Protocol
GST etiketli GTPaz 1. Saflaştırma
- Kültür, bir E. örneğin 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de pGEX-Rac1 O / N ile transforme BL21 gibi E. coli soyundan, autoinduction ortam 500 ml (25 mM Na-2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH4CI, 5 SO 4 mM Na 2, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2,% 0.5 gliserol,% 0.05 Glukoz,% 0.2 laktoz, 5 g tripton, 2.5 g maya ekstresi, 100 ug / ml Ampisilin).
- 10.000 x g'de, 4 ° C'de 10 dakika için santrifüjleme ile hasat bakteri.
- 20 ml protein ekstre edici reaktif, 1 x proteaz inhibitörü bakteriyel pelet yeniden süspanse edin ve inversiyon ile oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- 30 dakika boyunca 40.000 x g'de santrifüjleme ile lizat açıklığa kavuşturulması.
- Fosfat tamponlu tuz ile yıkandı, 2 ml glutasyon manyetik boncuklar, ekleme (PBS: 10 mM Na-2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI).
- 4 ° C'de ters çevirme ile karıştırılması, 2 saat süre ile inkübe edilir.
- Her adımda boncuk çökelmesi için bir manyetik parçacık ayırıcıyla, 10 mi, PBS ile protein yüklü boncuk dört kez yıkayın.
- Gerekli olana kadar yeniden süspanse 100 ul alikotları -80 ° C 'de 2 ml PBS içinde boncuk ve mağaza protein yüklü.
GTPaz bağlama proteinlerinin ekspresyonu 2.
- Şöyle gün önce deney, yeşil flüoresan proteini (GFP) kodlayan transfekte plazmidler HEK293T ayrı bir 75-cm 2 şişe içine, her GTPaz bağlayıcı proteinin sürümlerini etiketli. Nükleotid yükleme doğrulama için, transfect HEK293T üçüncü 75 cm 2 balona TrioD1 GFP etiketli.
- 100 ul içinde 1 mg / ml steril 150 mM NaCl polyethylamine seyreltin.
- 223 ul azaltılmış serum medya 27 ul seyreltilmiş polyethylamine ekleyin.
- 250 ul düşük serum ortamı 12 ug plazmit DNA ekleyin.
- Oda sıcaklığında 2 dakika için her bir tüp inkübe edin. Polyethylamine birleştirin ve DNA 2 dakika boyunca tek bir tüp ve vorteks karıştırır.
- Oda sıcaklığında 15-20 dakika kuluçkalayın.
- 5 ml taze büyütme ortamı ile% 90 konfluent HEK293T üzerindeki büyüme ortamı (Dulbecco Modified Eagle Ortam,% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, antibiyotikler herhangi bir) değiştirin.
- Şişeye Birleştirilen polyethylamine / DNA karışımı ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2 O / N inkübe edin.
GTPaz bağlama proteinlerinin saflaştırılması 3.
- PBS içinde transfekte edilmiş hücrelerin şişeler durulayın ve serbest sıvı aspire, 5 dakika boyunca balon boşaltın.
- 500 ul liziz tamponu içinde hücrelerini Scrape (50 mM Tris-HCl (pH 7.8),% 1 Nonidet P-40, 1 x proteaz inhibitörü) mikrofüj tüpüne.
- 30 dakika boyunca 4 ° C 'de ters çevirme ile karıştırılarak Hücreleri,.
- Liziz sırasında yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 2700 x g'de 40 ul GFP-Trap boncuklar iki çok taze lizis tamponu ile üç kez, çöktürülmesi, boncuk yıkama.
- 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüjleme ile lizatları açıklığa kavuşturulması.
- Aktarım 4 ° C de ters çevirme ile karıştırılması, yıkandı, GFP-trap boncuk ayrılması ve GFP-füzyon proteinleri, 2 saat boyunca bağlamasına izin vermek için rakip proteinin her birinin lizat açıklık. Buz üzerinde GFP-TrioD1 hücrelerinden lizat tutun.
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 mM NaCI içinde iki kez yüklü GFP-Trap boncuk yıkayın,% 0.7 (w / v) Nonidet P-40 ve iki kez de 50 mM Tris-HCI (pH 7.6) içinde, 20 mM MgCl2 , yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 2700 x g'de boncuk çökeltildi.
