Protocol
1. تنقية الموسومة GST GTPase
- الثقافة وE. كولاي سلالة مثل BL21 تحولت مع pGEX-RAC1 O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 220 دورة في الدقيقة، في 500 مل من وسائل الإعلام autoinduction (25 ملي نا 2 هبو 4 و 25 ملي KH 2 PO 4، 50 ملي NH 4 الكلورين، 5 مم نا 2 SO 4، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 0.5٪ الجلسرين، 0.05٪ الجلوكوز، اللاكتوز 0.2٪، 5 ز تريبتون، 2.5 غرام خلاصة الخميرة، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين).
- البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج، 4 ° C.
- بيليه resuspend الجرثومي في 20 مل كاشف استخراج البروتين، 1X مثبط البروتياز واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT مع انقلاب.
- توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 2 مل الجلوتاثيون حبات مغناطيسية، وغسلها مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4، 137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل).
- احتضان لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية.
- تغسل حبات محملة البروتين أربع مرات مع 10 مل PBS، وذلك باستخدام الجسيمات فارز المغناطيسي لترسيب حبات في كل خطوة.
- و resuspend حبات في 2 مل PBS وتخزين البروتين تحميلها في -80 درجة مئوية في 100 مكل لحين الحاجة إليها.
2. التعبير عن البروتينات ملزم GTPase
- قبل يوم من التجربة، transfect البلازميدات ترميز البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) -tagged نسخ من كل بروتين ملزمة GTPase إلى منفصلة 75 سم 2 قارورة من HEK293T على النحو التالي. للتأكد من صحة النوكليوتيدات تحميل، transfect GFP الموسومة TrioD1 إلى الثالثة 75 سم 2 قارورة من HEK293T.
- تمييع polyethylamine إلى 1 مغ / مل في 100 ميكرولتر العقيمة 150 ملي كلوريد الصوديوم.
- إضافة 27 ميكرولتر المخفف polyethylamine إلى 223 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل.
- إضافة DNA البلازميد 12 ميكروغرام إلى 250 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل.
- احتضان كل أنبوب لمدة 2 دقيقة في RT. الجمع بين polyethylamine وDNA تختلط في أنبوب واحد ودوامة لمدة 2 دقيقة.
- احتضان لمدة 15-20 دقيقة في RT.
- استبدال وسائط النمو (التعديل النسر وسائل الإعلام Dulbecco و، 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، لا المضادات الحيوية) على 90٪ متكدسة HEK293T مع 5 مل وسائط النمو الطازجة.
- إضافة مزيج polyethylamine / DNA مجتمعة إلى القارورة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
3. تنقية البروتينات ملزم GTPase
- شطف قوارير من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في برنامج تلفزيوني واستنزاف قارورة لمدة 5 دقائق، الشفط سائل حر.
- كشط الخلايا في 500 ميكرولتر العازلة تحلل (50 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH7.8)، 1٪ Nonidet P-40، 1X مثبط البروتياز) في microfuge أنبوب.
- الخلايا ليز عن طريق خلط التي كتبها قلب في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- خلال تحلل، وغسل قطعتين من 40 ميكرولتر الخرز GFP-فخ ثلاث مرات مع العازلة تحلل العذبة، والخرز المترسبة في 2700 x ج لمدة 2 دقيقة بين يغسل.
- توضيح لست] بواسطة الطرد المركزي في 21000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نقل أوضح المحللة من كل من البروتينات منافس لفصل غسلها الخرز GFP فخ والسماح البروتينات GFP الانصهار لربط لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية. إبقاء المحللة من خلايا GFP-TrioD1 على الجليد.
- غسل تحميل حبات GFP-فخ مرتين في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.8)، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7٪ (ث / ت) Nonidet P-40، ومرتين في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2 ، المترسبة الخرز في 2700 x ج لمدة 2 دقيقة بين يغسل.
- أزل البروتينات GFP الانصهار بإضافة 40 ميكرولتر 0.2 M جليكاين (الرقم الهيدروجيني 2.5) وpipetting صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية. على الفور الخرز الرواسب في 21000 x ج لمدة 60 ثانية ونقل السائل إلى أنبوب microfuge جديدة تحتوي على 4 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 10.4). القيام بذلك بسرعة للحد من الأضرار التي لحقت البروتين النقي.
