Stabil och effektiv genetisk modifiering av celler i vuxen mus V-SVZ för analys av neurala stamceller autonoma och icke-självständiga effekter

Abstract

Relativt vilande somatiska stamceller stödja livslång cellförnyelse i de flesta vuxna vävnader. Neurala stamceller i den vuxna däggdjurshjärnan är begränsade till två specifika neurogena nischer: den subgranular zonen av gyrus dentatus i hippocampus och den ventrikulära-subventrikulära zonen (V-SVZ; även kallad subependymalt zon eller SEZ) i väggarna i den laterala ventriklarna. Utvecklingen av genöverföring in vivo strategier för vuxna stamceller (dvs. de av däggdjurshjärnan) resulterar i långtids uttryck av önskade transgener i stamcellerna och deras härledda avkomma är ett viktigt verktyg i nuvarande biomedicinsk och bioteknisk forskning. Här, är ett direkt in vivo-metod som presenteras för den stabila genetisk modifiering av vuxen mus V-SVZ celler som drar nytta av den cellcykeloberoende infektion genom LVs och mycket specialiserad cytoarchitecture för V-SVZ nisch. Specifikt, det nuvarande protokollet innebärs injektion av tomma LVs (kontroll) eller LVs kodar specifika transgena expressionskassetter i antingen V-SVZ självt, för målsökning av alla typer av celler i den nisch in vivo, eller in i de laterala lumen ventrikeln, för målsökning av ependymala celler endast. Expressionskassetter sedan integreras i genomet hos de transducerade cellerna och fluorescerande proteiner, även kodas av LVS, tillåter detektion av de transducerade cellerna för analys av cell autonoma och icke-självständiga, nischberoende effekter i de märkta cellerna och deras avkomma.

Introduction

Den murina ventrikulär-subventrikulära zonen (V-SVZ), i väggarna i den laterala ventrikeln som vetter striatum, är en mycket aktiv germinal region där en kontinuerlig process av progenitorcell replikering och differentieringsresulterar i ihållande produktion av luktloben (OB ) interneuronen och corpus callosum oligodendrocyter ^1. Livslångt generationen av dessa celler förefaller stödjas av närvaron i denna region av neurala stamceller (NSCs, även kallade B1 celler), som uttrycker astrocytisk antigen gliafibrillärt surt protein (GFAP) och stamcellsmarkörer såsom nestin, Id1 och Sox2 ^2. GFAP-uttryckande B1 celler genererar transit förstärka stamfader (TAP) celler (C-celler), som uttrycker transkriptionsfaktorer Dlx2 (distal mindre homeobox 2) och Ascl1 (däggdjur achaete-schute homolog 1) och dela snabbt några gånger innan de ger upphov att migrera neuroblaster (A-celler) eller oligodendroblasts ^3. Nyligen genererade prolifrativa neuroblaster migrerar anteriort, bildar rostrala migrationsbanan (RMS) till OB, där de integreras i det granulära och glomerulära lager som differentierade hämmande intern. Migrera unga oligodendroblasts flytta till CC, där de blir omogna NG2-positiva celler som fortsätter att dela lokalt eller differentiera till mogna myeliniserande oligodendrocyter ^1,4.

B1 celler, som härrör från fetala radiella gliaceller, behålla den långsträckta och polarise morfologi av sina föregångare och uppvisar en högt specialiserad relation med sin nisch. De spänner mellan ependymceller som ställer upp kammaren och nätverket av blodkärl som vattna V-SVZ nisch. Den lilla apikala process av B1 celler interkalerar bland multiciliated ependymocytes och slutar i en enda icke-rörliga primär cilium, medan deras basala process sträcker sig långa sträckor för att närma sig den plana vaskulära plexus som bevattnar denna nisch slutar i BAsal lamina av plexus kapillärerna ^2,5-8.

Det säkraste sättet att skilja B1-NSCs från icke-neurogen astrocyter, som också GFAP ^+, i den intakta V-SVZ nisch är baserad på hela montering beredningar av ventrikeln sidovägg och deras analys av 3-D konfokalmikroskopi efter immunfärgning för GFAP för att märka den tunna B1-NSC apikala process, β-catenin att avgränsa cellmembran, och antingen γ-tubulin som en markör för cilial basala organ eller acetylerad α-tubulin för att märka utsträckningen av alla cilie ^5,8. Observationer av dessa hel-fästen från kammarytan har indikerat att B1 och ependymala celler är arrangerade i "vindsnurror" ^5, i vilka uniciliated apikala processer en eller flera GFAP ⁺ B1 celler omgivna av en rosett av multiciliated ependymala celler.

Den karakteristiska morfologi B1 celler korrelerar med experimentella bevis indicating att blodkärl / endotelceller och ventrikulära cerebrospinalvätskan (CSF) utgör reglerade källor av lösliga signaler som verkar på NSCs ^2,6,9-11. Vid ventrikulära ytan, homotypisk och hetero apico-lateral interaktioner mellan ependymala och B1 celler inkluderar tight junctions och zonula adhaerens ^5,12. Dessutom adhesionsmolekyler som är inblandade i de junctionala komplex mellan B1 och ependymala celler, såsom N-cadherin och V-CAM, har visat att reglera inte bara den mycket organiserad positionering av B1 i V-SVZ nisch, men också deras quiescence ^{12 13.} Det ependymala-B1 cellmonoskiktet tycks verka som en diffusionsbarriär som tillåter den reglerade flödet av vatten och små molekyler från CSF, men begränsar den intercellulära passagen av stora proteiner ^10,11. Experimentella bevis indikerar att en unik position B1 cell apikala cilium skulle kunna spela en roll som en sensor av signalering polypeptider förekommer i cerebrospinalvätskan ^2,5-7. Ependymala celler är i sig också en källa av lösliga och membranbundna signaler med en roll i regleringen av NSC beteende ^14,15.