- 40 ul 0.2 M glisin (pH 2.5) ilave etmek ve 30 saniye süreyle aşağı ve yukarı pipetlenerek GFP füzyon proteinlerini Zehir. 4 ul 1 M Tris-HCl (pH 10.4) içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne 21.000 60 s için xg ve transfer sıvısının hemen tortu boncuklar. Saflaştırılmış protein zarar sınırlamak için hızla yapın.
- Kantitatif Blott kullanarak göreceli verim kurmak için, bir anti-GFP antikor ile Western blot ve sonda her bir saflaştırılmış protein 1 ul analizüreticinin protokolüne uygun olarak sistemi olarak konumlandırılır. Seçenek olarak ise, bisinkoninik asit (BCA) deneyi ile protein konsantrasyonlarını belirlemek ancak proteinler, özdeş bir tarzda tahlil ile reaksiyona girmeyen ya da kirletici proteinler vardır, bu hatalar ortaya çıkarır.
- 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 20 mM MgCl2 ilave edilerek mol protein konsantrasyonu dengeleyin.
GTPaz 4. nükleotid yükleme
- Aşama 1 'de hazırlanan GST-Rac1 manyetik boncuk, bir kısım çözülme.
- Her adımda boncuk çökelmesi için bir manyetik parçacık ayırıcıyla GST-Rac1 boncuk 90 ul alın ve 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCI, 0.1 mM DTT, 4 mM EDTA ile üç kez yıkayın.
- Aspire boncuklardan tamponu ve 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCI, 0.1 mM DTT, 4 mM EDTA ekleyin.
- GDP, GTP veya nükleotid yükleme rekabet deneyinde için gerekli olup olmadığını göre, 12 ul 100 mM GDP, 12 ul 10 mM gu eklemeanosine 5 '- [γ-tiyo] trifosfat (GTP yS) ya da 60 ul GST-Rac1 boncuklar için bir nükleotid.
- Nükleotid yükleme kontrolleri, üç 10-ul kısma kalan boncuk bölünmüş ve 2 ul 100 mM GSYİH, 2 ul 10 mM GTPtS veya her tüpe hiçbir nükleotid ekleyin.
- Çalkalama ile 30 ° C 'de 30 dakika boyunca damla karışımları inkübe edin.
- Deney karışımı 3 ul (aşama 4,4), kontrol karışımları (adım 4.5) her bir 0.5 ul: 1 M MgCl2 ilave edilerek nükleotid bağlı Rac1 stabilize.
Bağlama 5. Rekabet.
- 6 mikrofüj tüpleri kurmak, her biri:
200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2
(Aşama 4,7), 10 ul deney nükleotid yüklü Rac1 boncuklar
5 ul Rac1 bağlayıcı protein A (sabit bağlayıcı protein) - Her bir tüpe, 0, 1, 2.5, 5, 10 veya 20 ul Rac1 bağlayıcı protein B (değişken bağlayıcı protein) ekleyin. Bu birimler bir varsayıyorumpproximately eşit hisse sabit ve değişken bağlama proteinleri konsantrasyonları ve ayarlanması gerekebilir.
- Orada iki proteinin bağlama yakınlıkları büyük farklılıklar vardır ve bu deneysel tekrarlar yoluyla ampirik olarak tespit edilmelidir eğer bağlayıcı proteinler A hacimleri ve B ayarlayın. 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 20 mM MgCl2 ilave edilerek 235 ul bağlanma karışımın toplam hacmini hazırlayın.
- Içeren bir mikrofuge'de tüp ayarlayın:
200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2
(Aşama 4,7), 10 ul deney nükleotid yüklü Rac1 boncuklar
10 ul Rac1 bağlayıcı protein A (sabit bağlayıcı protein) - GSYİH, GTPtS ve hiçbir nükleotid kontrol tüpleri ayarlayın:
200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2
10 ul kontrol Rac1 boncuk GSYİH, GTPtS veya nükleotid ile adım 4.5 yüklü ve adım 4.7 stabilize.
180 ul HAşama 3.6 gibi hazırlanmıştır EK293T GFP-TrioD1 lizatı,
4 ul 1 M MgCI2 - 4 ° C'de ters çevirme ile karıştırılması, 2 saat süre ile inkübe karışımı.
