Abstract
Relativt hvilende somatiske stamceller støtte livslang cellefornyelse i de fleste voksne vev. Neuralstamceller i den voksne hjernen hos pattedyr er begrenset til to bestemte nevrogene nisjer: den subgranular sonen av dentate gyrus i hippocampus og den ventrikulære-subventricular sone (V-SVZ; også kalt subependymal sone eller SEZ) i veggene av den laterale ventriklene. Utviklingen av in vivo genoverføring strategier for voksen stamcellepopulasjoner (dvs. de av hjernen hos pattedyr) som fører til langvarig ekspresjon av transgener i ønskede stamceller og deres avkom avledet er et viktig verktøy i dagens biomedisinsk forskning og bioteknologiske. Her er en direkte in vivo metode presenteres for stabil genmodifisering av voksen mus V-SVZ celler som utnyttet cellesyklus-uavhengig infeksjon ved LVS og høyt spesialiserte cytoarchitecture av V-SVZ nisje. Spesielt den gjeldende protokollen involveres injeksjon av tomme LVS (kontroll) eller LVS som koder for spesifikke transgen ekspresjonskassetter inn i enten den V-SVZ seg selv, for in vivo målsøking av alle typer celler i nisje, eller inn i laterale ventrikkel lumen, for målretting av ependymal celler bare. Ekspresjonskassetter blir deretter integrert inn i genomet av de transduserte celler og fluorescerende proteiner, også kodet for av LVS, tillater påvisning av de transduserte celler for analyse av celle-autonome og ikke-autonome, nisje-avhengige virkninger i de merkede celler og deres avkom.
Introduction
Den murine ventrikulære-subventricular sone (V-SVZ), i veggene i den laterale ventrikkel vender striatum, er en meget aktiv germinal region der en kontinuerlig prosess med stamcelle replikering og differensierings resulterer i vedvarende produksjon av luktelappen (OB ) interneurons og corpus callosum oligodendrocytes 1. Den livslang generasjon av disse cellene ser ut til å bli støttet av nærværet i denne regionen av nevrale stamceller (NSC; også kalt B1-celler) som uttrykker den astrocytic antigenet glial fibrillært surt protein (GFAP) og stamcellemarkører som nestin, Id1 og Sox2 to. GFAP-uttrykk B1 celler generere transitt forsterke stamfar (TAP) celler (C celler), som uttrykker transkripsjon faktorer Dlx2 (distal-mindre homeobox 2) og Ascl1 (pattedyr achaete-Schute homolog 1) og dele seg raskt et par ganger før de gir opphav å migrere neuroblasts (A celler) eller oligodendroblasts 3. Nylig generert formeringenregenerative neuroblasts migrere anteriorly, forming rostral vandrende stream (RMS) til OB, der de integreres i kornet og glomerulær lag som differensierte hemmende interneurons. Migrere unge oligodendroblasts flytte til CC, hvor de blir umodne NG2-positive celler som fortsetter å dele lokalt eller differensieres til modne myelinerende oligodendrocytter 1,4.
B1 celler som stammer fra foster radiale gliaceller, beholde det langstrakte og polarisert morfologi av sine forgjengere og viser en svært spesialiserte forhold til sin nisje. De spenner mellom ependyma som linjer opp ventrikkelen og nettverket av blodkar som vanne V-SVZ nisje. Den lille apikale prosessen med B1 celler intercalates blant multiciliated ependymocytes og ender i en enkelt ikke-motile primære cilium, mens deres basal prosess strekker lange avstander for å nærme seg planar vaskulær plexus som vanner denne nisjen som slutter på basal lamina av plexus kapillærer 2,5-8.
Den mest pålitelige måte å skille B1-NSCs fra ikke-nevrogene astrocytter, som også er GFAP +, i det intakte V-SVZ nisje er basert på hel-montere preparater av ventrikkelen sideveggen og deres analyse av 3-D konfokal mikroskopi etter farging for GFAP å merke den tynne B1-NSC apikal prosess, β-catenin å avgrense cellemembraner, og enten γ-tubulin som en markør for cilial basale organer eller acetylert α-tubulin å merke omfanget av hver cilium 5,8. Observasjoner av disse hel-festene fra ventrikulære overflate har indikert at B1 og ependymal celler er anordnet i "små hjul" til 5, hvori de uniciliated apikale prosesser av en eller flere GFAP + B1 celler er omkranset av en rosett av multiciliated ependymal celler.
Den karakteristiske morfologi B1 celler korrelerer med eksperimentelle bevis indicating at blodkar / endotelceller og ventrikulære cerebrospinalvæsken (CSF) utgjør regulert kilder til løselig signaler som virker på NSCs 2,6,9-11. På ventrikkel overflaten, homotypisk og heterotypic apico-lateral interaksjoner som involverer ependymal og B1 celler inkluderer trange veikryss og adherens veikryss 5,12. Videre adhesjonsmolekyler innblandet i den synaptiske komplekser mellom B1 og ependymal celler, slik som N-cadherin og V-CAM, er blitt vist å regulere ikke bare den sterkt organisert posisjonering av B1 i den V-SVZ nisje, men også deres quiescence 12 , 13. Den ependymal-B1 celle monosjikt synes å virke som en diffusjonsbarriere som tillater den regulerte strøm av vann og små molekyler fra CSF, men begrenser den intercellulære passasjen av store proteiner 10,11. Eksperimentelle studier indikerer at en unik posisjon B1 celle apikal cilium kan spille en rolle som en sensor signal polypeptider stede i CSF 2,5-7. Ependymal celler er i og for seg også en kilde av oppløselige og membranbundne signaler med en rolle i reguleringen av NSC oppførsel 14,15.