Spårbara nukleosider, såsom brom-deoxiuridin (BrdU) eller retrovirus har använts i stor utsträckning för att märka progenitorceller, inklusive NSCs, in vivo. Men dessa metoder inte är optimala för långsiktig öde spårning eftersom BrdU signaler späd genom upprepade celldelningar och retrovirus verkar företrädesvis rikta gående förstärkning celler på grund av deras krav på celltillväxt för transduktion ^16,17. För att undersöka NSC fysiologi in vivo, inklusive interaktion med nischkomponenter, är det viktigt att fastställa en metod för att märka och spåra sällan delande celler, som B1-NSCs är i stort sett stilla och deras grann ependymala celler delar aldrig under fysiologiska förhållanden ^3. Här visar vi att lentivirala vektorer (LVs) möjliggöra högeffektiv gen märkeing och långsiktig modifiering av vuxna NSCs och icke-delande ependymala celler, på grund mest rimligt att deras förmåga att transducera och att integrera in i genomet hos målceller i en cellcykeloberoende sätt. Dessutom visar vi hur rutten för leverans och virustiter hjälp att specifikt transducera ependymala celler, men inte B1 celler vilket möjliggör analysen av nischberoende, ependymala effekter på NSCs.

Protocol

ETIK ANALYS: Detta protokoll följer riktlinjerna för djurskötsel vid universitetet i Valencia i enlighet med EU-direktiv 2010/63 / EU.

1. Framställning av LV för in vivo-märkning studier (se figur 1a)

VARNING: Det förfarande som beskrivs häri är skyddsnivå 2, därför utföra alla följande procedurer i en biologiskt huva. Se till att forskningspersonalen är lämpliga kvalifikationer och utbildning i alla förfaranden. Använd personlig skyddsutrustning, inklusive klänning, dubbla handskar och skyddsglasögon. Slutligen, noggrant sanera alla verktyg och ytor som kunde ha varit i kontakt med virus enligt godkänd anläggning desinfektion metoder (genom att torka med 70% etanol, 10% blekmedel och / eller autoklavering).

1. Produktion av LV i humana embryonjur 293T Cells
   1. Starta detta protokoll genom att förbereda rena DNA för transfektion. Förbered och rena varje plasmid genom att dubbel CsCl gradient centrifugering eller andra kommersiellt tillgängliga kolonnmetoder som ger endotoxin-fritt DNA. I detta protokoll har vi använt överförings vektorplasmiden pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Rekommenderade kärn förpackningar plasmider är pMDLg / pRRE och pRSV.REV och kuvert plasmid pMD2G ^13,18,19.
   2. Tjugofyra h före transfektion, plattan 5 x 10 ⁶ 293T celler i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) (se tabell of Materials) i en 10 cm plastskål för att erhålla en ca 04/01 till 03/01 konfluent kultur för transfektion. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator i en atmosfär av _5-7% CO2.
   3. Ersätta mediet med färskt medium 2 h före transfektion.
   4. I ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör mix 10 pg av transfervektor plasmid (innehållande cDNA av transgenen eller shRNA som skall levereras) med 2,5 | ig av pRSV.REV och 5 | j, g av de pMDLg / pRRE förpacknings plasmider, och 3,5 & #181; g av kuvertet plasmiden pMD2G. Make up plasmiden lösning till en slutlig volym av 450 | il med 0,1 x TE-buffert (se tabell of Materials) / dH ₂ 0 (2: 1). Tillsätt sedan 50 ^ il av 2,5 M _CaCl2.
   5. Bilda fällningen genom droppvis tillsats av 500 | il av 2x HEPES-buffrad saltlösning (HBS, se tabell of Materials) lösning på 500 | j, l _DNA-TE-CaCl2 blandningen under virvling med full hastighet.
   6. Lägg fällningen till de 293T-celler omedelbart. Snurra försiktigt plattan för att blanda. Återgå cellerna till inkubatorn och ändra mediet 14-16 h efter transfektion.
   7. Samla cellsupernatanter 30 timmar efter att ha bytt media. Filtrera supernatanten genom ett 0,22 um por nitrocellulosafilter och vidare till koncentration.
2. Koncentration av LVs
   1. Koncentrera konditionerade mediet genom ultracentrifugering vid 50.000 xg (19.000 rpm med SW-28 ultracentrifugrotor) för tvåh vid rumstemperatur (RT) i en 30 ml polypropylen transparent koniska rotorröret.
      Obs: Använd ultracentrifugen adaptrar för koniska rotorrören (se tabell of Materials).
   2. Kassera supernatanterna genom dekantering och resuspendera pelletarna i en liten volym (200 | il eller mindre om endast en centrifugering utförs) av fosfatbuffrad saltlösning (PBS; se tabell of Materials). pipett sedan upp och ner ungefär 20 gånger.
   3. Pool suspension och koncentrera igen genom ultracentrifugering, även vid 50.000 x g (23.000 rpm med SW-55 ultracentrifug rötor) under 2 h vid rumstemperatur. Använd polypropen transparenta rotor rör med en nominell volym på 5 ml (se tabell of Materials).
   4. Resuspendera slutliga pelleten i en mycket liten volym (1/500 eller 1/1000 av utgångs volym av medium) i steril PBS och skaka på ett roterande hjul under 1 h vid RT. Uppdelad i små portioner (5-20 ul) och freeze dem vid -80 ° C.
   5. Behandla alla tomma rör med 10% blekmedel före kassering.
3. Lentiviral Titrering med användning av flödescytometri
   1. Dagen innan, platta 5 x 10 ⁴ HeLa-celler per brunn i 6-brunnsvävnadsodlingsplattor i två ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) (se tabell of Materials). Inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator i en atmosfär av _5-7% CO2 under 24 timmar.
   2. På dagen för titrering, tina en alikvot av det virala lager och förbereda serieutspädningar, från 10 ^-3 till 10 ^-8, i DMEM.
      1. För att göra detta, ta en 24-brunnar och tillsätt 2 ml DMEM till den första brunnen och 1,8 ml till följande brunnarna. Sedan lägga till den första brunnen 2 | il av den koncentrerade virala lager (till en slutlig spädning av 1: 1000 eller 10 ^-3).
      2. Efter pipettering flera gånger för att blanda lösningen, förändring spets och överföra 200 ul av 10 ^-3 utspädningtill den andra brunnen. Upprepa proceduren serie i följande brunnar tills 10 ^-8 utspädning görs.
   3. Ta HeLa-celler pläterade föregående dag från inkubatorn. Försiktigt bort mediet från brunnarna. Tillsätt 1 ml av varje virusspädning tillsammans med 1 | il 8 mg / ml hexadimetrinbromid till HeLa-cellinnehållande brunnarna. Snurra försiktigt plattan för att blanda.
      Obs: hexadimetrinbromid sätts för att öka virus adsorption till cellerna i kultur.
   4. Återgå cellerna till inkubatorn och låta infektionen fortskrida under 72 h. Efter det, avlägsna mediet, tvätta cellerna en gång med PBS och tillsätt 200 pl av trypsin-EDTA (se tabell of Materials) till varje brunn.
   5. Efter 5 minuter vid 37 ° C, tillsätt 2 ml PBS till varje brunn och skörd celler i flödescytometri rör.
   6. Centrifugera vid 300 x g under 5 min vid RT och aspirera supernatanten.
   7. Resuspendera pelleten med 1 ml av fäst solutipå (1% formaldehyd elektronmikroskopi grad och 2% fetalt bovint serum i PBS), sedan virvel rören.
   8. Analysera celler i en flödescytometer med användning av en 488 nm argon-ionlaser vid 15 mW ström.
   9. Ställ upp instrumentet med standardkonfigurationen: framåtspridning (FS), sidospridning (SS), och fluorescens för GFP (525/40 nm). Markera cell population grind i en FS vs. SS-plotten att utesluta cellaggregat och skräp. Samla fluorescens i logaritmisk skala. Beräkna antalet ^GFP + celler i varje prov.
   10. Beräkna vektorn titer med användning av följande formel:% ^GFP + / 100 x antal celler infekterade x utspädningsfaktor (DF) = transducerande enheter (TU) / ml.