- 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 20 mM MgCl2 ile boncuk üç kez yıkayın.
- Elute indirgeyici örnek tamponu 20 ul bağlı proteinleri (50 mM Tris-HCI (pH 7),% 5 SDS,% 20 gliserol, 0.02 mg / ml bromofenol mavi,% 5 β-merkaptoetanol).
Yarışmanın 6. Analizi
- Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Western blot ile bağlı protein (aşama 5,6) 10 ul giderin.
- 4 ° CO de membran inkübe / N anti-GFP antikorda Bloklama Tamponu içinde 1/1000 oranında seyreltilmiş PBS'de 1x seyreltilmiş,% 0.1 Tween-20 isim levhası GTPaz bağlama proteinlerinin her ikisi de tespit etmek.
- PBS ile 10 dakika,% 0.1 Tween-20, membran üç kez yıkayın.
- 800 konjuge edilmiş anti-tavşan sek DyLight içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca zarın inkübesekonder antikor Bloklama Tamponunda 1 / 10,000 seyreltilen,% 0.1 Tween-20, PBS içinde 1 x seyreltilmiştir.
- PBS ile 10 dakika,% 0.1 Tween-20, membran üç kez yıkayın.
- Üreticinin protokolüne göre, bant yoğunluğu ölçmek için yazılımını kullanarak, kızılötesi görüntüleme sistemi kullanılarak zar tarama.
- Değişken rakip (Protein B) birim karşı her proteinin bant yoğunluğunu çiziniz.
- Çizgiler, denge elde edildiği rakip oranının saptanması için sabit bir rakip (Protein A, 5 ul) hacimce kesiştiği noktada değişken yarışmacının hacmi bölün.
- Adımda 6,1-6,6 tarif edildiği gibi p21-aktive edilmiş kinaz 1 (PAK1) (bir efektör) ve GFP-TrioD1 (GEF), nükleotid yükleme durumu, prob membran geçerli olabilmesi için.
Representative Results
Bu protokol, rakip hassas konsantrasyonunu bilinmesi gereken (Şekil 1) olmadan Rac1 için bağlayıcı ortaklar nispi afiniteler hesaplamak için tasarlanmıştır. Protein konsantrasyonunun saptanması hatalar oluşturan bir sinyal yolunun, moleküller arasındaki rekabeti söz konusu olduğunda gerekli değildir. Ancak, iki yarışmacı tahlil farklı hacimleri eklerken basit oranları hesaplandı izin vermek için stok solüsyonları aynı molar konsantrasyona sahip olduğunu bilmek önemlidir. GFP-Trap boncuk 40 ul 300 pmol yani birleşik 75 cm yüksek iki farklı bağlama proteinleri preparatları düzenlenmesinden önce benzer olacaktır ve bunun sonucunda, boncuk doyuracak olan ifade eden hücrelerin 2 şişeler ~ bir bağlama kapasitesine sahip (Şekil 2A). Proteinlerin bir zor ifade ederse, bu sorun, hücrelerin birden çok şişeden bu proteinin saflaştırılması ile aşılabilir.
8 (Şekil 2B) ile tespit edilebilir. Geçiş durumunu stabilize etmek GTPaz ücretsiz nükleotid tercihen bağlamak GEFS. GEFS genellikle inaktif düşük bolluk, vardır ve sık sık kötü leke gibi, deney nükleotid serbest GTPaz bir GEF veya GEF fragmanı aşın daha iyidir. Biz sık sık Trio'nun ilk İKO benzerlik kullanmak, bir GFP füzyon (GFP-TrioD1 9) (Şekil 2B) olarak ifade ancak herhangi GEF çalışmaya devam eder. GSYİH yüklü GTPaz bağlanan proteinler nadirdir. Bindi basitçe valide edilebilir böyle bir protein 7 veya GSYİH yükleme gibi Biz son zamanlarda RCC2 bildirdiNe GEF'ten de efektör ng.