Spor nukleosider, som for eksempel brom-deoksyuridin (BrdU) eller retrovirus har blitt mye brukt til å merke stamceller, inkludert NSCs, in vivo. Imidlertid er disse fremgangsmåter ikke er optimale for langvarig skjebne tracing fordi BrdU signaler fortynne gjennom gjentatte celledelinger og retroviruser ut til fortrinnsvis å målrette forbigående forsterkning av cellene på grunn av deres behov av celleproliferasjon for transduksjon 16,17. For å undersøke NSC fysiologi in vivo, inklusive samhandling med nisje komponenter, er det avgjørende å etablere en metode for å merke og spore sjelden dele celler, som B1-NSCs er i stor grad stillestående og sine naboland ependymal celler aldri dele under fysiologiske betingelser 3. Her viser vi at lentiviral vektorer (LVS) gir mulighet for høy effektivitet genet marking og langvarig modifikasjon av voksne NSCs og ikke-delende celler ependymal, på grunn av de rimelige til deres evne til å omsette og å integrere i genomet av målceller i en cellesyklus-uavhengig måte. Videre viser vi hvordan rute for levering og viral titer hjelp til spesielt transduce ependymal celler, men ikke B1 celler og dermed gir analysen av nisje-avhengige, ependymal effekter på NSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ETIKK UTTALELSE: Denne protokollen følger retningslinjene dyr omsorg ved University of Valencia i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU.
1. Generering av LV for In Vivo Merking Studies (se Figur 1a)
FORSIKTIG: Prosedyren er beskrevet her er biosikkerhetsnivå 2, derfor utføre alle følgende prosedyrer i en biohazard hette. Sikre at forsknings personell er tilstrekkelig kvalifisert og opplært i alle prosedyrer. Bruk personlig verneutstyr, inkludert kappe, doble hansker og egnet øyebeskyttelse. Til slutt, grundig rense alle verktøy og overflater som kan ha vært i kontakt med virus i henhold til godkjente anlegg desinfeksjonspraksis (ved å tørke med 70% etanol, 10% blekemiddel og / eller autoklave).
- Produksjon av LV i humane embryonale nyre 293T celler
- Start denne protokollen ved å forberede ren DNA for transfeksjon. Utarbeide og rense hvert plasmid ved å dobbelt CsCl gradient sentrifugering eller andre kommersielt tilgjengelige kolonnefremgangsmåter som ga endotoksin-fritt DNA. I denne protokollen har vi brukt overføring vektor plasmid pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Anbefalt kjerne emballasje plasmider er pMDLg / pRRE og pRSV.REV og konvolutt plasmid pMD2G 13,18,19.
- Tjuefire timers før transfeksjon, plate 5 x 10 6 293T celler i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) (se tabell of Materials) i en 10 cm plastskål for å oppnå en tilnærmet 1/4 til 1/3 sammenflytende kultur for transfeksjon. Inkuber ved 37 ° C i en fuktet inkubator i en atmosfære med 5-7% CO2.
- Erstatt medium med friskt medium to timer før transfeksjon.
- I et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør blanding 10 ug overføringsvektor plasmid (inneholdende cDNA av transgenet eller shRNA som skal leveres) med 2,5 ug av den pRSV.REV og 5 pg av pMDLg / pRRE emballasje plasmider, og 3,5- #181 g av konvolutten plasmid pMD2G. Utgjør plasmidet løsningen til et sluttvolum på 450 ul med 0,1X TE-buffer (se Tabell of Materials) / dH 2 0 (2: 1). Deretter tilsett 50 pl av 2,5 M CaCl2.
- Danner bunnfallet ved dråpevis tilsetning av 500 ul av 2x HEPES-bufret saltvann (HBS, se tabell of Materials) oppløsning av 500 ul DNA-TE-CaCl2 blandingen under virvling ved full hastighet.
- Legg bunnfallet til 293T-celler umiddelbart. Rotér plate å blande. Returner cellene til inkubatoren og endre medium 14-16 timer etter transfeksjon.
- Samle cellesupernatanter 30 timer etter endring av media. Filtrere supernatanten gjennom et 0,22 pm pore nitrocellulosefilter og videre til konsentrasjon.
- Konsentrasjon av LVS
- Konsentrer den betingede medium ved ultrasentrifugering ved 50 000 xg (19000 rpm med SW-28 ultrasentrifuge rotor) for totime ved romtemperatur (RT) i et 30 ml polypropylenrør med konisk rotor gjennomsiktig rør.
Merk: Bruk ultra adaptere for koniske rotor rør (se tabell for material). - Kast supernatanten ved dekantering og resuspender pelleten i et lite volum (200 ul eller mindre hvis bare en sentrifugering blir utført) i fosfatbuffersaltløsning (PBS; se tabell of Materials). Deretter pipette opp og ned ca 20 ganger.
- Pool suspensjonene og konsentrer igjen ved ultrasentrifugering, også ved 50 000 x g (23 000 rpm med SW-55 ultrasentrifuge rotor) i 2 timer ved romtemperatur. Bruk polypropylen gjennomsiktige rotor rør med et nominelt volum på 5 ml (se tabell for material).
- Resuspender den siste pellet i et meget lite volum (1/500 eller 1 / 1.000 av utgangsvolumet av medium) med sterilt PBS og riste på et roterende hjul i 1 time ved RT. Del inn i små porsjoner (5-20 mikroliter) og freeze dem ved -80 ° C.
- Behandle alle tomme tuber med 10% blekemiddel før du kasserer.
- Konsentrer den betingede medium ved ultrasentrifugering ved 50 000 xg (19000 rpm med SW-28 ultrasentrifuge rotor) for totime ved romtemperatur (RT) i et 30 ml polypropylenrør med konisk rotor gjennomsiktig rør.