Figur 1: Schematisk representation av de olika delarna av det förfarande (a) Del 1 av t.han protokoll: generering av LVs för in vivo-studier märkning, från transfektionen av HEK293T celler med lämpliga plasmider för att generera de LVs till bestämningen av virustiter genom flödescytometri med användning den indikerade formeln. Namnen på de plasmider och de centrifugrotorer är indikerade. (B och c) Del 2 i protokollet: stereotaxic injektion av LVs. "B" visar ett exempel på en Nonieskala, en enhet som är en del av stereotaktiska instrument och tjänar för fina mätningar. Som ett exempel, pilarna indikerar 4.23 cm. En Nonieskala används för att bestämma koordinaterna i antero-posterior (AP), medio-laterala (ML), och dorso-ventrala (DV) -axeln så som visas för en topp-vy (vänster) och för en sagittal sektion (höger ) av hjärnan. "C" anger positionen för bregma som skärningspunkten mellan de sagittala och koronala suturer. LVs injiceras med hjälp av en spruta. (D) Schematisk ritningar visar hur hjärnan is bearbetas för analys. De två halvkloten är delade och var och en är uppdelad i två block. Block "a", som innehåller OBS, produceras av en coronal snitt på AP-nivå omedelbart posteriort OB korsningen med telencephalon (bregma 2,46 mm, se Paxinos' Atlas för en referens). Block "b" är producerad av två koronala snitt, en vid nivån precis främre till den mest rostrala aspekten av corpus callosum (bregma 1,7 mm) och en andra en i nivå med föreningspunkten av de två laterala ventriklarna (bregma -0,22 mm). GL, glomerulär lager; GCL, granulat cellskiktet; st, striatum; cc, corpus callosum; ac, tvärförbindelser i hjärnan; lv, laterala ventrikeln.