- تحليل 1 ميكرولتر من كل من البروتين النقي لطخة الغربية والتحقيق مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP لإنشاء العائد النسبي باستخدام بلوت الكمينظام جي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. بدلا من ذلك، تحديد تركيزات البروتين bicinchoninic حمض (BCA) فحص ولكن هذا يدخل الأخطاء إذا البروتينات لا تتفاعل مع مقايسة بطريقة متطابقة أو هناك البروتينات الملوثة.
- التعادل تركيز البروتين المولي من خلال إضافة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2.
4. النكليوتيد تحميل GTPase
- ذوبان الجليد قسامة واحدة من GST-RAC1 حبات مغناطيسية، الذي أعد في الخطوة 1.
- خذ 90 ميكرولتر من الخرز GST-RAC1 ويغسل ثلاث مرات مع 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي DTT، 4 ملي EDTA، وذلك باستخدام الجسيمات فارز المغناطيسي لترسيب حبات في كل خطوة.
- العازلة نضح من الخرز وإضافة 100 ميكرولتر 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي DTT، 4 ملي EDTA.
- وفقا لما إذا الناتج المحلي الإجمالي، GTP أو لا النوكليوتيدات تحميل مطلوب للتجربة المنافسة، إضافة 12 ميكرولتر 100 ملي الناتج المحلي الإجمالي، و 12 ميكرولتر 10 ملي غوanosine 5 '- [γ-ثيو] ثلاثي الفوسفات (GTPγS) أو أي النوكليوتيدات إلى 60 ميكرولتر الخرز GST-RAC1.
- لعناصر النوكليوتيدات التحميل، وتقسيم حبات المتبقية إلى ثلاث قسامات 10 ميكرولتر وإضافة 2 ميكرولتر 100 ملي الناتج المحلي الإجمالي، 2 ميكرولتر 10 ملي GTPγS أو لا النوكليوتيدات إلى كل أنبوب.
- احتضان يمزج حبة لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع الإثارة.
- استقرار RAC1 محددة النوكليوتيدات طريق إضافة 1 M MgCl 2: 3 ميكرولتر إلى المزيج التجريبي (الخطوة 4.4)، و 0.5 ميكرولتر إلى كل من يمزج السيطرة (الخطوة 4.5).
5. مسابقة ملزمة.
- اقامة 6 أنابيب microfuge، كل منها يحتوي على:
200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2
10 ميكرولتر التجريبية الخرز RAC1 محملة النوكليوتيدات (من الخطوة 4.7)
5 ميكرولتر البروتين RAC1 ملزم A (بروتين ملزمة ثابت) - لكل أنبوب، إضافة 0، 1، 2.5، 5، 10 أو 20 ميكرولتر ملزم RAC1 البروتين B (بروتين ملزمة متغير). تفترض هذه الكميات لpproximately قد تحتاج إلى تعديل تركيزات الأسهم متساوية من البروتينات ملزمة ثابتة ومتغيرة و.
- ضبط كميات من البروتينات ملزمة A و B إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في الانتماءات الملزمة من اثنين من البروتينات، وهذا ينبغي أن تحدد تجريبيا من خلال تكرار التجارب. يشكلون إجمالي حجم الخليط ملزم إلى 235 ميكرولتر بإضافة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2.
- إنشاء أنبوب microfuge تحتوي على:
200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2
10 ميكرولتر التجريبية الخرز RAC1 محملة النوكليوتيدات (من الخطوة 4.7)
10 ميكرولتر من البروتين RAC1 ملزم A (بروتين ملزمة ثابت) - إعداد الناتج المحلي الإجمالي، GTPγS ولا أنابيب السيطرة النوكليوتيدات:
200 ميكرولتر 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2
10 المراقبة ميكرولتر الخرز RAC1 تحميل في الخطوة 4.5 مع الناتج المحلي الإجمالي، GTPγS أو لا النوكليوتيدات واستقرت في الخطوة 4.7.
180 ميكرولتر HEK293T GFP-TrioD1 المحللة، أعد كما في الخطوة 3.6
4 ميكرولتر 1 M MgCl 2 - احتضان الخليط لمدة 2 ساعة، والاختلاط التي كتبها قلب في 4 درجات مئوية.
- تغسل حبات ثلاث مرات مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 20 ملي MgCl 2.
- أزل ملزمة البروتينات في 20 ميكرولتر الحد من عينة العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7)، 5٪ SDS، 20٪ الجلسرين، 0.02 ملغ / مل برموفينول الأزرق، 5٪ β المركابتويثانول).