Deney çıkış GTPaz bağlanan iki GFP etiketli bağlama partnerleri gösteren bir Western blot olacaktır. Her iki proteini tespit etmek için, tek bir antikor kullanarak, her iki rakip içindeki miktarlarda bağlanan hangi konsantrasyonları belirlenebilir ve bu nedenle göreceli afıniteleri anlaşılmaktadır. Rac1 kaçakçılığı protein pervane etki alanı arasındaki bu örnek yarışmada, Koronin-1C (protein A Rac1-bağlama) ve Rac1-ayırıcı protein, RCC2 (protein B Rac1-bağlama), (Şekil 3A) gösterilmiştir. Koronin-1C pervane (5 ul) sabit bir hacim kullanılarak ve RCC2 artan miktarlarda ekleyerek, RCC2 güçlü olduğunu gösteren, GFP arasından bu denge RCC2 (yıldız) 1,25-2,5 ul ulaşılır leke görebilir Koronin-1C daha Rac1 için afinite. Her competito için ortalama değerler kantitatif Batı lekelenmesi kullanılarak bantların yoğunluğunu ölçen ve komplo iler, denge noktası hacimleri hangi eğrileri (Şekil 3B) kesişir belirleyerek doğru hesaplanabilir.
Bağlanma eşleri birbirine olarak Rac1 bağlanma ile bağlanması halinde başarılı bir rekabet deneyinde mümkün engellerden biri. Şekil 3A + B biz oldukça tam uzunlukta Koronin-1C daha RCC2 ve Koronin-1C pervane etki alanı arasındaki rekabeti, gösterir. Kesik Koronin kullanılmasının nedeni Koronin-1C, aynı zamanda kuyruk alanı üzerinden RCC2 bağlanması anlamına gelir. Tam uzunlukta Koronin-1C RCC2 karşı titre edildiğinde, her iki proteinin bağlanması nedeniyle üçlü kompleks oluşumu yerine rekabet (Şekil 3C) için tespit edilir. Yarışma oluşup ise, bir proteininin diğer düşüşler olurken artacak ve toplam bağlı GFP-füzyon sabit kalacaktır. Durumlarda üçlü bir kompleksi, GTPaz bağlayıcı proteinin bir kesecek için gerekli olan formları burada böylece competitors artık etkileşim.
Şekil 1. İş Akışı. Yarışma analizleri kullanılarak GTPaz-bağlayıcı proteinlerin afinite belirlemek için iş akışı şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Saflaştırılmış proteinlerin Şekil 2. Doğrulama. (A) saflaştınldı GFP etiketli iki proteinin nispi verimi belirlemek için, anti-GFP ile sondalama Western blot ile analiz bağlayıcı proteinlerin Rac1. Deney sırasında dengeleme Bu tür da bağlanma deneyinde eşleşecek şekilde iki protein konsantrasyonu ayarlanmasına olanak tanır. (B) GDP, GTPtS ve hiçbir nükleotid yüklü GST-Rac1 endojen PAK1 veya aşırı GFP-TrioD1 için komplo tespit proteinleri GFP-TrioD1 ifade HEK293T gelen lizat ile inkübe ve bağlıydı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Görece protein Şekil 3. Western Blot analizi ile yapışma. Örnek çıktıları yarışması bağlayıcı tahlillerinden. (A) Rac1 5 ul GFP Koronin-1C pervaneli alanı ile karıştırılmış ve titre edildi GFP-RCC2, gittikçe artan miktarlarda edildi GDP-yüklendi. Tarafından GFP için Western blotting bağlanmış proteinler, iki proteinin diferansiyel tayinle belirlenmesine ile ilgili sorunlar önlenir ve GFP sinyali iki füzyon proteinleri arasındaki molar oranı bildirir. Yıldız eithe rekabet oranlarını gösterirdenge noktasının r tarafında. (B), üç bağımsız deneyin ilişkili bağlantı GFP füzyon proteinlerinin Bant yoğunlukları, dengeye ulaşmak için gerekli olan fluorofor-konjuge sekonder antikor ve ortalamalar RCC2 miktarını hesaplamak için çizilen kullanılarak niceliksel Western blot ile ölçüldü. (Cı Rac1 bağlayıcı proteinler rekabet etmek yerine birbirine bağlanan ve üçlü bir kompleks oluşturur bir deney) Örnek çıktı. GDP-yüklü Rac1 5 ul GFP RCC2 ile karıştırıldı ve GFP-Koronin-1C tam boyda, gittikçe artan miktarlarda edildi titre edilmiştir. Bağlanmış GFP Koronin-1C'de artış bağlanmış GFP RCC2 kaybı olmadan üçlü kompleks oluşumunu gösterir. Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