2. Stereotaxic Injektion av LV in i V-SVZ / Striatum gränsar eller in den laterala ventrikeln (se figur 1b)

1. Förberedelse
   1. Sterilisera en spruta 5 | il kapacitet med en 33 gauge nål genom sprutning ner kroppen och nålen med 70% etanol med kolvendrog ut hela vägen. Upprepade gånger aspirera etanol från en 1,5 ml mikrocentrifugrör och mata ut det hela vägen ut flera gånger, och skölj sprutan noggrant med sterilt vatten efteråt. Placera sprutan säkert undan i odling huva och låt den torka.
   2. Förbered en biologiskt avfallsbehållare med 10% blekmedel till en lämplig volym för nedsänkning av allt avfall från detta förfarande (i allmänhet 200 ml i en 500 ml behållare).
   3. Förbered och förvärma en 37 ° C vattensäng genom att fylla en förslutningsbar plastpåse med vatten och värmer det till 37 ° C. Detta gör det möjligt för möss att återhämta sig efter injektionen.
   4. Ta virala lager från -80 ° C frysförvaring en timme innan injektionerna och placera flaskan på en roterande hjul vid RT. Efter upptining, bibehålla viral lager på is under tiden för injektionerna. Före stereotaxic injektion av LV, späd koncentrerade virala lager till 10 ⁶ TU / l med användning av PBS i kulturen huva.
   5. Sanera området ut för att utföra operationen med 70% etanol.
2. Mikroinjektion av LV
   1. Välj och sterilisera verktyg som behövs för kirurgi (skalpell, borra, och små pincett).
   2. Söva en 6-8 veckor gammal mus genom intraperitoneal (ip) injicera en veterinär övervakad blandning av ketamin och medetomidin. Väg varje djur och dos vardera 50-75 mg ketamin och 0,5-1 mg medetomidin per kg mus kroppsvikt (cirka 100-125 mikroliter av ketamin / medetomidin arbetslösning per mus).
   3. Utvärdera anestesi plan genom att klämma tårna, svans eller örat och se till att djuret visar ingen reaktion.
   4. När musen är sövda, injicera butorfanol subkutant vid en slutlig dos av 0,4-0,5 mg per kg mus vikt för att minimera postoperativ smärta.
   5. Raka området mellan öronen och desinficera huden med användning av en jodofor såsom iodopovidone eller 70% etanol. Rengöra med hjälp av steril bomulls-tipped applikatorer. Var noga med att inte överdrivet väta djur eftersom det kan förvärra hypotermi.
   6. Placera djuret i liggande position på en stereotaxisk ram och noggrant fixera huvudet med användning av de öron barer och gommen stöd för anordningen. Håll musen med en värmedyna inställd på 37 ° C och tillämpa oftalmologiska smörjmedel för ögonen.
   7. Gör en 1 cm långt snitt på skinnet på huvudet i längdled med hjälp av en skalpell, och försiktigt dra tillbaka huden för att exponera skallen med fin pincett.
   8. Rengör försiktigt benytan med en steril bomullspinne. Tvätta den utsatta benet av eventuell kvarvarande vävnad.
   9. Montera steriliserade sprutan på den stereotaktiska enheten med hjälp av spruthållaren.
   10. Flytta spruthållaren x-, y- och z-axeln tills spetsen på sprutans nål är placerad på bregma, konjunktionen punkt där sagittala (longitudinell och medial) sutur vinkelrätt korsas av coronal sutur (Figure 1b). Se till att "noll" position dorso-ventrala (DV) axeln är på skallen ytan på bregma.
   11. Flytta sprutan till x och y destination koordinater (se tabell 1 och Figur 1b).

Region injektion	koordinater
	Antero-posterior (AP)	Medio-lateral (ML)	Dorso-ventrala (DV)
SEZ / striatum gränsen	+0,6 mm	+1,2 mm	-3.0 mm
laterala ventrikeln	-0.3 mm	+1,0 mm	-2.6 mm

Tabell 1: stereotaxic koordinater för injections. För AP och ML-axeln, x- och y-koordinater ges som ett avstånd (i mm) från bregma. "-" Indikerar "mot bakre". För DV koordinater "noll" är ytan av skallen vid bregma punkten och DV koordinater anger avståndet (i mm) ned från denna punkt.

12. Kommentera x, y och z destination koordinater i Vernier skala för att kunna komma tillbaka till injektionsstället senare. Markera benet på x- och y-koordinater med hjälp av en kirurgisk tuschpenna.
13. Flytta sprutan bort från arbetsområdet.
14. Med användning av en elektrisk borrmaskin göra ett hål på skallen noga med att inte skada hjärnan. Borra inte pial yta eftersom det kan skada hjärnans yta.
15. Fyll sprutan med 1 pl av 10 ⁶ TU / ul viruslösning. Använd en 33 gauge vass fasade nål vars spets har en vinkel av 10-12 °. Positionera sprutnål vid en 90 ° angle med avseende på hjärnans yta.
16. Flytta sprutan tillbaka till platsen för injektionen och flytta den ner tills spetsen vidrör pial ytan.
17. Penetrera hjärnan med sprutan till z-koordinaten i DV-axeln.
18. Långsamt frisätta det virala suspensionen, vid en hastighet av 0,2 | j, l / min, för att minimera skador på hjärnvävnad på grund av alltför vätsketryck.
19. Vänta på 5-10 min för att minimera återflöde av viral suspension och sedan dra tillbaka sprutan mycket långsamt. Blot eventuellt överskott av vätska som kan förekomma vid ytan som ett resultat av tillbakadragandet av sprutan med användning av en laboratorie torka och placera den omedelbart i blekmedelsinnehållande biosäkerhet avfallsbehållare.
20. Ta djuret ur stereotaxic uppsättningen, placera den på en varm dynan och stäng såret med hjälp av hud lim. Omvänd sedering med hjälp av 0,1 till 1,0 mg / kg kroppsvikt atipamezol.
21. Injicera Bupenorphrine subkutant i en slutlig dos av 0,1 mg per kg mus vikt varje 12 timmar,med start 4 h efter administreringen av den kortvariga Butorfanol analgetikum.
22. Placera djuret i en individualiserad bur med en varm pad och noga övervaka tills musen återhämtar sig från anestesi. Placera en påse hydrogel i buren för att hjälpa djuret hydrat efter återhämtning.
23. Avyttra all biologiskt förorenat avfall i avfalls flytande blekmedel biologiskt. Rengör sprutan genom aspiration och utstötning av etanol och skölj med vatten. Desinfektera området, stereotaxic set och det kirurgiska material som har använts med blekmedel och 70% etanol.
24. Håll injicerade möss isolerade i skyddsnivå 2 rum för 24-48 timmar varefter de kan överföras till en vanlig bostad anläggning

