeno líquido para investigar el comportamiento térmico de SLNs ^1.
2. Pipetear los SLNs como preparadas en un molde de aluminio 40 l con una masa de aproximadamente 25 mg y sellar herméticamente el recipiente usando una prensa rizador universal a minimizar la pérdida de humedad durante el análisis DSC.
3. Mida cada nanoemulsión de 5 a 80 ° C.
4. Informar el punto de fusión y el calor latente de fusión del gráfico de DSC, donde el valle representa el punto de fusión y la integral de la área bajo la curva en el gráfico de DSC dividido por la cantidad de material representa el calor latente de fusión.

2. GLC Interacción con fibroblastos y las células dendríticas

Cultura de Primaria fibroblastos humanos
1. Cultura fi humana primariafibroblastos de acuerdo a las instrucciones del fabricante en medio líquido para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos (medio 106), complementado con el kit suplemento de bajo crecimiento en suero (LSGS). Mantener las células en una atmósfera húmeda a 37 ° C, 5% de CO ₂ y la subcultura al llegar a 80% de confluencia.
2. Por tanto MTT y análisis de imágenes, las células de semillas en una placa de 96 pocillos, a una densidad de 2 x 10 ⁴ células por pocillo, y permitir que se equilibre a 37 ° CO / N antes de la exposición SLN.
3. En el tiempo cero, diluir GC en medio completo como se indica (Figura 4), con respecto a la concentración de lípidos, y añadir 10 l por pocillo a cada replicar bien en la placa de 96 pocillos.
4. Mantener las células a 37 ° C, 5% de CO _2, durante el período de incubación.
MTT Ensayo de toxicidad
1. Después de 24 h de incubación con GLC, determinar la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, según el protocolo del fabricante. </ li>
2. Lavar las células una vez y añadir medio fresco a cada pocillo (100 l / pocillo). Matar a los pocillos de control por incubación en una solución de metanol 70% durante 10 min antes de reemplazar con medio fresco.
3. Añadir reactivo MTT (10 l por pocillo) a cada pocillo de la microplaca y se incuba O / N a 37 ° C.
4. Después de O / N incubación, disolver los cristales de formazina intracelulares con la solución de detergente proporcionado (100 l por pocillo) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. Después de 3 h de incubación a RT, obtener valores de absorbancia a una longitud de onda de medición de 570 nm utilizando un lector de microplacas.
  Reactivo MTT utilizado debe ser de menos de 1% (w / v) de 3- (4,5-dimetiltiazol-2) -2, bromuro de 5-difenil-tetrazolio: Nota.
Microscopía de Fluorescencia
1. En los puntos de tiempo específicos después de la dosificación de los fibroblastos con SLN, lavar los fibroblastos dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y fijar durante 10 minutos con 70% de metanol frío.
2. Después de 10 min, Sustituir el metanol con PBS y capturar imágenes utilizando un microscopio invertido, usando un paso de banda (BP) 690/50 nm conjunto de filtros.
Cultivo de células de médula ósea de ratón dendríticas
1. Inducir a las células derivadas de la médula ósea de ratón dendríticas (BMDC) anteriormente descritos ^23,24. Brevemente, las suspensiones de placa de una sola célula de ratones C57BL / 10 de la médula ósea en 100 mm placas de Petri en 2 x 10 ⁶ / placa con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos murino recombinante (GM-CSF, 300 U / ml) y murina recombinante IL-4 (células B factor estimulante, 200 U / ml). Cambie los medios de comunicación cada 3 días.
2. El día 7, añadir SLNs cargados-NIR a los platos a una concentración final de 0,5 y 5,0 mg / ml de lípidos y mantener las células en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora para la longitud deseada de la exposición.
3. Recoger las células de los platos aspirando todos los medios de comunicación en la placa, recogiéndola en un tubo de 50 ml, seguido de un lavado a fondo de la placa (para desalojar ad vagamenteHerent células) con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS) conteniendo 4 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Recoger la suspensión celular obtenida en el mismo tubo 50 ml.
Evaluación del GLC Incorporación mediante citometría de flujo
1. Determinar la concentración de la suspensión celular obtenida en el punto 2.4.3 y distribuir 3x10 ⁵ células en un 12 mm x 75 mm de fondo redondo de tubo de FACS.
2. Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y luego centrifugar los tubos durante 5 min a 400 xg, a una temperatura de 4 ° C.
3. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l de PBS / EDTA 2 mM / 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) (tampón de tinción) que contienen anticuerpo monoclonal anti-CD11c-FITC (0,25 g / ml final). Incubar durante 30 min en hielo en la oscuridad.
4. Lavar las células con 1 ml de PBS y centrifugar los tubos durante 5 min a 400 xg, a una temperatura de 4 ° C.
5. Descartar el sobrenadante y resuspender cadasedimentar con 400 l de tampón de tinción. Las células están ahora listos para la adquisición de las muestras con un citómetro de flujo (posiblemente equipado con láseres azul y rojo).
6. El uso de citometría de flujo de software de análisis, evaluar el nivel de incorporación de GLC por DC por gating en la población de células CD11c + (FITC positivo) y la comparación de la intensidad de GLC-asociados fluorescencia (medido en los canales PerCP-Cy5.5 o APC).