- Lentiviral Titrering ved hjelp av flowcytometri
- Dagen før platen 5 x 10 4 HeLa-celler per brønn i 6-brønners vevskulturplater i 2 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (se tabell of Materials). Inkuber ved 37 ° C i en fuktet inkubator i en atmosfære med 5-7% CO2 i 24 timer.
- På dagen for titrering, tine en delmengde av den virale lager og fremstille seriefortynninger, fra 10 -3 til 10 -8, i DMEM.
- For å gjøre dette, ta en 24-brønns plate og tilsett 2 ml DMEM til den første brønnen og 1,8 ml til følgende brønner. Deretter legger til den første brønn 2 ul av den konsentrerte viruslager (til en endelig fortynning på 1: 1000 eller 10-3).
- Etter pipettering flere ganger for å grundig blande løsningen, endre tips og overføre 200 mL av 10 -3 fortynningtil den andre brønnen. Gjenta prosedyren serielt i følgende brønner inntil 10 -8 fortynning er gjort.
- Ta HeLa-celler belagt gårsdagen fra inkubatoren. fjerne medium nøye fra brønner. Tilsett 1 ml av hver fortynning viral sammen med 1 mL av 8 mg / ml hexadimethrine bromid til HeLa-celle-inneholdende brønner. Rotér plate å blande.
Merk: Hexadimethrine-bromid blir tilsatt for å øke virusadsorpsjon til cellene i kultur. - Returner cellene til inkubatoren og tillate infeksjonen til å foregå i 72 timer. Etter at fjerne det medium, vaskes cellene en gang med PBS og tilsett 200 pl trypsin-EDTA (se tabell of Materials) til hver brønn.
- Etter 5 minutter ved 37 ° C, tilsett 2 ml PBS til hver brønn, og høste cellene i flowcytometri rør.
- Sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur og aspirer supernatanten.
- Resuspender pellet med 1 ml fikse solutipå (1% formaldehyd-elektronmikroskopi grad og 2% føtalt bovint serum i PBS), deretter vortex rørene.
- Analyser av cellene i et strømningscytometer ved bruk av en 488 nm argon-ionlaser på 15 mW.
- Sett opp instrumentet med standard konfigurasjon: fremtids scatter (FS), side scatter (SS), og fluorescens for GFP (525/40 nm). Velg cellepopulasjon gating i en FS kontra SS prikkplott å utelukke celle aggregater og rusk. Samle fluorescens i logaritmisk skala. Beregn antall GFP + celler i hver prøve.
- Beregn vektor titer ved hjelp av følgende formel:% GFP + / 100 x antall celler som er infisert x fortynningsfaktor (DF) = transduseheter (TU) / ml.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av de forskjellige deler av prosedyren (a) en del av t.Han protokoll: generering av LVS for in vivo-studier merking, fra transfeksjon av celler med HEK293T egnede plasmider for å generere LVS til bestemmelse av virustiter ved strømningscytometri ved å bruke den angitte formel. Navnene på plasmider og sentrifuger rotorene er indikert. (B og c) Del 2 av protokollen: stereotaxic injeksjon av LVS. "B" viser et eksempel på en Vernier målestokk, en enhet som er en del av stereotaksiske instrumenter og tjener til gode målinger. Som et eksempel, pilene angir 4.23 cm. En Vernier skala brukes til å bestemme koordinatene i Antero-posterior (AP), medio-lateral (ML), og dorso-ventral (DV) akse som vist for en topp-view (til venstre) og for en sagittal seksjon (høyre ) i hjernen. "C" indikerer plasseringen av bregma som skjæringspunktet mellom sagittal og koronale suturene. LVS injiseres ved hjelp av en sprøyte. (D) Skjematisk tegning som viser hvordan hjernen jegs behandlet for analyse. De to halvkuler er delt og hver er delt i to blokker. Block "a", som inneholder OBS, er produsert av en coronal kutt på AP-nivå umiddelbart posterior til OB krysset med telencephalon (bregma 2,46 mm, se Paxinos' Atlas for referanse). Blokk "b" er produsert av to koronale snitt, en på nivå like fremre til den rostrale del av corpus callosum (bregma 1,7 mm) og en annen en i høyde med overgangen mellom de to laterale ventrikler (bregma -0,22 mm). GL, glomerulær lag; GCL, granule celle laget; st, striatum; cc, corpus callosum; ac, anterior commissure; lv, lateral ventrikkel.
2. stereotaksisk Injeksjon av LV inn i den V-SVZ / striatum ramme eller inn i lateral ventrikkel (se figur 1b)
- Preparat
- Sterilisere en 5 mL kapasitet sprøyte med en 33 gauge nål ved å sprøyte ned kroppen og nål med 70% etanol med stempelettrukket ut hele veien. Gjentatte ganger aspirer etanol fra en 1,5 ml mikrosentrifugerør og løse det helt ut flere ganger, og skyll sprøyten grundig med sterilt vann etterpå. Plasser sprøyten trygt til side i kulturen panseret og la det tørke.
- Fremstille et smittefarlig avfallsbeholder med 10% blekemiddel til et egnet volum for nedsenking av alt avfall fra denne fremgangsmåten (vanligvis 200 ml i en 500 ml beholder).
- Forbered og forvarme en 37 ° C vannseng ved å fylle en lukkbar plastposen med vann og varmer det til 37 ° C. Dette vil tillate mus å komme seg etter injeksjon.
- Fjern viral aksjer fra -80 ° C fryser lagring 1 time før du starter injeksjoner og plasser hetteglasset på et roterende hjul ved RT. Etter tining, opprettholde viral lager på isen i den tiden av injeksjoner. Før stereotaxic injeksjon av LV, fortynne den konsentrerte viral aksjer til 10 6 TU / mikroliter ved hjelp PBS i kulturen panseret.