3. Histologisk analys

1. Perfusion, vävnadsuppsamlings, och sektionering
   1. Djupt söva möss med användning av en veterinär övervakad blandning av medetomidin och ketamin (bedöma anestesi plan genom att klämma toes, svans eller öra), som beskrivits tidigare.
   2. Transkardiellt BEGJUTA mössen med 25 ml koksaltlösning, följt av 75 ml av 4% PFA i PB i samma takt ^17.
   3. Extrahera hjärnan och post-fixa det genom att sänka ner den i minst 10 gånger dess volym av kall 4% PFA i PB under 1-16 h (ökade efter fixering gånger kan minska immunreaktiviteten hos vissa antigener). Tvätta noggrant återstående PFA med PB.
   4. Skär hjärnan efter indikationer på figur 1d och limma den resulterande blocket till innehavaren av en vibratome med hjälp av cyanoakrylat.
   5. Samla 30 um tjocka serie koronala sektioner med hjälp av en vibratome. Förvara hjärnan skivor i 24-multibrunnplattor med PB vid 4 ° C. För att förhindra förorening, kan 0,05% natriumazid tillsättas till PB-lösning.
2. immunohistokemi
   1. Inkubera fritt flytande sektioner i blockeringsbuffert (PB med 0,05% natriumazid, 1% glycin, 5% normalt getserum och 0,1% Tritpå X-100) under 1 h vid RT under försiktig skakning i en gungande plattform.
   2. Försiktigt bort blockeringsbufferten med en pipett, tillsätt en lämplig utspädning av anti-GFP kanin primär antikropp (se tabell av material) i blockerande buffert och inkubera vävnad med denna utspädning under 48 timmar vid 4 ° C med försiktig skakning.
   3. Tvätta bort den primära antikroppslösningen minst 3 gånger med PB, en tvätt var 10 min.
   4. Inkubera fritt flytande sektioner med en lämplig utspädning av fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar) i blockeringslösning (se Tabell över Materials) under 1 h vid RT och försiktig skakning. Skydda delarna från direkt ljus under inkubation.
   5. Tvätta bort den sekundära antikroppslösningen med PB, 3 gånger en gång varje 10 min, och Motfärga vävnaden genom att inkubera sektionerna med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) vid 1 mg / ml i vatten under 5 min. Tvätta DAPI lösningen genom att skölja två gånger och snabbt with vatten.
   6. Placera försiktigt sektionerna på ett objektglas med hjälp av en fin pensel. Häll några droppar monteringsmedium för fluorescerande preparat (se tabell av material) över vävnaden och försiktigt placera en täck på toppen, kontrollera att monteringslösningen korrekt fördelad över hela ytan och det finns inga bubblor. pressa försiktigt ner täck att dränera överskottet av monteringsmedium.
   7. När monterings lösningen torkar ut (2-16 tim), analysera provet genom konfokal laserscanningsmikroskopi med 488 nm laser.

Representative Results

LV-medierad gen leveranssystem kan användas för att på lång sikt in vivo transduktion av celler i vuxen mus V-SVZ, vilket gör att deras spårning och genetisk modifiering under proliferation, migration och differentiering. Infektionen och uttrycket är mycket effektiva och ger ett stort antal celler som lätt kan urskiljas bland andra icke-infekterade celler genom uttryck av reportern ingår. Hittills har vi visualiserat transducerade celler med GFP fluorescerande reportrar, som drivs av den ubiquitously uttryckt fosfoglyceratkinas-promotor, men andra reportrar eller protein taggar kan också användas. Vi använder rutinmässigt antikroppar mot GFP i stället för att förlita sig på direkt detektering av emissions reporter som det ger en starkare fluorescenssignal. Vidare kan hjärnorna dissekeras färska och nedsänktes i fixativ men mycket bättre resultat erhålls genom transcardial perfusion.

Renat, koncentrerade vektorlager sakta injected enligt stereotaxisk vägledning in i V-SVZ vid sin gräns med striatum (figurerna 2a, b). Två månader efter injektion, var många GFP ^{+ celler} som finns i V-SVZ och i en ungefärlig 1 mm radie från injektionsstället (figurerna 2a, b). Infektion med LVS resulterar i transduktion av alla typer av celler i den V-SVZ och uttryck av reporter genom ependymala celler indikerar att LVs även effektivt kan rikta icke-delande celler (figur 2c, se även ^15). GFP-märkning mönster i V-SVZ var liknande den som finns efter 2 veckor ^18. Inga tecken på vävnadsreaktion, var emellertid detekterbart vid 2 månader efter injektion eftersom den långa perioden tillåter återvinning av vävnad från den skada som orsakats av operationen. Under två månader, infekterade TAP celler utvecklas till A-neuroblaster som vandrar ut zonen mot OB. Eftersom denna process tar bara några dagar ^3, närvaron av GFP⁺ Neuroblaster i RMS 60 dagar efter infektionen indikerar att LVs även rikta neurogen B1-NSCs (figur 2d). Transduktion av B1, C och A-celler vid tidpunkten för injektion ger ^GFP + interneuronen i OB (figur 2e).