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Representative Results

El método PIT fue utilizado para sintetizar los GLC y la temperatura de inversión de fase se determinó utilizando un baño de agua. Las muestras se calienta lentamente y suavemente agitado hasta que la solución parecía clara. La temperatura de inversión de fase para los GLC hechas usando lípidos heneicosane es de 45 ° C. La Tabla 1 resume el tamaño de partícula, polidispersidad, punto de fusión y el calor latente de fusión de los GLC. Los SLNs sintetizados usando las condiciones de procesamiento descritas anteriormente dieron como resultado SLNs de control y SLNs cargados-NIR con un diámetro medio de partícula de 18,59 y 16,87 nm y con una polidispersidad de 5,83 y 4,47, respectivamente (Figura 3). La estabilidad de la dispersión SLNs se monitorizó mediante la medición del tamaño de partícula de más de 6 días a dos temperaturas diferentes de almacenamiento (4 y 23 ° C). El tamaño de partícula no cambió más de 6 días (datos no mostrados).

El comportamiento térmico de los GLC fue Investigated mediante calorimetría diferencial de barrido. Los SLNs sintetizados tienen un punto de fusión de 38,0 (± 0,4) y 36,8 (± 0,2) ° C para el control y GLC GLC cargados-NIR, respectivamente. En contraste, el punto de fusión para el lípido a granel es 40,0 ° C, lo que indica la supresión de la punta de la SLNs relativo al lípido a granel de fusión. Como era de esperar, el confinamiento en pequeñas dimensiones y alta relación superficie-superficie-volumen oprima el punto ¹ de fusión de nanopartículas. Por otra parte, el calor latente de fusión para los SLNs de control y SLNs cargados-NIR es 5,1 (± 0,2), y 4,0 (± 0,1) J / g, respectivamente. Estos resultados indican que el nivel de cristalinidad de los SLNs se ve afectada por la carga útil, donde los SLNs cargados-NIR mostraron una cristalinidad inferior en comparación con los SLNs de control.

Figura 3. Partículas distribución del tamaño denanoemulsiones típicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra	Tamaño de partícula (nm)	Polidispersidad	Punto de fusión (° C)	Calor latente de fusión (J / g)
GLC (Control)	18.59	5.83	38,0 ± 0,4	5.1 ± 0.2
NIR GLC	16.87	4.47	36,8 ± 0,2	4.0 ± 0.1

Tabla 1. Resumen de las propiedades físicas y el comportamiento térmico de los GLC control y GLC cargados-NIR incluyendo el tamaño de las partículas, polidispersidad, punto de fusión y el calor latente de fusión.