- Rensemiddel området valgt for å utføre operasjonen med 70% etanol.
- Mikroinjeksjon av LV
- Velg og sterilisere verktøyene som trengs for kirurgi (skalpell, drill og små pinsett).
- Anesthetize en 6-8 uker gamle mus med intraperitonealt (ip) injeksjon av en veterinær-overvåket blanding av ketamin og medetomidin. Veie hvert dyr og dose hver med 50-75 mg ketamin og 0,5-1 mg medetomidin per kg musekroppsvekt (omkring 100-125 pl av ketamin / medetomidin arbeidsløsning per mus).
- Vurdere bedøvelse planet ved å klemme tær, hale eller øre og sikre at dyret viser ingen reaksjon.
- Når musen er bedøvet, injisere butorphanol subkutant i en siste dose 0,4-0,5 mg per kg mus vekt å redusere postoperative smerter.
- Barber området mellom ørene og desinfiser huden ved hjelp av en jodofor som iodopovidone eller 70% etanol. Rens bruker sterilt bomull-tipped applikatorer. Vær forsiktig så du ikke overdrevet våt dyret da dette kan forverre hypotermi.
- Plasserer dyret i liggende stilling på en stereotaksisk ramme og nøye feste på hodet ved hjelp av øret barer og ganen støtte av anordningen. Hold musen med en varmepute sett ved 37 ° C og gjelder oftalmisk smøremiddel til øynene.
- Lag en 1 cm lang innsnitt på hodet huden lengderetningen ved hjelp av en skalpell, og forsiktig trekke huden å eksponere skallen hjelp av gode pinsett.
- Rengjør forsiktig benet overflaten med en steril bomull-tipped applikator. Rens den eksponerte skallen bein av eventuelle gjenværende vev.
- Monter sterilisert sprøyte på stereo enheten ved hjelp av sprøyteholderen.
- Bevege sprøyteholderen x-, y- og z-aksen inntil spissen på sprøytenålen er plassert på bregma, det sammen punkt hvor det sagittale (langsgående og mediale) sutur perpendikulært gjennomskåret av den koronale sutur (figure 1b). Pass på at "null" posisjon dorso-ventral (DV) aksen er på skallen overflaten på bregma.
- Bevege sprøyten til x- og y-koordinatene destinasjon (se tabell 1 og figur 1b).
| Region injeksjons | koordinater | ||
| Antero-posterior (AP) | Medio-lateral (ML) | Dorso-ventral (DV) | |
| SEZ / striatum grensen | +0,6 mm | +1.2 mm | -3.0 mm |
| lateral ventrikkel | -0.3 mm | +1,0 mm | -2.6 mm |
Tabell 1: stereotaksiske koordinater for den iskrivninger. For AP og ML-aksen, x og y koordinater er gitt som en distanse (i mm) fra bregma. "-" Indikerer "mot bakre". For DV-koordinater "null" er den overflate av hodeskallen ved bregma punkt og DV-koordinatene angir avstanden (i mm) ned fra dette punkt.
- Annotere x, y og z-koordinater bestemmelsessted i Vernier skala for å være i stand til å komme tilbake til injeksjonsstedet senere. Mark bein på x- og y-koordinatene ved hjelp av et kirurgisk tusj.
- Flytt sprøyten fra arbeidsområdet.
- Ved hjelp av en elektrisk drill lage et hull på skallen forsiktig for ikke å skade hjernen. Ikke bor pial overflaten da dette kan skade hjernen overflaten.
- Last sprøyten med 1 mL av 10 6 TU / mikroliter viral løsning. Bruk en 33 måler skarp skrå nål som spissen har en vinkel på 10-12 °. Plasser sprøytespissen i 90 ° angle i forhold til hjernens overflate.
- Flytt sprøyten tilbake til injeksjonsstedet og flytte den ned til spissen berører pial overflaten.
- Trenge inn i hjernen med sprøyten til z-koordinat i DV-aksen.
- Sakte slipper virussuspensjonen, med en hastighet på 0,2 mL / min, for å minimere skade på hjernevevet grunn av overdreven fluidtrykk.
- Vent i 5-10 minutter for å redusere tilbakestrømning av virussuspensjon og deretter trekke sprøyten meget langsomt. Blot en hvilken som helst overskudd av væske som kan vises ved overflaten som følge av tilbaketrekningen av sprøyten ved hjelp av en laboratorie-tørke og plassere den umiddelbart i blekemiddel-holdige biosikkerhet avfallsbeholder.
- Ta dyret ut av stereotaxic sett, legg den på en varm pad, og lukke såret ved hjelp av huden lim. Snu sedasjon ved hjelp 0,1-1,0 mg / kg kroppsvekt atipamezol.
- Injiser Bupenorphrine subkutant ved en sluttdose på 0,1 mg pr kg musevekt hver 12. time,starter 4 timer etter administrasjon av kortvarige Butorphanol smertestillende.
- Plasser dyret i en individualisert bur med en varm pad og følge nøye før musen gjenoppretter fra anestesi. Plasser en pose med hydrogel i buret for å hjelpe dyret hydrat etter utvinning.
- Kast all bio-forurenset avfall i flytende blekemiddel biohazard disposisjon. Rengjør sprøyten ved aspirasjon og utstøting av etanol og skyll med vann. Desinfisere området, stereotaxic sett og kirurgisk materiale som har vært brukt med blekemiddel og 70% etanol.
- Hold injisert mus isolert i biosikkerhetsnivå 2 rom for 24-48 timer etter som de kan overføres til en vanlig bolig anlegg
3. Histologisk analyse
- Perfusjon, vev samling, og seksjonering
- Dypt bedøver mus bruker en veterinær-overvåket blanding av medetomidin og ketamin (vurdere anestesiplanet ved å klemme toes, hale eller øre), som beskrevet tidligere.
- Tran perfuse musene med 25 ml saltoppløsning, fulgt av 75 ml 4% PFA i PB i samme takt 17.
- Pakk hjernen og post-fikse det ved å dyppe den i minst 10 ganger sitt volum av kald 4% PFA i PB i 1-16 timer (økt post-fikseringstider kan redusere immunoreaktiviteten av enkelte antigener). Vask grundig gjenværende PFA med PB.
- Skjær hjernen følgende indikasjoner på Figur 1d og lim den resulterende blokken til innehaveren av en vibratome hjelp cyanoacrylate.
- Samle 30 mikrometer tykk Serial koronale seksjoner ved hjelp av en vibratome. Oppbevar hjerneskiver i 24-multibrønnplater med PB ved 4 ° C. For å forhindre forurensning, kan 0,05% natriumazid tilsettes til PB løsning.
- immunhistokjemi
- Inkuber frittflytende seksjoner i blokkeringsbuffer (PB med 0,05% natriumazid, 1% glycin, 5% normalt geiteserum og 0,1% Tritpå X-100) i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting i en gyngende plattform.
- Fjern forsiktig blokkeringsbuffer med en pipette, tilsette en passende fortynning av anti-kanin-GFP primære antistoff (se tabell of Materials) i blokkeringsbuffer og inkuber vev med denne fortynning i 48 timer ved 4 ° C med forsiktig risting.
- Vask av den primære antistoffløsning minst 3 ganger med PB, en vask hvert 10 min.
- Inkuber frittflytende seksjoner med en passende fortynning av fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer) i blokkeringsløsning (se tabell of Materials) i 1 time ved romtemperatur og forsiktig risting. Beskytt seksjoner fra direkte lys under inkubasjon.
- Vask av det sekundære antistoff løsning med PB, 3 ganger, en gang hvert 10 min, og farge vevet ved inkubering av seksjonene med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) ved 1 mg / ml i vann i 5 minutter. Vask av DAPI løsning ved å skylle to ganger og raskt viddh vann.
- Forsiktig seksjonene på et objektglass med en fin pensel. Hell noen dråper av monteringsmedium for fluoriserende preparater (se tabell of Materials) over vev og plassere et dekkglass forsiktig på toppen, å sjekke at monteringsløsning er korrekt fordelt over hele overflaten, og det ikke er noen bobler. Klem forsiktig ned dekkglass for å drenere overflødig av montering medium.
- Når monteringsløsning tørker ut (2-16 timer), analysere prøven ved konfokal laser scanning mikroskopi med 488 nm laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LV-formidlet gen-avgivelsessystem kan benyttes for den langsiktige in vivo transduksjon av celler i den voksne mus V-SVZ, slik at deres sporing og genetiske endringer i løpet av proliferasjon, migrering og differensiering. Infeksjonen og uttrykket er meget effektive og gir tallrike celler som lett kan skilles blant de ikke-infiserte celler ved ekspresjon av reporter inkludert. Vi har så langt visualisert transduserte celler med GFP fluorescerende reportere, drevet av den allestedsnærværende uttrykt fosfoglyceratkinase-promoteren, men andre reportere eller protein-koder kan også anvendes. Vi bruker rutinemessig antistoffer mot GFP i stedet for å stole på direkte påvisning av reporteren utslipp som det gir en sterkere fluorescerende signal. Videre kan hjernen bli dissekert frisk og neddykket i fiksativ men mye bedre resultater oppnås ved transcardial perfusjon.
Renset, konsentrert vektor aksjer er sakte injected henhold stereotaksisk veiledning inn i den V-SVZ ved sin grense i striatum (figurene 2a, b). To måneder etter injeksjon ble en rekke GFP + celler funnet i V-SVZ og i en omtrentlig 1 mm radius fra injeksjonsstedet (2a, b). Infeksjon med LVS resulterer i transduksjon av alle typer celler i V-SVZ og ekspresjon av reporter ved ependymal celler indikerer at LVS kan også effektivt rettet mot ikke-delende celler (figur 2c, se også 15). GFP-merking mønster i V-SVZ var lik den som finnes etter 2 uker 18. Ingen tegn til vev reaksjon, men var detekterbar ved 2 måneder etter injeksjonen ettersom den lange perioden tillater utvinning av vev fra skade påført av operasjonen. I løpet av to-måneders periode, infiserte TAP celler utvikle seg til A-neuroblasts som vandrer ut i sonen mot OB. Fordi denne prosessen tar bare noen få dager 3, tilstedeværelsen av GFP+ Neuroblasts i RMS 60 dager etter smitte indikerer at LVS også målrette nevrogen B1-NSCs (figur 2d). Transduksjon av B1, C og A-celler på tidspunktet for injeksjonen utbytter GFP + interneuroner i OB (figur 2e).
Injeksjon av et lite volum av høy-titer konsentrert LV stocks inn i laterale ventrikkel gir infeksjon av ependymocytes bare (figurer 2f-h). De fleste ependymal celler, som inneholder kalsium bindende protein S100β, uttrykke reporteren etter bare 15 dager fra smitte (Figur 2i). I motsetning til injeksjon i V-SVZ / striatal grense, ble det ikke GFP + celler observert subependymally lokalisert eller i RMS eller OB ved hjelp av denne fremgangsmåten (fig 2h, j). Begge typer infeksjoner kan analyseres i snitt gjennom V-SVZ som forklart. De kan også bli analysert i hel-montere preparater av sidehullricle vegg (se protokoll 8).
Nylig har vi beskrevet hvordan N-cadherin mediert celle-celle adhesjon av B1 celler til ependymocytes regulerer deres quiescence. Vi har benyttet fremgangsmåten beskrevet her for å levere LVS bærer cadherin dominant-negativ konstruksjoner som har resultert i inaktivering av N-cadherin. Vi har vist at tapet av N-cadherin i NSCs og ependymal celler eller i ependymal celler bare fremmet en økning i antallet og cellesyklus oppføring av NSCs som følge av avbrudd av homotypisk celle-celle interaksjoner (figurene 3a, b; se 15).
Figur 2: Reporter deteksjon ved immunofluorescens i deler av injiserte mus (a) Skjematisk representasjon av voksen sub-ventrikulær sone nisje.. En forenkling av den cellulære komponenter;ts av nisje er avbildet. B1 celler er polarisert og viser en spesialisert forhold til nisje. De spenner mellom ependyma som linjer opp ventrikkelen og nettverket av blodkar som vanne V-SVZ nisje. Den lille apikale prosessen med B1 celler intercalates blant multiciliated ependymocytes og ender i en enkelt ikke-motile primære cilium, mens deres basal prosess strekker seg til å nærme seg planar vaskulær plexus som vanner denne nisjen slutter i basal lamina av plexus kapillærer. B1 celle derivater er middels stamfedre som aktivt sprer i nærheten av blodkar og trekkende kjeder av neuroblasts mot olfactory pærer i kontakt med nisje astrocytter. (B) Skjematisk fremstilling av en koronale snitt gjennom en halvkule som viser nivået for injeksjon og posisjonen av sprøytespissen for injeksjoner ved den V-SVZ / striatum grensen. (C) Micrograph tatt på samme nivå som vises i skjematisk stastilt med DAPI (grå, venstre) og for immundeteksjon av GFP (grønt, høyre) 60 dager etter injeksjonen. De stiplede linjer angir grensene for corpus callosum. (D) Høyere forstørrelse av en immunofluorescent påvisning av GFP reporter injisert i den V-SVZ nærhet eller striatum kant i en koronale snitt gjennom V-SVZ. De stiplede linjene indikerer grensene for V-SVZ. Merk at mange celler er infisert i V-SVZ nisje. Ependymal celler kan bli anerkjent som cuboidal celler begrensende ventrikkelen lumen. (E) immunfluorescens for GFP (grønt) og neuroblast markør PSZ-NCAM (rød). Legg merke til tilstedeværelsen av dobbelt-positive celler, noe som indikerer generering av neuroblasts fra NSC som ble smittet 60 dager før. Hvite pilspisser peke på neuroblasts. Innfellinger tilsvare den innelukket i den hvite firkanten regionen. (F) Skjematisk fremstilling av en koronale snitt gjennom en halvkule som viser nivået for injeksjon og posisjonen avsprøytespissen for injeksjoner på den laterale ventrikkel. (G) Micrograph tatt på samme nivå vist i skjematisk farget med DAPI (i grått, til venstre) og for immundeteksjon av GFP (i grønt, høyre) 15 dager etter injeksjonen. De stiplede linjer angir grensene for corpus callosum. (H) Høyere forstørrelse av en immunofluorescent påvisning av GFP reporter injisert i ventrikkelen i en koronale snitt gjennom V-SVZ. De stiplede linjene indikerer grensene for V-SVZ. Merk at bare ependymal celler er infisert. (I - j) Immunofluorescence for GFP og ependymal cellemarkør S100β. Legg merke til tilstedeværelsen av en rekke dobbelt-positive celler langs rygg (i) og ventrale (j) V-SVZ. Arrowhead peker på en astrocyte i striatale parenchyma, også merket med S100β. k. Koronale snitt gjennom OB farget med DAPI (grå, til venstre) og immundeteksjon av GFP (greno; høyre) i omsluttet av den hvite firkanten 60 dager etter at en V-SVZ / striatum injeksjon region. Legg merke til en rekke merkede nevroner. (L) Koronale snitt gjennom OB farget med DAPI (grå, til venstre) og immundeteksjon av GFP (i grønt, høyre) region omsluttet av den hvite firkanten 45 dager etter at en lateral ventrikkel injeksjon. Legg merke til at det ikke er noen OB-neuroner merket. cx, cerebral cortex; lv, lateral ventrikkel; str, striatum; GL, glomerulær lag; GCL, granule celle laget; MCL, mitral celle laget. Skala barer: c, g = 500 mikrometer; d, e, hj = 10 mikrometer; KL = 250 mikrometer; 100 um.
Figur 3:. Voksen NSCs sprer mer aktivt når de blir løsrevet fra sin nisje (a) Confocal mikrografer av snitt gjennom V-SVZ av mus som fikk striatale injeksjoner av tomme LVS (øvre panel) eller LVS carrYing en dominant-negativ cadherin-konstruksjon (nedre panel), immunfarget for påvisning av LV reporteren GFP (grønt), NSC markør GFAP (rød), vil markøren cellesyklus Ki67 (cyan), og DAPI (blå) 60 dager etter infeksjoner. Uavhengige paneler for hver markør vises (grå, høyre). (B) Confocal mikrobilder av snitt gjennom V-SVZ fra mus som mottok injeksjoner av tomme LVS (øvre panel) eller LVS bærer en dominant-negativ cadherin-konstruksjon (nedre panel) i den laterale ventrikkel immunofarget for påvisning av LV reporter GFP (grønn), NSC markør GFAP (rød), markør cellesyklusen Ki67 (cyan), og DAPI (blå), 15 dager etter at infeksjoner. Uavhengige paneler for hver markør vises (grå, høyre). Hvite piler peker på GFAP / GFP doble positive celler og hvite pilspisser peke på GFAP / Ki67 / GFP trippel positive celler hvis kjerner i begge tilfeller er indikert med en gul stjerne. Kvantitativ analyse indikerte flere sykkel NSCs når N-cadherin nivåer ble redusert i de NSCs selv eller bare i ependymal celler 15. Scale: 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LVS gir viktige fordeler fremfor andre virussystemer for genmodifisering av voksen NSCs 16,18. Stereotaxic levering av lentiviruses til V-SVZ nisje representerer en effektiv metode for å merke og spore sjelden dele B1-NSCs vinne begrensninger av andre vanlig brukte metoder som BrdU, som er utvannet etter flere celledelinger, eller retrovirus, som bare målceller som formerer seg i øyeblikket av søknaden. LVS, sammen med adenovirus kan infisere cellene uavhengig av deres sykling status, og dette er spesielt relevant for celler som ikke syklus, slik som ependymal celler, eller er relativt stille, og dermed dele sjelden, som voksen NSCs 16,18. Transgener blir stabilt integrert og uttrykt med høy effektivitet tillater morfologisk karakterisering av transduserte celler og deres avkom.
NSC er næret i en svært spesialisert nisje med nabocelleneslike som ependymal eller vaskulære celler samt sin egen celle avkom og dermed skape et tett regulert miljø 2. Som mange foster NSCs, B1 celler ligge ved siden av ventrikkel og ventrikkelen kontakte sin væske gjennom små, apikale prosesser som ender opp i en enkelt ubevegelige primære cilium nedsenket i ventrikkel CSF 1 (figur 2a). Denne detaljerte organisasjon kan utnyttes til å spesifikt målrette ependymal celler eller alle celler i nisjen gjennom kontroll av viral titer og leveringsområde. Adherens og tett veikryss i polariserte epitel har vist seg å hindre oppføring av utenlandske virus i celler og vev, noen ganger på grunn av begrenset plasseringen av virus oppføring reseptorer (dvs. CAR reseptorer) i synaptiske komplekser. Forstyrrelse av intercellulær adhesjon favoriserer derfor infeksjon av forskjellige typer av virus, inkludert lentivirus (LV). Interessant, LVS har vist seg å forstyrre synaptiske komplekser når de brukesved høye konsentrasjoner i lungeepitelet 20-23. Dette kan forklare tidligere rapporter om infeksjoner av B1-NSCs av LVS injisert i den laterale ventrikkel 24.
Siden B1-NSCs produsere avkom som migrerer anteriort og dorsalt, kan GFP-positive celler som finnes på alle nivåer av RMS, så vel som i OB, og corpus callosum hvor de terminalt differensiere til neuroner og oligodendrocytter, respektivt. Men vi bruker ikke reporteren uttrykk for å fastslå effekten av genmodifiseringen på satsene for nevrogenese eller oligodendrogenesis. På den ene siden er corpus callosum i banen for nålen sporet, og derfor kan noen celler som synes merket være et resultat av en direkte infeksjon under injeksjonsprosessen. På den annen side, ettersom alle typer av celler i den V-SVZ kan bli smittet er det ikke mulig å skille mellom hvorvidt de merkede nevroner OB er et resultat av en genetisk endring i B1 celler eller deres progenitor derivater. I tilfellet med forsøk hvor bare ependyma er infisert, blir B1 celler og deres avkom ikke er merket med reporter og derfor neurogenesis eller oligodendrogenesis kan ikke spores. Imidlertid kan man dra nytte av BrdU retensjon for å analysere B1-NSC avhengig nevrogenesen til OB eller oligodendrogenesis til corpus callosum, så vel som den proliferative aktivitet av langsomt-delende NSCs i det V-SVZ av de infiserte mus. For eksempel kan mus injiseres med BrdU følgende tidligere publiserte protokoller 17 10 dager etter infeksjonen med LVS og tillates å overleve i 21 dager. BrdU deteksjon i OB / corpus callosum kan deretter brukes til å bestemme frekvensen av neurogenesis / oligodendrogenesis, mens BrdU oppbevaring i V-SVZ kan tas som et anslag på antall aktiverte B1-celler 13.
Fremgangsmåten beskrevet her kan anvendes for ekspresjon av gener som er av interesse for forsterkning-av-funksjon experiments, men kan også anvendes for levering av stanse-konstruksjoner basert på RNA-interferens eller for levering av ere rekombinase-konstruksjonene for å inaktivere bakterie linjer som overføres floxed alleler i de V-SVZ celler. I tillegg kan denne teknikken også benyttes for CRISPR-mediert genomet redigering hvis injeksjon av lentivirus-singel guide RNA brukes i kombinasjon med en Cre-avhengige Rosa26 Cas9 Knockin muse 25.
Kritisk trinn 1. Lentivirus produksjon og manipulasjon In vivo genoverføring applikasjoner med LVS i spesifikke hjerneområder krever høye titer vektorbehandling da bare svært små volumer kan injiseres stereotaksikalt uten å skade hjernevevet. Lentivirale preparater må bli renset og effektiv måte konsentrert før injeksjon i hjernen på grunn av det faktum at LVS genereres i forbigående ko-transfeksjon systemer. Prosedyren er beskrevet her er biosikkerhetsnivå 2, derfor alle prosedyrer somkrever manipulering av virus utføres i BSL2 anlegg. Forskning personell må være behørig kvalifisert og opplært i alle prosedyrer. I tillegg må kirurgi utføres av opplært etterforskere følgende rutiner godkjent av lokale myndigheter for dyrevelferd, og bør gjøres under aseptiske forhold med riktig steriliserte instrumenter i biosikkerhetsnivå 2 områder. Tilstrekkelig preoperativ og postoperativ behandling av dyr må utføres, og bør være i samsvar med etablerte veterinærmedisinske og sykepleie praksis. Mer spesifikt, må alle forholdsregler tas for å redusere smerte og stress påført dyret administrasjon av anestesi og analgesi. Hvert skritt når det gjelder bruk av virus hos dyr må godkjennes av de institusjonelle myndigheter og utføres i henhold til lokale bestemmelser. Personlig verneutstyr skal også brukes, blant annet en kjole, doble hansker og egnet øyebeskyttelse. Finalliert, må alle verktøy og overflater som kan ha vært i kontakt med virus dekontamineres grundig i henhold til de facility's godkjente desinfeksjonspraksis (ved å tørke med 70% etanol, 10% blekemiddel og / eller autoklave).
Vår erfaring er at kalsiumfosfat transfeksjon metode en svært effektiv og billig teknikk for innføring av DNA i 293T celler. Imidlertid kommersielle DNA-transfeksjon reagenser kan også brukes i henhold til produsentens protokoll i dette trinnet. Denne protokollen er optimalisert for oppsamling av den virale supernatanten ved 30 timer etter at media utskifting av 293T-celler. Lentiviral supernatant kan også samles 24 og 48 timer etter media erstatning. Men i vår erfaring en enkelt samling på 30 timer gir en høy titer lentivirus vektor.
Kritisk trinn 2: praktisk eksempel på beregning av vektoren titer ved hjelp av formelen:% GFP + / 100 x antall celler som er infisert x fortynning factor (DF) = transduse enheter (TU) / ml. I dette eksemplet blir 5 x 10 4 celler (293T) podet den foregående dag åpner for transduksjon av 10 5 celler. Etter å skaffe% av transduserte celler ved hjelp av flow-cytometri som beskrevet i protokollen, er to verdier av transduserte celler valgt for beregningene, de som svarer til de fortynninger ved hvilke transduksjon verken er mettet, eller for lavt. For eksempel: Fortynningsfaktor 10 -6 gi 8.08% celler infisert, og fortynning faktor 10 -5 gi en 61,78% celler infisert. Titeren er gjennomsnittet av verdiene gjengitt fra bruk av formelen ved hjelp av verdiene av de transduserte celler og den tilsvarende fortynningsfaktor. I dette eksempelet:
Titer for fortynningsfaktoren 10 -6 = (8,08 / 100) x 100 000 x 10 6 = 8.08 · 10 9 TU / ml
Titer for fortynningsfaktoren 10 -5 = (61,78 / 100) x 100 000 x 10 5= 6,178 · 10 9 TU / ml
Gjennomsnittlig = [(8,08 + 6,178) / 2] · 10 9 = 7,1 · 10 9 TU / ml
Kritisk trinn 3: stereotaxic injeksjon. Metoden som beskrives her er avhengig av bruk av lave volumer av høye titere av LVS stereotaksisk ledet levering til bestemte steder. Stereotaxic koordinater gitt i denne protokollen er etablert for C57 / BL6 mus, og kan ikke være egnet for andre musestammer. Stereotaksiske koordinater skal bestemmes for hver stamme og alder ved hjelp av et fargestoff som hurtig grønn før forsøket. For å gjøre dette, er fargestoff injiseres og etter mus er ofret, er hjernen ut og frosset for en hrat -20 ° C. Når hjernen er herdet, kan den skiver med et blad på injeksjonsstedet og observert under et disseksjonsmikroskop for å bestemme hvorvidt injeksjonsstedet er optimalisert for spesifikke eksperimentelle formål.
kritisk trinn4: post-overlevelse ganger. Post-overlevelsestider vil være forskjellig avhengig av injeksjonsstedet. En langsiktig overlevelse tiden tillater hjernevev å gjenopprette fra injeksjons lesjon og, enda viktigere, celler observert i RMS og OB etter 60 dager er derivater av den relative hvil B1-NSCs. Injeksjoner i den laterale ventrikkel ikke fysisk skade V-SVZ. Derfor er en 15 dagers periode nok til å sikre uttrykk for transgener ved ependymal celler.
Kritisk trinn 5: post-fiksering ganger. Overdreven etterfiksering av hjernevevet kan danne maskering av noen antigener, på grunn av tverrbindingsaktiviteten av de anvendte reagenser, som for eksempel paraformaldehyd. Disse er god til å bevare cellestrukturen, men kan redusere antigenisiteten av noen proteiner som tverrbindings kan hindre antistoff bindes til epitoper. Antigen henteteknikker kan være nødvendig, spesielt hvis det er en lang inkubasjonstid fiksering, eller hvis en høy prosentandel av kryssbindings fixative er brukt. Alternativt har kortere perioder med post-fiksering av en time viste seg å være tilstrekkelig i vår erfaring for å opprettholde strukturen av vev, så vel som å sikre en god antigenisitet i cellene uten anvendelse av antigenet Hente prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle manipulasjoner ble gjort i et biosikkerhetsnivå 2 rom. Animal protokoller ble godkjent av etisk komité ved University of Valencia og var alle i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU.
Acknowledgments
Vi erkjenner hjelp av MJ Palop og teknisk support av SCSIE av Universidad de Valencia. Vi takker også Antonia Follenzi for nyttige kommentarer og diskusjon av manuskriptet. IF er støttet av Fundación Botin, av Banco Santander gjennom Santander universiteter global divisjon, og med tilskudd fra Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP, og ISIC) og Ministerio de Economia y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED og Retic- Tercel) . Dette arbeidet ble også støttet av BFU2010-21823 og Retic- Tercel tilskudd fra MINECO og European Research Council (ERC) 2012-StG (260511- PD-HUMMODEL) til AC BM-P. er mottaker av en spansk FPI fellesskap av MINECO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25 mm x 89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13 mm x 51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100 x 20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12 mm x 75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2x HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dH |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | http://www.leicabiosystems.com/ |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33 gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11 cm x 21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25 G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
References
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
- Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
- Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
- Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
- Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
- Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow! Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
- Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
- Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
- Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
- Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
- Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
- Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
- Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
- Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
- Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
- Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