Injektion av en liten volym av hög titer koncentrerad LV lagren i de laterala resultaten ventrikeln i infektionen av ependymocytes endast (figurer 2f-h). De flesta ependymala celler, som innehåller kalciumbindande protein S100β, uttrycka reportern efter bara 15 dagar från infektion (figur 2i). I motsats till den injektion i V-SVZ / striatal gränsen ades inga ^GFP + celler som observerats subependymally beläget eller i RMS eller OB som använder detta förfarande (fig 2h, j). Båda typerna av infektioner kan analyseras i avsnitt genom V-SVZ som förklaras. De kan också analyseras i sin helhet monterade beredningar av sidoventilationsricle vägg (se protokoll ^8).

Nyligen har vi beskrivit hur N-cadherin medierad cell-cell-adhesion av B1 celler till ependymocytes reglerar deras viloläge. Vi har använt det förfarande som beskrivs här för att leverera LVs bär cadherin dominerande-negativa konstruktioner som resulterade i inaktivering av N-cadherin. Vi har visat att förlusten av N-cadherin i de NSCs och ependymala celler eller i ependymala celler endast främjat en ökning i antalet och cellcykel inmatning av NSCs som ett resultat av störningar av homotypiska cell-cell-interaktioner (figurerna 3a, b; se ^15).

Figur 2: Reporter detektion genom immunofluorescens i sektioner av injicerade möss (a) Schematisk representation av den vuxna sub-ventrikulära zonen nisch.. En förenkling av den cellulära COMPONENts av nisch avbildas. B1 celler polariseras och uppvisa en specialiserad relation med den nisch. De spänner mellan ependymceller som ställer upp kammaren och nätverket av blodkärl som vattna V-SVZ nisch. Den lilla apikala process för B1 celler interkalerar bland multiciliated ependymocytes och slutar i en enda icke-motila primära cilium, medan deras basala process sträcker att närma sig den plana vaskulär plexus som bevattnar denna nisch som slutar i den basala lamina av plexus kapillärer. B1 cellderivat är mellan stamceller som aktivt föröka sig i omgivningen av blodkärl och migrerar kedjor neuroblaster mot lukt lökar i kontakt med nisch astrocyter. (B) Schematisk bild av en koronalt snitt genom ett halvklotet visar graden av injektionen och läget för injektionsnålen för injektion på V-SVZ / striatum gränsen. (C) mikroskop tas på samma nivå som visas i den schematiska stasökte med DAPI (grå, till vänster) och för immundetektering av GFP (grön, höger) 60 dagar efter injektionen. De streckade linjerna anger gränserna för corpus callosum. (D) Högre förstoring av en immunofluorescerande detektion av GFP reporter injiceras i V-SVZ närheten eller striatum gränsen i en koronal sektion genom V-SVZ. De streckade linjerna anger gränserna för V-SVZ. Observera att många celler infekteras i V-SVZ nisch. Ependymala celler kan kännas igen som kuboidala celler som begränsar kammaren lumen. (E) Immunofluorescens för GFP (grönt) och neuroblast markören PSZ-NCAM (röd). Notera förekomsten av dubbelt positiva celler, vilket indikerar bildandet av neuroblaster från NSCs som var infekterade 60 dagar innan. Vita pilspetsar pekar på neuroblaster. Inläggningar motsvarar regionen innesluten i den vita kvadraten. (F) Schematisk bild av en koronalt snitt genom ett halvklotet visar graden av injektion och läget förinjektionsnålen för injektion i den laterala ventrikeln. (G) mikroskop tas på samma nivå som visas i den schematiska färgas med DAPI (i grått, vänster) och för immundetektering av GFP (i grönt, höger) 15 dagar efter injektionen. De streckade linjerna anger gränserna för corpus callosum. (H) Högre förstoring av en immunofluorescerande detektion av GFP reporter injiceras i ventrikeln i ett koronalt snitt genom V-SVZ. De streckade linjerna anger gränserna för V-SVZ. Observera att endast ependymala celler infekteras. (I - j) Immunofluorescens för GFP och det ependymala cellmarkör S100β. Observera närvaron av ett stort antal dubbelt positiva celler längs ryggens (i) och ventrala (j) V-SVZ. Pilspets pekar på ett astrocyternas i striatum parenkymet, även märkt med S100β. k. Coronal snitt genom OB färgas med DAPI (grå, till vänster) och immundetektion av GFP (gresv; höger) i regionen som omges av den vita kvadraten 60 dagar efter en V-SVZ / striatum injektion. Lägg märke till många märkta nervceller. (L) Coronal snitt genom OB färgas med DAPI (grå, till vänster) och immundetektion av GFP (i grönt, höger) region som omges av den vita kvadraten 45 dagar efter en lateral injektion ventrikeln. Lägg märke till att det inte finns några OB neuroner märkta. cx, cerebral cortex; lv, laterala ventrikeln; str, striatum; GL, glomerulär lager; GCL, granulat cellskiktet; MCL, mitral cellager. Skalstrecken: C, G = 500 pm; d, e, hj = 10 ^ m; KL = 250 pm; 100 | j, m.