Con el fin de explorar las interacciones de las partículas y los modelos de celulares, las limitaciones de dosis de la SLN aplican como directamente a las células primarias en la cultura, se establecieron por primera vez. El uso de un ensayo de MTT, se midió el efecto dosis-respuesta en el metabolismo celular, donde el aumento de la concentración de partículas dio como resultado una disminución de la viabilidad celular (con respecto a las células control no tratadas). No hubo diferencias en la toxicidad observada entre células expuestas a SLN sola versus SLN cargado-NIR a estas dosis predeterminadas. En paralelo, las células se examinaron visualmente para la adherencia a la cultura del tejido y poliestireno imágenes fueron tomadas para demostrar tanto la morfología celular representativa y la captación de partículas fluorescentes con el tiempo (Figura 5). El uso de una dosis igual a 5 g / ml de lípidos (aproximadamente 80% de viabilidad celular) captación de partículas se observó por la exposición posterior 2 hr.

ys ">

Figura 4. Viabilidad de fibroblastos dérmicos humanos primarios después de una incubación de 24 horas con nanopartículas. La viabilidad se midió utilizando un ensayo de MTT, y los datos de IMDb células viables por ciento con respecto a los controles no tratados. Las concentraciones representan peso / volumen de lípidos. Los datos reflejan al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras de error indican el error estándar de la media. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. primarios fibroblastos dérmicos humanos después de (A) y 2 (B) incubación de 24 h con nanopartículas cargadas-NIR. Concentración de nanopartículas es igual a 5 mg / ml de lípidos.Las imágenes son representativas de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Basándose en los resultados de los estudios de limitación de dosis, se investigó la correlación entre la dosis de GLC y el nivel de incorporación en murino BMDC. Estas células son ampliamente considerados los mejores en el modelo in vitro de varios subconjuntos DC existentes in vivo y permiten investigaciones básicas a nivel de investigación de ambos efectos celulares y moleculares de las manipulaciones destinadas. BMDC se dejaron sin tratar o se expone O / N a cualquiera de 0,5 o 5,0 mg / lípido ml de los SLNs cargados-NIR (de manera similar a fibroblastos humanos, el uso de 50 g / lípido ml resultó en menos de 10% de células viables) y el nivel de incorporación de nanopartículas determina midiendo la intensidad de fluorescencia en NiR BMDCs a través de citometría de flujo. Un corre directomento entre la concentración de GLC utilizados y la cantidad de fluorescencia evaluados en BMDCs se observó (Figura 6A). Un análisis de la cinética de cargado-NIR SLNs incorporación reveló una absorción muy rápida por BMDC. La señal fluorescente del GLC era ya evidente después de 1 hora de exposición, mientras que plateauing en alrededor de 5 h de la exposición (Figura 6B).

Figura 6. SLN incorporación por las células dendríticas se correlaciona con la concentración de la exposición. (A) de hueso murino células dendríticas derivadas de la médula (BMDC) se expusieron O / N a NiR-SLNs, a la concentración de lípidos se indica, y el nivel de incorporación evaluó mediante citometría de flujo. Superposiciones histograma están cerrada en la CD11c + población. (B) Cinética de la incorporación del GLC por BMDC. Las células se expusieron a NiR-GLC (5g / ml) durante el tiempo indicado y el nivel de fluorescencia (en las células CD11c + cerrada) se evaluó mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, la síntesis de GLC y su aplicabilidad para aplicaciones dirigidas intracelulares fueron exploradas. Estas nanopartículas biocompatibles se han mostrado prometedores como vehículos de administración para múltiples aplicaciones, incluyendo la administración de fármacos, el silenciamiento de genes y tecnologías de vacunas ^25-30. Ultra-pequeños GLC se sintetizaron utilizando un proceso fácil, y sus interacciones con las células cutáneas primarias y células inmunes primarias fueron exploradas. GLC fueron diseñados para incluir la encapsulación de un colorante fluorescente (NIR), que sirvió de carga terapéutica modelo.