6. تحليل المنافسة
- حل 10 ميكرولتر من بروتين ملزمة (الخطوة 5.6) بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) وصمة عار الغربية.
- احتضان الغشاء في 4 درجات CO / N في مكافحة GFP الضد المخفف 1/1000 في عرقلة العازلة المخفف ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ توين 20 للكشف عن كل من البروتينات ملزم GTPase المعلمة.
- يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS، 0.1٪ توين-20.
- احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في RT في DyLight 800 مترافق المضادة للأرنب ثانيةالأجسام المضادة ondary، المخفف 1/10000 في عرقلة العازلة المخفف ل1x أخرى في برنامج تلفزيوني، 0.1٪ توين-20.
- يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBS، 0.1٪ توين-20.
- مسح الغشاء باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء، وذلك باستخدام برنامج لقياس شدة الموجات وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- مؤامرة كثافة عصابة من كل من البروتين ضد حجم المنافس متغير (البروتين B).
- تقسيم حجم منافس متغير عند النقطة التي تتقاطع خطوط من حجم منافس ثابت (البروتين A، 5 ميكرولتر) لتحديد نسبة منافس الذي يتحقق التوازن.
- للتأكد من صحة الوضع النووى والتحميل، والأغشية التحقيق لتنشيط P21 كيناز 1 (PAK1) (وهو المستجيب) وGFP-TrioD1 (أ GEF)، كما هو موضح في الخطوات 6،1-6،6.
Representative Results
تم تصميم هذا البروتوكول لحساب الانتماءات النسبية للشركاء ملزمة لRAC1، دون الحاجة لمعرفة تركيز دقيق من المنافسين (الشكل 1). تحديد تركيز البروتين يدخل الأخطاء وعند النظر المنافسة بين الجزيئات في مسار الإشارات ليست هناك حاجة. ومع ذلك، فمن المهم أن نعرف أن المنافسين لهما نفس التركيز المولي في الحلول الأسهم للسماح نسب بسيطة يتم حسابها عند إضافة وحدات التخزين المختلفة للفحص. 40 ميكرولتر من الخرز GFP-فخ لديها قدرة ملزمة من ~ 300 بمول لذلك متموجة 75 سم 2 قوارير للتعبير عن درجة عالية من الخلايا سوف تشبع الخرز، وكانت النتيجة أن الاستعدادات لاثنين من البروتينات ملزمة مختلفة ستكون مشابهة قبل التعديل (الشكل 2A). إذا كان أحد البروتينات عن سيئة، ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تنقية أن البروتين من قارورة أكثر من واحد من الخلايا.
ق ق = "jove_content"> الربط من معظم المؤثرات GTPase والمنظمين يعتمد على النوكليوتيدات التحميل من GTPase الطعم، لذلك من المهم لاختبار ما إذا كان يتم تحميل بنجاح. يمكن التحقق من التحميل من قبل عجل البروتينات ملزمة يعرف من الخلية لست]. البروتينات المستجيب، مثل PAK1 ربط لGTP-RAC1 ويمكن عجلت بسهولة من لست] واكتشفت قبل الغرب النشاف 8 (الشكل 2B). GEFs ربط تفضيلي لالنوكليوتيدات خالية من GTPase لتحقيق الاستقرار في الحالة الانتقالية. كما GEFs هي وفرة منخفضة، عادة غير نشط وكثيرا صمة عار على نحو رديء، فمن الأفضل أن بإفراط لمرفق البيئة العالمية أو جزء مرفق البيئة العالمية لاختبار خالية من النوكليوتيدات GTPase. ونحن كثيرا ما تستخدم لأول تناظر DBL من الثلاثي، معبرا عنه كنسبة الانصهار GFP (GFP-TrioD1 9) (الشكل 2B) ولكن سيعمل أي مرفق البيئة العالمية. البروتينات التي تربط لGTPase محملة الناتج المحلي الإجمالي هي أكثر ندرة. نحن ذكرت مؤخرا RCC2 واحدة هذا البروتين 7، أو الناتج المحلي الإجمالي التحميل يمكن التحقق من صحة كمجرد بيندينانوغرام للا GEF ولا المستجيب.
وخرج من هذه التجربة أن يكون لطخة غربية يصور اثنين من الشركاء الموسومة GFP ملزم منضمة إلى GTPase. باستخدام الأجسام المضادة واحد للكشف عن كل من البروتينات، وتركيزات التي كميات مماثلة من كل من المنافسين ربط يمكن تحديد وبالتالي الاستدلال على الانتماءات النسبية. في هذا المثال المنافسة بين المجال المروحة من البروتين الاتجار RAC1، ويتجلى coronin-1C (RAC1 ملزم البروتين A)، والبروتين RAC1-عزل، RCC2 (RAC1 ملزم البروتين B)، (الشكل 3A). باستخدام حجم ثابت من المروحة coronin-1C (5 ميكرولتر)، وإضافة كميات متزايدة من RCC2، يمكننا أن نرى من GFP صمة عار أن يتم التوصل إلى التوازن في 1،25 حتي 2،5 ميكرولتر من RCC2 (النجمة)، مما يدل على أن RCC2 لديها أقوى تقارب لRAC1 من coronin-1C. عن طريق قياس كثافة العصابات باستخدام النشاف الغربي الكمي، والتآمر متوسط القيم لكل منافسهص، يمكن حساب نقطة التوازن بدقة من خلال تحديد الكميات التي تتقاطع المنحنيات (الشكل 3B).
واحدة من العقبات الممكنة لمقايسة المنافسة الناجح هو إذا كان الشركاء ملزم ربط بعضها البعض وكذلك ملزمة لRAC1. في الشكل 3A + B نظهر المنافسة بين RCC2 والمجال المروحة من coronin-1C، بدلا من كامل طول coronin-1C. والسبب في استخدام coronin اقتطاع هو أن coronin-1C أيضا يربط RCC2 من خلال المجال الذيل. عند معاير كامل طول coronin-1C ضد RCC2، ملزمة لكل من البروتينات يتم الكشف، وذلك بسبب تشكيل الثلاثي المعقد، بدلا من المنافسة (الشكل 3C). إذا منافسة يحدث، ملزمة للبروتين واحد سيزيد في حين ينخفض أخرى، وسوف مجموعه ملزمة GFP الانصهار تظل ثابتة. في الحالات التي يشكل مجمع الثلاثي فمن الضروري لاقتطاع واحد من البروتين ملزم GTPase بحيث competitors لم يعد التفاعل.
الشكل 1. سير العمل. تمثيل تخطيطي لسير العمل لتحديد تقارب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التحقق من تنقية البروتينات. (A) تنقية RAC1 البروتينات التي حللها لطخة غربية ملزمة، التحقيق مع مكافحة GFP لتحديد العائد النسبي من اثنين من البروتينات الموسومة GFP. هذا النوع من معادلة أثناء التجربة يسمح للتركيز البروتينات اثنين إلى تعديل بحيث أنها تطابق في التجربة ملزمة. (B) GDوقد حضنت P، GTPγS وعدم تحميل النوكليوتيدات GST-RAC1 مع المحللة من HEK293T معربا عن GFP-TrioD1 والبروتينات الكشف عنها بواسطة بالتآمر لPAK1 الذاتية أو overexpressed GFP-TrioD1 ملزمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحليل لطخة غربية من البروتين النسبي ملزمة. مخرجات مثال من المقايسات ملزمة المنافسة. تحميلها الناتج المحلي الإجمالي (A) كانت مختلطة RAC1 مع 5 ميكرولتر GFP-coronin-1C المروحة نطاق وزيادة حجم GFP-RCC2 ومعاير فيها بواسطة النشاف الغربي البروتينات ملزمة لGFP، وتجنب القضايا مع الكشف عن الفرق من اثنين من البروتينات وإشارة GFP تقارير النسبة المولية بين اثنين من البروتينات الانصهار. العلامات النجمية تشير إلى نسب المنافسة على eitheتم قياس الجانب ص من نقطة التوازن. (B) شدة الفرقة من المربوطة البروتينات GFP الانصهار من ثلاث تجارب مستقلة قبل الغرب النشاف الكمي، وذلك باستخدام الأجسام المضادة والمتوسطات الثانوية fluorophore مترافق تآمرت لحساب كمية RCC2 اللازمة للوصول إلى التوازن. (C ) الناتج مثال من التجربة حيث ربط البروتينات RAC1 ملزم لبعضها البعض وتشكل مجمع الثلاثي، بدلا من التنافس. ومعاير كانت مختلطة RAC1 مع 5 ميكرولتر GFP-RCC2 وزيادة حجم-GFP coronin-1C كامل طول محملة الناتج المحلي الإجمالي فيها والزيادة في المربوطة GFP-coronin-1C دون فقدان ملزمة GFP-RCC2 يشير تشكيل معقد ثلاثي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