Figur 3:. Vuxen NSCs föröka mer aktivt när de lossnar från sin nisch (a) Confocal mikrofotografier av sektioner genom V-SVZ hos möss som fick striatala injektioner av tomma LVs (övre panelen) eller LVs Carrying en dominant-negativ cadherin konstruktion (nedre panelen), immun för detektion av LV reporter GFP (grön), NSC markör GFAP (röd), cellcykeln markören Ki67 (cyan) och DAPI (blå) 60 dagar efter infektionerna. Oberoende paneler för varje markör visas (grå, höger). (B) Confocal mikrofotografier av sektioner genom den V-SVZ av möss som fick injektioner av tomma LVs (övre panel) eller LVs som bär en dominant-negativ cadherin-konstruktionen (nedre panelen) in i den laterala ventrikeln immunostained för detektion av LV reporter GFP (grön), NSC markör GFAP (röd), cellcykeln markören Ki67 (cyan) och DAPI (blå), 15 dagar efter infektioner. Oberoende paneler för varje markör visas (grå, höger). Vita pilar pekar mot GFAP / GFP dubbelpositiva celler och vita pilspetsar pekar på GFAP / Ki67 / GFP trippel positiva celler vars kärnor i båda fallen indikeras med ett gult asterisk. Kvantitativ analys visade fler cykel NSCs när N-cadHerin nivåer minskade i NSCs själva eller bara i ependymalceller ^15. Skala: 10 | j, m.

Discussion

LVs erbjuder viktiga fördelar jämfört med andra virala system för genetisk modifiering av vuxna NSCs ^16,18. Stereotaktisk leverans av lentivirus till V-SVZ nisch representerar en effektiv metod för att märka och spåra sällan dela B1-NSCs övervinna begränsningarna i andra vanligen använda metoder såsom BrdU, som späds efter flera celldelningar, eller retrovirus, som bara målceller som breder vid tidpunkten för ansökan. LVs, tillsammans med adenovirus kan infektera celler oberoende av deras cykelstatus och det är särskilt relevant för celler som inte cykel, såsom ependymala celler, eller är relativt lugn, och på så sätt dela sällan, liksom vuxna NSCs ^16,18. De transgener blir stabilt integrerat och uttryckt med hög effektivitet tillåter morfologiska karakterisering av omvandlade celler och deras avkomma.

NSCs är hyste i en högt specialiserad nisch med angränsande cellersådana som ependymala eller vaskulära celler samt deras egen cell avkomma vilket skapar en hårt reglerad miljö ^2. Liksom många foster NSCs, B1 celler ligger intill kammaren och kammaren kontakta sin vätska genom små, apikala processer som hamnar i en enda icke-rörliga primär cilium nedsänkt i den ventrikulära CSF ^ett (figur 2a). Denna detaljerade organisation kan utnyttjas för att specifikt rikta ependymala celler eller alla celler i nischen genom kontroll av den virala titern och leveransområde. Adherens och tight junctions i polariserade epitel har visats hindra införsel av främmande virus i celler och vävnader, ibland på grund av den begränsade platsen för viralt inträde receptorer (te.x. bil receptorer) i Junktional komplex. Avbrott i intercellulär vidhäftning gynnar därför infektion av olika typer av virus, inklusive lentivirus (LV). Intressant nog har LVs visat sig störa Junktional komplex när de användsvid höga koncentrationer i lung epitel ^20-23. Detta skulle kunna förklara tidigare rapporter om infektioner i B1-NSCs från LVs injiceras i den laterala ventrikeln ^24.

Eftersom B1-NSCs producera avkomma som vandrar framåt och bakåt dorsalt, kan GFP-positiva celler återfinns på alla nivåer i RMS samt OB och corpus callosum där de terminalt differentiera till neuron och oligodendrocyter, respektive. Men vi använder inte reportern uttryck för att bestämma effekterna av genetisk modifiering på andelen neurogenes eller oligodendrogenesis. Å ena sidan är corpus callosum i banan för nålen spåret och därför kan vissa celler som verkar märkta vara resultatet av en direkt infektion under insprutningsprocessen. Å andra sidan, det är inte möjligt, eftersom alla typer av celler i den V-SVZ kan infekteras för att skilja på om de märkta OB neuroner är resultatet av en genetisk modifiering i B1-celler eller deras progenitor derivat. I fallet med experiment, i vilka endast den ependymceller är infekterade, är B1-celler och deras avkomma inte märkt med reportern och därför inte kan spåras neurogenes eller oligodendrogenesis. Emellertid kan man dra fördel av BrdU kvarhållning för att analysera B1-NSC beroende neurogenes till OB eller oligodendrogenesis till corpus callosum liksom den proliferativa aktiviteten av långsamt delande NSCs i den V-SVZ av de infekterade mössen. Till exempel, kan mössen injiceras med BrdU följande tidigare publicerade protokoll ¹⁷ 10 dagar efter infektion med de LVs och tilläts att överleva i 21 dagar. BrdU detektering i OB / corpus callosum kan sedan användas för att bestämma graden av neurogenes / oligodendrogenesis, medan BrdU retention i det V-SVZ kan tas som en uppskattning av antalet aktiverade B1-celler ^13.

Det förfarande som beskrivs här kan användas för expression av gener av intresse för förstärknings-of-function experiments men kan även användas för avgivning av tysta konstruktioner baserade på RNA-interferens eller för leverans av cre-rekombinas-konstruktioner för att inaktivera germ-line överförda floxed alleler i de V-SVZ celler. Dessutom skulle denna teknik också användas för crispr medierad genomet redigering om injektion av lentivirus-single styr RNA används i kombination med en Cre-beroende ROSA26 Cas9 knockin mus ^25.