El método PIT para sintetizar SLN y las propiedades de las partículas resultantes (tamaño de partícula, polidispersidad, punto de fusión y calor latente de fusión) fueron evaluados utilizando dispersión de luz dinámica y la calorimetría diferencial de barrido. Tamaño de las partículas y análisis de polidispersidad revelaron la síntesis de ultra pequeños GLC con polidispersidad estrecha, ideal para diana intracelularing aplicaciones. Como se informó anteriormente, el tamaño de partícula puede desempeñar un papel importante en las interacciones celulares ^12. El tamaño de las nanopartículas se ha demostrado que tiene un efecto dramático, que influyen en la eficiencia de absorción, la selección vía internalización, la localización intracelular, y la citotoxicidad ^12. Algunas de las tendencias generales con respecto a las interacciones célula-nanopartículas documentados en la literatura son: tamaño crítico puede variar con el tipo de células y de la superficie propiedades de las nanopartículas, y pequeñas nanopartículas tienen una mayor probabilidad de ser internalizados por pasiva hasta se lo lleva que los grandes ¹² . El análisis térmico de las partículas en este estudio reveló un nivel diferente de cristalinidad (es decir, el calor latente de fusión) entre los GLC de control y aquellos cargados con colorante NiR. La cristalinidad de los SLNs disminuyó debido a la adición del colorante fluorescente, que actúa como una impureza. La cristalinidad del sistema de suministro terapéutico se ha demostrado que be un factor importante que afecta a la entrega y ³¹ dosis. Una disminución de la cristalinidad del vehículo SLN puede influir en parámetros tales como la capacidad de carga terapéutica y la cinética de liberación del fármaco ^31. El método PIT es una técnica de síntesis más suave en comparación con otros métodos, con la limitación de que sólo fármacos lipófilos se pueden incorporar en las partículas. A pesar de esta limitación, SLNs sintetizados utilizando este método son altamente biocompatible, por lo que la plataforma de entrega a continuación, adecuado para muchas aplicaciones en la investigación biomédica.

Los efectos de la interacción SLN en la viabilidad de fibroblastos dérmicos humanos se analizaron usando un ensayo MTT. Una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad se observó con concentraciones crecientes de SLN. Durante la síntesis del GLC, las partículas lipídicas se estabilizan con una capa de surfactante. A medida que el tamaño de partícula disminuye, aumenta el área superficial, al igual que el potencial de interacciones de la superficie celular y la exposición celular to la capa de surfactante, que pueden dañar las membranas celulares. Estos experimentos permitieron la determinación de la concentración de dosificación en la que la captación celular de las partículas se pudo observar evitando al mismo tiempo una disminución significativa en la viabilidad celular debido a la disrupción de la membrana. Análisis MTT es una técnica cuantitativa que se puede aplicar ampliamente a la comprensión de la salud celular. En paralelo, las células fueron examinadas mediante microscopía de fluorescencia con el fin de visualizar la fluorescencia del colorante fluorescente de carga, NIR. Usando esta técnica, la captación de partículas se observó después de sólo 2 horas de incubación con fibroblastos humanos. Microscopía de fluorescencia proporciona información cualitativa relacionada con la morfología y las características celular. Se debe tener cuidado para evitar la tinción de fondo excesiva y las imágenes de los artefactos. Además, como los modelos de ratón son generalmente la primera opción en profundidad celular y las investigaciones moleculares, se analizó la interacción entre GC y células murinas. En particular, un graninterés radica en el uso de nanopartículas para la liberación selectiva y controlada de fármacos que modifiquen el comportamiento del sistema inmunológico. En consecuencia, la citometría de flujo fue empleado para medir la absorción de partículas por las células dendríticas de ratón. Estos datos confirmaron que las células fagocíticas tales como las células dendríticas pueden tolerar una gama similar de concentración SLNs (con la viabilidad reducida observada a 50 mg / ml de lípidos como con fibroblastos dérmicos humanos) y el nivel de incorporación se correlaciona directamente con la concentración de la exposición SLN. Por otra parte, DC reveló una muy rápida incorporación de GLC, lo que sugiere que esta población podría representar un objetivo valioso a través de la administración de fármacos mediada por GLC.

Este estudio incluye la descripción de un método para la síntesis de ultra-pequeñas poblaciones de nanopartículas biocompatibles, así como varios métodos in vitro mediante la cual evaluar sus interacciones celulares. En futuros estudios, ensayos adicionalesse pueden emplear para caracterizar adicionalmente las interacciones célula-partícula y guiar en última instancia, el desarrollo exitoso de nanovehículos terapéuticos. Estos podrían incluir los estudios de la cinética de liberación del fármaco, análisis de tropismo celular, la medición de los niveles de citoquinas pro-inflamatorias, y el análisis de los cambios celulares transcriptomic lo largo del tiempo.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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