Kritiskt steg 1:. Genöverföring in vivo-applikationer med LVs till specifika hjärnområden lentivirus produktion och manipulation kräver höga titer vektorberedningar, eftersom endast mycket små volymer kan injiceras stereotaktiskt utan att skada hjärnvävnad. Lentivirala beredningar måste renas och effektivt koncentreras före injektion i hjärnan på grund av det faktum att LVs genereras i transienta samtransfektion system. Det förfarande som beskrivs häri är biosäkerhet nivå 2, därför alla förfaranden somkräver manipulering av virus utförs i BSL2 anläggningar. Forskningspersonal måste ha lämpliga kvalifikationer och utbildad i alla förfaranden. Dessutom måste kirurgi utföras av utbildade forskare efter rutiner som godkänts av de lokala myndigheterna för djurskydd, och bör göras under aseptiska förhållanden med korrekt steriliserade instrument skyddsnivå 2 områden. Adekvat preoperativ och postoperativ vård av djur skall utföras och bör vara i enlighet med fastställda veterinärmedicinska och vårdpraxis. Närmare bestämt måste alla försiktighetsåtgärder vidtas för att minimera smärta och stress tillfogas till djuret administrering av anestesi och smärtlindring. Varje steg när det gäller användningen av virus i djur måste godkännas av de institutionella myndigheter och utförs i enlighet med lokala föreskrifter. Personlig skyddsutrustning måste också bäras, inklusive en klänning, dubbla handskar och skyddsglasögon. Fenabundsförvant måste alla verktyg och ytor som kunde ha varit i kontakt med virus noggrant dekontamineras enligt facility's godkända desinfektionsmetoder (genom att torka med 70% etanol, 10% blekmedel och / eller autoklavering).

Enligt vår erfarenhet är den kalciumfosfattransfektion metod en mycket effektiv och billig teknik att införa DNA i 293T-celler. Men kommersiella DNA transfektionsreagens kan också användas enligt tillverkarens protokoll i det här steget. Detta protokoll är optimerad för insamling av den virala supernatanten vid 30 timmar efter medie utbyte av 293T-celler. Lentivirala supernatanten kan också hämtas 24 och 48 timmar efter medie byte. Men i vår erfarenhet en enda samling på 30 timmar ger en hög titer lentivirus vektor.

Kritiskt steg 2: praktiskt exempel på beräkningar av vektorn titer med hjälp av formeln:% GFP ⁺ / 100 x antal celler infekterade x utspädning factor (DF) = transducerande enheter (TU) / ml. I detta exempel, är 5 x 10 ⁴ celler (293T) ympas föregående dag gör det möjligt att transduktion av 10 ^5-celler. Efter att ha inhämtat% av omvandlade celler genom att använda flödescytometri som beskrivs i protokollet, är två värden av omvandlade celler som valts för beräkningarna, de som motsvarar de utspädningar där överföring varken är mättad eller för lågt. Till exempel: spädningsfaktorn 10 ^-6 ger 8.08% celler infekterade, och spädningsfaktorn 10 ^-5 ge en 61,78% celler infekterade. Titern är medelvärdet av de värden som tillhandahållits från att tillämpa formeln med hjälp av värdena i cellerna transducerade och dess motsvarande utspädningsfaktor. I detta exempel:

Titer för spädningsfaktorn 10 ^-6 = (8,08 / 100) x 100.000 x 10 ⁶ = 8,08 · 10 ⁹ TU / ml

Titer för spädningsfaktorn 10 ^-5 = (61,78 / 100) x 100.000 x 10 ⁵= 6,178 · 10 ⁹ TU / ml

Genomsnitt = [(8,08 + 6,178) / 2] · 10 ⁹ = 7,1 · 10 ⁹ TU / ml

Kritiskt steg 3: stereotaktisk injektion. Den metod som beskrivs här bygger på användning av låga volymer av höga titrar av LVs stereotaktiskt styrd leverans till specifika platser. De stereotaktiska koordinater som anges i detta protokoll har fastställts för C57 / BL6-möss och får inte vara lämpliga för andra musstammar. Stereotaktiska koordinater bör bestämmas för varje stam och ålder med hjälp av ett färgämne som snabb grön före experimentet. För att göra detta, är färgen sprutas och efter musen offras, är hjärnan utvinns och fryses för en hrat -20 ° C. När hjärnan är härdad, kan den skivas med ett blad på platsen för injektionen och observerades under ett dissektionsmikroskop för att avgöra om injektionsstället är optimerad för specifika experimentella ändamål.

kritiskt steg4: efter överlevnadstiden. Post-överlevnadstider kommer att vara olika beroende på injektionsstället. En långsiktig överlevnadstiden tillåter hjärnvävnad att återhämta sig från injektions skadan och, ännu viktigare, celler som observerats i RMS och OB efter 60 dagar är derivat av den relativa overksamma B1-NSCs. Injektioner i den laterala ventrikeln inte fysiskt skadar V-SVZ. Därför är en 15-dagarsperiod tillräckligt för att säkerställa uttryck av transgener av ependymala celler.

Kritiskt steg 5: efter fixering gånger. Överdriven efter fixering av hjärnvävnad kan generera maskering av vissa antigener, på grund av att det tvärbindande aktiviteten hos de reagens, såsom paraformaldehyd. Dessa är bra på att bevara cellstruktur, men kan minska antigeniciteten för vissa proteiner som tvärbindningen kan hindra antikroppsbindning till epitoperna. Antigenåtervinning tekniker kan erfordras, i synnerhet om det finns en lång fixerings inkubationstid eller om en hög procentandel av tvärbindnings fixative används. Alternativt har kortare perioder av efter fixering av en timme visat sig vara tillräcklig i vår erfarenhet att bibehålla strukturen hos vävnaden liksom att säkerställa en god antigenicitet i cellerna utan användning av antigenapporte förfaranden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100 x 20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2x HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33 gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25 G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations