Abstract
比較的静止体性幹細胞は、大部分の成体組織における生涯細胞の再生をサポートしています。成人の哺乳類の脳内の神経幹細胞は、2つの特定の神経因性ニッチに制限されている：海馬における歯状回および心室-脳室下帯の顆粒下ゾーン（V-SVZを、また、上衣ゾーンまたはSEZと呼ばれる）の横の壁に心室。長期幹細胞における所望の導入遺伝子の発現およびそれらの派生子孫を生じる（ すなわち、哺乳動物の脳のもの）成体幹細胞集団のためのin vivo遺伝子導入戦略の開発は、現在、生物医学及びバイオテクノロジー研究において重要なツールです。ここでは、直接in vivo法は、LVのによる細胞周期に依存しない感染症およびV-SVZニッチの専門性の高い細胞構築を活用して成体マウスV-SVZ細胞の安定な遺伝的改変のために提示されています。具体的には、現在のプロトコルが関与しますV-SVZ自体のいずれかに特異的な導入遺伝子発現カセットをコードする空のLV（対照）またはのLVの注入は、上衣のターゲティングのために、in vivoでのニッチ内の細胞のすべてのタイプのターゲティングのために、または側脳室の内腔に、よ細胞のみ。発現カセットは、次にできるよう、またのLVによってコード導入された細胞と蛍光タンパク質のゲノムに組み込まれている標識された細胞とにおける細胞自律非自律、ニッチ依存効果の分析のための形質導入された細胞の検出、それら子孫。
Introduction
マウス心室脳室下帯（V-SVZ）、線条体に面した側脳室の壁には、嗅球の持続的な生産における前駆細胞の複製と分化の結果の中で継続的なプロセス（OB非常にアクティブな胚領域であり、 ）介在ニューロンと脳梁オリゴデンドロサイト1。 、星状細胞抗原グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現し、このようなネスチン、Id1のような細胞マーカー幹;これらの細胞の生涯の生成は、神経幹細胞（別名B1細胞のNSC）のこの領域に存在することによってサポートされているように見えます及びSox2の2。 GFAP発現B1細胞は、トランジット増幅前駆細胞転写がDLX2（遠位レスホメオボックス2）及びASCL1（哺乳類achaete-schuteホモログ1）を係数表現（TAP）細胞（C細胞）を、生成し、それらが生じる前に、急速に数回を分割神経芽細胞（A細胞）またはoligodendroblasts 3を移行します。新たに生成されたproliferative神経芽細胞は、彼らが粒状と差別化抑制性などの糸球体層に統合OBへの吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を形成し、前方に移行します。移行若いoligodendroblastsは、彼らが局所的に分割または成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイト1,4に分化していき未熟NG2陽性細胞となるCC、に移動。
胎児の放射状グリア細胞に由来B1細胞は、前任者の細長い偏光形態を保持し、それらのニッチで専門性の高い関係を示します。彼らはどのラインアップ心室とV-SVZニッチを灌漑血管のネットワークを上衣の間にまたがります。 multiciliated ependymocytes間のB1細胞のインターカレーションの小さな頂端プロセスおよび単一の非運動性の一次繊毛で終了し、その基礎プロセスはb。で、このニッチな結末を灌漑平面血管叢に近づくために長い距離を拡張し、一方、叢毛細血管2,5-8のASALラミナ。
無傷のV-SVZニッチでも、GFAP +である非神経性アストロサイトからB1-のNSCを区別するための最も確実な方法は、全マウント心室側壁の準備と3次元共焦点顕微鏡によるそれらの分析の後に基づいています各繊毛5,8の程度を標識するcilial基礎体またはアセチル化αチューブリンのマーカーとして細胞膜を描写するために、βカテニンを薄B1-NSC頂端プロセスにラベルを付け、およびγチューブリンのいずれかのためにGFAPの免疫染色。心室の表面からこれらの全マウントの観察は、B1及び上衣細胞は、1つまたは複数のGFAP + B1細胞の頂端uniciliatedプロセスはmulticiliated上衣細胞のロゼットで囲まれている中で「風車」5に配置されていることが示されています。
B1細胞の特徴的な形態は、実験的証拠と相関する私NSCを2,6,9-11に作用する可溶性シグナルの調節源を構成している血管/内皮細胞ndicatingおよび脳脊髄液（CSF）を心室。心室表面では、上衣とB1細胞が関与する同型と異apico-横相互作用がタイトジャンクションが含まれており、接合部5,12をアドヘレン。また、例えば、N-カドヘリン及びV-CAMとしてB1と上衣細胞との間の接合部複合体に関与する接着分子は、高度に組織化されたV-SVZニッチにおけるB1の位置決めだけでなく、それらの静止12だけでなく、調節することが示されています、13。上衣-B1細胞単層は、CSFから水および小分子の調節されたフラックスを可能にする拡散バリアとして機能するように見えますが、大きなタンパク質10,11の間の通路を制限します。実験的証拠は、一意に位置付けB1細胞頂端繊毛は、CSF 2に存在するポリペプチドシグナリングのセンサーとしての役割を果たし得ることを示しています5-7。上衣細胞はまた、それ自体が、NSCの挙動14,15の調節における役割と可溶性および膜結合信号の源です。
例えばブロモデオキシウリジン（BrdUの）、またはレトロウイルスなどの追跡可能なヌクレオシドは、広くインビボでのNSCを含む前駆細胞を標識するために使用されてきました。 BrdUの信号が繰り返される細胞分裂およびレトロウイルスを介して希薄しかし、これらの方法は、長期的な運命のトレースには最適ではない優先的に一過性に形質導入16,17のための細胞増殖のそれらの要件のために増幅する細胞を標的とするように見えます。 B1-NSCのは、主に静止状態であり、その近隣の上衣細胞は、生理的条件3の下で分裂したことがないようにニッチなコンポーネントとの相互作用を含む、in vivoで NSCの生理機能を調べるために、稀に分割していない細胞を標識し、追跡する方法を確立することが重要です。ここでは、レンチウイルスベクター（LVの）は、高効率遺伝子マークを可能にすることを示していまする最も合理形質導入すると、細胞周期に依存しない方法で標的細胞のゲノム中に統合するそれらの能力のために、成体のNSCおよび非分裂上衣細胞の長期的修飾、。さらに、私達は配達、特に上衣細胞を形質導入するウイルス力価のヘルプのルートが、B1ない細胞は、それによってのNSCにニッチに依存し、上衣効果の分析を可能にする方法を示しています。
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Protocol
倫理の声明：このプロトコルは、欧州指令63分の2010 / EUに準拠したバレンシア大学の動物のケアのガイドラインに従います。
研究をマーキングインビボのためのLVの1世代（図1aを参照してください）
注意：本明細書に記載された手順は、したがって、バイオハザードフード内のすべての次の手順を実行し、バイオセーフティーレベル2です。研究担当者は、適切な資格と、すべての手順の研修を受けていることを確認してください。ガウン、二重の手袋と適切な眼の保護を含め、個人用保護具を着用してください。最後に、完全に（70％エタノール、10％の漂白剤および/またはオートクレーブ処理で拭いて）承認された施設の消毒慣行に従ってウイルスと接触していたかもしれないすべてのツールとの表面を除染します。
- ヒト胎児腎臓293T細胞におけるLVの生産
- トランスフェクションのために純粋なDNAを調製することにより、このプロトコルを起動します。準備し、二重のCsCl卒業生によって各プラスミドを精製しient遠心分離またはエンドトキシンフリーDNAを得た他の市販のカラム法。このプロトコルでは、トランスファーベクタープラスミドpRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpreを使用しています。推奨されるコアパッケージングプラスミドは、pMDLg / pRREとpRSV.REVとエンベローププラスミドpMD2G 13,18,19です。
- 二十四時間トランスフェクション前に、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）でプレートに5×10 6 293T細胞がために約1/4 1/3までコンフルエントな培養を得るために、10cmのプラスチック皿に（材料の表を参照してください ）トランスフェクション。 5〜7％のCO 2雰囲気中、加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
- トランスフェクションの前に新鮮な培地2時間で培地を交換してください。
- 滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブのpRSV.REV2.5μgのとpMDLg / pRREのパッケージングプラスミド5μgのとトランスファーベクタープラスミドのミックス10μgの（導入遺伝子のcDNAまたは送達されるのshRNAを含む）、および3.5では＆ ＃181;エンベローププラスミドpMD2Gのグラム。 0.1×TEバッファーで450μlの最終体積にプラスミド溶液を作る（材料の表を参照してください ）/のdH 2 0（2：1）。その後、2.5 MのCaCl 2の50μlを添加します。
- フルスピードでボルテックスしながら2倍のHepes緩衝生理食塩水を500μlを滴下することにより沈殿物を形成する500μlのDNA-TE-のCaCl 2混合物に溶液（HBSを、材料の表を参照してください）。
- すぐに293T細胞に沈殿物を追加します。穏やかに混合するためにプレートを渦巻きます。インキュベーターにセルを返し、トランスフェクション後の媒体14-16時間を変更します。
- メディアを変更した後、細胞上清を30時間を収集します。孔径0.22μmのニトロセルロースフィルターを通して上清を濾過し、濃縮に進みます。
- LVの濃度
- 2のために50,000 XG（SW-28超遠心機のローターで19000 rpm）で超遠心分離することにより馴化培地を集中30ミリリットルのポリプロピレン透明円錐ローター管中の室温（RT）でhr。
注：円錐形のローターチューブ用使用超遠心分離機アダプタ（材料の表を参照）。 - デカンテーションにより上澄み液を捨て、（一つだけの遠心分離を行った場合に200μl以下）少量のペレットを再懸濁し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS; 材料 の表を参照）。そして、アップピペットと約20倍ダウン。
- プール懸濁し、室温で2時間も50,000のx グラム （SW-55超遠心機のローターで23000 rpm）で、超遠心分離によって再び集中します。 （材料の表を参照）5ミリリットルの公称容量を有するポリプロピレン透明ローターチューブを使用してください。
- 滅菌PBSの非常に少量（媒体の出発体積の1/500または1 /千）で最終ペレットを再懸濁し、室温で1時間、回転ホイール上に振ります。少量のアリコート（5-20μL）とfに分割-80℃でそれらをreeze。
- 廃棄する前に、10％の漂白剤ですべての空のチューブを扱います。
- 2のために50,000 XG（SW-28超遠心機のローターで19000 rpm）で超遠心分離することにより馴化培地を集中30ミリリットルのポリプロピレン透明円錐ローター管中の室温（RT）でhr。
- フローサイトメトリーを使用したレンチウイルス滴定
- 前日、プレート2ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）溶液に加え、6ウェル組織培養プレート中にウェル当たり5×10 4個のHeLa細胞を、（材料の表を参照のこと）。 24時間5〜7％CO 2の雰囲気中、加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
- 滴定の日に、ウイルスストックのアリコートを解凍し、DMEM中で、10 -3から10 -8に、連続希釈液を準備します。
- これを行うには、24ウェルプレートを取ると、次のウェルに最初のウェルに2mlのDMEMと1.8ミリリットルを追加します。そして、（：1,000または10 -3 1の最終希釈に）最初のウェルに濃縮されたウイルスストックの2μlを添加します。
- 徹底的に解決、変更先と転送10 -3希釈液200μlを混合するために、数回ピペッティングした後、第2のウェルに。 10 -8希釈が行われるまで、次のウェル内に直列に手順を繰り返します。
- HeLa細胞をインキュベーターから前日メッキてください。注意深くウェルから培地を除去します。 HeLa細胞を含むウェルに8 mg / mlとヘキサジメトリン臭化1μlのと一緒に、各ウイルス希釈液の1ミリリットルを追加します。穏やかに混合するためにプレートを渦巻きます。
注：臭化ヘキサジメトリンは、培養中の細胞へのウイルスの吸着を高めるために添加されます。 - インキュベーターにセルを返し、感染は72時間進行させます。各ウェルに（材料の表を参照）その後、培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄し、トリプシンEDTAの200μlを添加します。
- 37℃で5分後、試験管フローサイトメトリーで各ウェル収穫細胞にPBSの2ミリリットルを追加します。
- 室温で5分間、300×gで遠心分離し、上清を吸引します。
- soluti固定1mlでペレットを再懸濁（PBS中の1％ホルムアルデヒド電子顕微鏡グレードおよび2％ウシ胎児血清）に、次にチューブをボルテックス。
- 15 mWのパワーで488 nmのアルゴンionlaserを使用して、フローサイトメーターで細胞を分析します。
- 前方散乱（FS）、側方散乱光（SS）、およびGFPのための蛍光（40分の525 nm）の標準設定でインストゥルメントを設定します。細胞集合体と破片を除外するためにSSのドットプロット対 FSで細胞集団のゲーティングを選択します。対数スケールでの蛍光を収集します。各試料中のGFP +細胞の数を計算します。
- 次の式を使用して、ベクター力価を計算します。x希釈係数を感染させた細胞（DF）の％のGFP + / 100 x個=形質導入単位（TU）/ mlです。
図1：手順のさまざまな部分の概略図で 、Tの（a）の第1部。彼は、プロトコル：適切なプラスミドを用いたHEK293T細胞のトランスフェクションからのin vivo標識研究のためのLVの生成が示された式を用いてフローサイトメトリーによりウイルス力価の決意にLVを生成します。プラスミドおよび遠心ロータの名前が示されています。 （b及びc）プロトコルのパート2：のLVの定位注射。 「b」はバーニヤ目盛、定位固定器具の一部であり、微細な測定のために機能する装置の例を示します。例として、矢印は4.23センチメートルを示しています。トップビュー（左）のために、サジタル断面（権利のために示すように、バーニアスケールは、（DV）軸、前後（AP）の座標を決定するために使用される内外方向（ML）、および背腹されます）脳の。 「c」は、矢状および冠状縫合との交点としてブレグマの位置を示しています。 LVSは、シリンジを用いて注入されます。どのように脳の私を示す（d）の模式図分析のために処理秒。 2つの半球に分割され、それぞれが2つのブロックに分割されています。 （;参考のためPaxinos'アトラスを参照してくださいブレグマ2.46ミリメートル）のOBを含むブロックの「a」は、すぐに終脳とOB接合に後方APレベルで冠状切断によって生成されます。ブロック「B」は2冠状カットすることにより製造される、レベルの1は、単に脳梁 （ブレグマ1.7ミリメートル）の最も吻側側面と2側脳室（ブレグマ-0.22の接合部のレベルで第1の前方ミリメートル）。 GL、糸球体層; GCL、顆粒細胞層。 ST、線条体。 ccで、 脳梁 。交流、前交連。 lvの、側脳室。
2. LVの定位注射V-SVZ /線条体ボーダーにまたは側脳室へ（図1bを参照してください）
- 準備
- プランジャーで70％エタノールで本体と針を下に噴霧することにより、33ゲージの針で5μlの容量のシリンジを滅菌しますすべての方法を引き抜きます。繰り返し1.5ミリリットルマイクロチューブからエタノールを吸引し、数回のすべての方法をそれを取り出して、その後滅菌水で十分にシリンジをすすぎます。培養フードに安全な場所に置き、注射器を置き、乾燥させます。
- この手順からのすべての廃棄物を浸漬するのに適したボリュームに10％の漂白剤とバイオハザード廃棄物容器を準備します（一般的に500ミリリットル容器内の200ミリリットル）。
- 水で密閉可能なプラスチック製の収納袋を充填し、37℃に加温して37℃のウォーターベッドを準備し、予熱。これは、マウスが注射後に回復することができます。
- 注射を開始する前に、Cの冷凍庫で1時間-80℃からウイルスストックを取り外し、室温で回転ホイール上でバイアルを置きます。解凍後、注射の時間の間に氷の上でウイルスストックを維持します。 LVの定位注射の前に、10 6 TUに濃縮されたウイルスストックを希釈/培養フードにPBSを使用してμlの。
- 70％エタノールで手術を行うための選択された領域を消毒。
- LVのマイクロインジェクション
- 選択し、手術（メス、ドリル、および小型のピンセット）のために必要なツールを殺菌。
- 腹腔内（IP）はケタミンおよびメデトミジンの獣医学的に監修混合物を注入することにより、6-8週齢のマウスを麻酔。各動物を計量し、50から75 mgのケタミンと（ マウス当たりケタミン/メデトミジン作業溶液の100から125μlの周り）は、マウスの体重1kgあたり0.5〜1ミリグラムのメデトミジンで各用量。
- つま先、尾や耳をつまんし、動物が全く反応を示さないことを確実にすることによって、麻酔面を評価します。
- マウスを麻酔したら、手術後の痛みを最小限にするためにキロマウスの体重当たり0.4〜0.5ミリグラムの最終用量でブトルファノールの皮下注射。
- 耳の間の領域を剃るし、ヨードホールなどiodopovidoneまたは70％エタノールを使用して皮膚を消毒。滅菌綿を使用してクレンズ-tippedアプリケーター。これは低体温症を悪化させることができるように過度に動物を濡らさないように注意してください。
- 定位フレーム上の腹臥位で動物を置き、慎重に耳のバーや装置の口蓋サポートを使用してヘッドを固定します。 37℃に設定した加熱パッドでマウスを維持し、目への眼科用潤滑剤を適用します。
- 縦方向にメスを用いて頭皮上の長さ1cmの切開を行い、そして優しく細かいピンセットを使って頭蓋骨を露出させるために、皮膚を撤回。
- 慎重に滅菌綿棒で骨の表面を清掃してください。任意の残りの組織の露出した頭蓋骨を清め。
- シリンジホルダーを用いた定位装置上の滅菌注射器をマウントします。
- 注射針の先端がブレグマ、矢状（縦および内側）縫合糸が垂直に冠状縫合と交差する連動ポイントに配置されるまで（FigurをシリンジホルダX、Y及びZ軸を移動させます電子図1b）。背腹（DV）軸の「ゼロ」の位置はブレグマで頭蓋骨の表面であることを確認してください。
- xとy先の座標（ 表1及び図1bを参照）に注射器を移動します。
| 注射の地域 | 座標 | ||
| 前後（AP） | 内外方向（ML） | 背腹（DV） | |
| SEZ /線条体の境界線 | 0.6ミリメートル | 1.2ミリメートル | -3.0ミリメートル |
| 側脳室 | -0.3ミリメートル | 1.0ミリメートル | -2.6ミリメートル |
表1：定位がで座標jections。AP及びML軸、x、y座標については、ブレグマからの距離（mm）として与えられています。 " - " "後方に向けて」を示しています。 DVは「ゼロ」を座標のブレグマ点で頭蓋骨の表面であるとDV座標がダウンし、この点から距離（mm）を示しています。
- Xに注釈を付け、y、zの目的地は、後に注射部位に戻ってくることができるようにするために、バーニアスケールで調整します。手術用マーカーペンを使用して、x、y座標でマーク骨。
- 作業領域から離れた注射器を移動します。
- 電動ドリルを使用すると、脳に損傷を与えないよう慎重に頭蓋骨に穴を作ります。これは脳の表面に損傷を与える可能性がある軟膜表面を開けないでください。
- 10 6 TU /μlのウイルス液の1μlのシリンジをロードします。その先端10から12°の角度を有する33ゲージの鋭い斜めの針を使用してください。 90°のANGで注射針を置きル脳表面に対する。
- バック注射部位に注射器を移動し、先端が軟膜表面に接触するまで、それを下に移動。
- DV軸にz座標に注射器で脳を貫通しています。
- ゆっくり過大流体圧力に起因する脳組織への損傷を最小限にするために、0.2マイクロリットル/分の速度で、ウイルス懸濁液を放出します。
- ウイルス懸濁液の逆流を最小限にするために5〜10分待ってから、非常にゆっくりと注射器を後退させます。ワイプラボを使用して、注射器の後退の結果として表面に現れ、漂白剤含有生物学的安全性廃棄物容器にすぐにそれを置くことができる液体のいずれかの過剰分を吸い取ります。
- 、定位セットから動物を取る暖かいパッドの上に置き、そして皮膚接着剤を使用して傷を閉じます。 0.1から1.0 mg / kg体重のアチパメゾールを使用して鎮静を逆にします。
- 、キロマウスの重量当たり0.1ミリグラムの最終用量で皮下ごとに12時間をBupenorphrineを注入短い持続ブトルファノールの鎮痛剤の投与後4時間を開始します。
- 暖かいパッドで個別ケージに動物を置き、マウスが麻酔から回復するまで綿密に監視します。回復後、動物の水和物を助けるためにケージにヒドロゲルの1袋を置きます。
- 液体漂白剤バイオハザード廃棄内のすべての生物汚染廃棄物を処分。エタノールの吸引、吐出することにより、注射器をきれいにし、水ですすいでください。エリア、定位セットと漂白剤と70％エタノールで使用されている外科用材料を消毒します。
- 彼らは、従来の住宅施設に転送することができた後24〜48時間のためのバイオセーフティーレベル2室に分離された注射したマウスを保ちます
3.組織学的解析
- 灌流、組織収集、および切片
- 深くメデトミジンとケタミンの獣医学的に監修混合物を使用してマウスをanaesthetize（トンをつまんで麻酔面を評価しますOES、尾や耳）、前述したように。
- 経同じ速度17においてPB中4％PFAを75ml、続いて食塩水25mlでマウスを灌流。
- 脳を抽出し、1-16時間、PBで冷たい4％PFAの少なくとも10倍のボリュームに浸漬することによってそれをポスト修正（増加後の固定時間は、いくつかの抗原の免疫反応性を減少させることができます）。 PBで十分に残っているPFAを洗ってください。
- 図1dの兆候後の脳をカットし、シアノアクリレートを使用して、ビブラのホルダーに得られたブロックを接着。
- ビブラトームを用いて、厚さ30μmの連続冠状断面を収集します。 4℃でPBで24マルチウェルプレート中の脳切片を保管してください。汚染を防ぐために、0.05％アジ化ナトリウムは、PB溶液に添加することができます。
- 免疫組織化学
- 0.05％アジ化ナトリウム、1％グリシン、5％正常ヤギ血清を緩衝液（PBをブロッキング自由浮遊切片をインキュベートし、0.1％トリットロッキングプラットフォームで穏やかに振とうしながら室温で1時間の場合）X-100について。
- 慎重に、ブロッキング緩衝液中の抗GFPウサギの一次抗体（材料の表を参照）の適切な希釈を追加し、ピペットでブロッキング緩衝液を除去し、穏やかに振盪しながら4℃で48時間、この希釈液で組織をインキュベートします。
- 一次抗体溶液をPBで3回、1回の洗浄ごとに10分の最小値を洗い流します。
- ブロッキング溶液中のフルオロフォア結合二次抗体の適切な希釈によるフリーフローティングセクション）をインキュベート（RTと穏やかに振とうで1時間）材料の表を参照してください 。インキュベーションの間に直接光からセクションを保護します。
- PB、3回ごとに10分間二次抗体溶液を洗浄し、5分間水中での1mg / mlのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を用いて切片をインキュベートすることによって、組織を対比染色。 2回迅速にウィットをすすぐことによってDAPI液を洗い流します時間水。
- 静かに細かいペイントブラシを使用して、顕微鏡スライド上にセクションを配置。組織の上に（材料の表を参照）、蛍光の準備のための媒体の装着数滴を入れ、慎重にマウントソリューションが正しく表面全体に分布されており、気泡がないことを確認し、上にカバースリップを配置。ゆっくりメディアの装着過剰を排出するためのカバースリップを下に絞ります。
- マウントソリューションは、（2-16時間）乾くときは、488 nmのレーザー共焦点レーザー走査顕微鏡によってサンプルを分析します。
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Representative Results
LV媒介遺伝子送達系は、増殖、遊走および分化の間にそれらの追跡及び遺伝的改変を可能にする、成体マウスのV-SVZにおける細胞の in vivo形質導入の長期に使用することができます。感染および発現は、非常に有効であり、含まれるレポーターの発現により他の非感染細胞の間で容易に区別することができる多数の細胞を得ました。我々は、これまで広範に発現ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより駆動されるGFP蛍光レポーターで形質導入された細胞を可視化しているが、他のレポーターまたはタンパク質タグを使用することもできます。私たちは日常的にGFPに対する抗体を使用する代わりに、それはより強い蛍光シグナルを生成するようなレポーター発光の直接検出に依存します。また、脳は、新鮮な解剖し、固定液に浸漬するがはるかに良い結果がtranscardial灌流することによって得られることができます。
精製、濃縮されたベクターストックはゆっくりと私です線条体とその限界にV-SVZに定位指導の下njected（ 図2a、b）に 。二ヶ月注入後、多数のGFP +細胞は、V-SVZおよび注射部位から約1ミリメートルの範囲で見出された（ 図2A、B）。 （;も15参照図2c）上衣細胞によるV-SVZとレポーターの発現における細胞のすべてのタイプの伝達においてのLV結果による感染は、論理ボリュームがまた、効率的に非分裂細胞を標的とすることができることを示しています。 V-SVZにおけるGFP-標識パターンは、2週間18後に見られるものと同様でした。長い期間は手術によって招いた損傷からの組織の回復を可能にするため、組織反応の兆候は、しかし、注射後2ヵ月の時点で検出されませんでした。 2ヶ月の期間中、感染TAP細胞はOBの方にゾーンを移行し、神経芽細胞に進行します。このプロセスは、GFPの存在を数日3かかるため感染のLVも神経性B1-のNSC（ 図2d）を標的とすることを示した後、RMS 60日で+神経芽細胞。注射時にB1、C、および細胞の形質導入は、OB（ 図2E）にGFP +介在ニューロンを生成します。
高力価の小容量の注入はependymocytesのみ（ 図2F-H）の感染における側脳室の結果にLVストックを濃縮しました。タンパク質S100βカルシウム結合が含まれているほとんどの上衣細胞は、感染症（ 図2I）からわずか15日後にレポーターを発現します。 V-SVZ /線条体の限界への注射とは対照的に、何のGFP +細胞がsubependymallyこの手順（ 図2H、J）を使用して位置するか、またはRMSまたはOBで観察されませんでした。説明したように感染症の両方のタイプは、V-SVZを通してセクションで分析することができます。彼らはまた、横方向の通気孔の全マウント調製物で分析することができますricle壁（8内のプロトコルを参照してください）。
最近、我々はependymocytesへのB1細胞のN-カドヘリン媒介細胞間接着は、その静止状態を制御する方法を説明しています。私たちは、N-カドヘリンの不活性化をもたらしカドヘリンドミナントネガティブ構築物を運ぶLVを提供するために、ここで説明する手順を使用しています。我々は、NSCのと上衣細胞または上衣細胞におけるN-カドヘリンの喪失のみ同型細胞間相互作用（ 図3A、Bの破壊の結果として、NSCの数及び細胞周期エントリーの増加を促進することを実証しました。 15を参照してください ）。
図2：注射したマウスのセクションで免疫蛍光法によってレポーター検出大人サブ脳室帯のニッチの（a）の模式図。携帯componenの簡素化ニッチのTSが示されています。 B1細胞は、偏光であり、ニッチで専門的な関係を示します。彼らはどのラインアップ心室とV-SVZニッチを灌漑血管のネットワークを上衣の間にまたがります。 multiciliated ependymocytes間のB1細胞のインターカレーションの小さな頂端過程とその基礎プロセスは叢毛細血管の基底膜に、このニッチな結末を灌漑平面血管叢に近づくように延びているのに対し、単一の非運動性の一次繊毛で終わります。 B1セル誘導体は、積極的に血管の周囲に増殖し、ニッチアストロサイトと接触して嗅球に向かって神経芽細胞のチェーンを移行する中間前駆体です。 1の半球を通る冠状断面の（b）の回路図は、注射のレベルとV-SVZ /線条体境界での注射のための注射針の位置を示します。 （c）の顕微鏡写真を模式的STAに示されているのと同じレベルで撮影しました（;左灰色）およびGFPの免疫検出のためのDAPIでINED（緑;右）60日注射後。点線は脳梁の限界を示しています。 （d）の V-SVZを通して冠状断面でV-SVZ近辺または線条体の境界に注入GFPレポーターの免疫蛍光検出の高倍率。点線はV-SVZの限界を示しています。多くの細胞がV-SVZニッチに感染していることに注意してください。上衣細胞は、心室腔を制限立方細胞として認識することができます。 GFPのために（e）の免疫蛍光（緑）、神経芽細胞マーカーPSZ-NCAM（赤）。 60日前に感染していたのNSCからの神経芽細胞の生成を示す、二重陽性細胞の存在に注意してください。白矢じりは、神経芽細胞を指します。挿入図は、白い四角で囲まれた領域に対応。 （f）は 、注射のレベルを示す1の半球を通る冠状断面との位置の概略を側脳室に注射用の注射針。 （緑色で、右）、（左グレー）とGFPの免疫検出のための（g）の顕微鏡写真は、DAPIで染色した模式的に示したのと同じレベルで撮影した15日間の注射後。点線は脳梁の限界を示しています。 （H）V-SVZを通して冠状断面に心室に注入されたGFPレポーターの免疫蛍光検出の高倍率。点線はV-SVZの限界を示しています。唯一の上衣細胞が感染していることに注意してください。 GFPのための- （I j）の免疫蛍光および上衣細胞マーカーS100β。背側（i）および腹側（j）は V-SVZに沿って多数の二重陽性細胞の存在に注意してください。アローヘッドはまた、S100βで標識され、線条体実質におけるアストロサイトで指し示します。 K。冠状DAPIで染色したOBの断面（灰色;左）とGFPの免疫検出（GREエン;右）60日V-SVZ /線条体注射後に白い四角で囲まれた領域です。多数の標識されたニューロンに注目してください。 （緑の中、右）GFPのと免疫検出;（l）を DAPIで染色したOBの冠状断面（左グレー）45日側脳室注射後に白い四角で囲まれた領域。ラベルされた全くOBニューロンが存在しないことに注意してください。 CX、大脳皮質。 lvの、側脳室。 STR、線条体。 GL、糸球体層; GCL、顆粒細胞層。 MCL、僧帽細胞層。スケールバー：C、G = 500ミクロン; D、E、HJ = 10ミクロン; KL = 250ミクロン; 100μmです。
図3：彼らはニッチから切り離さになると大人のNSCは、より積極的に増殖する空のLVの線条体注射を受けたマウスのV-SVZ（上パネル）またはLVのカーを通じてのセクションの（a）の共焦点顕微鏡写真。LVレポーターGFP（緑）、NSCマーカーGFAP（赤色）の検出のための免疫染色ドミナントネガティブカドヘリン構築物（下パネル）、英、細胞周期マーカーのKi67（シアン）、およびDAPI（青）60日後感染症。 （;右グレー）各マーカーのための独立したパネルが表示されます。 （b）の V-SVZ LVレポーターGFPを検出するための免疫染色側脳室に空のLV（上パネル）またはドミナントネガティブカドヘリン構築物（下のパネル）を運ぶのLVの注射を受けたマウスの貫通セクションの共焦点顕微鏡写真を（緑）、NSCマーカーGFAP（赤）、細胞周期マーカーのKi67（シアン）、およびDAPI（青）、感染後15日。 （;右グレー）各マーカーのための独立したパネルが表示されます。白矢印はGFAP / GFP二重陽性細胞を指すと白の矢じりは、その核のどちらの場合も、黄色のアスタリスクで示されているGFAP / Ki67の/ GFP三重陽性細胞を指します。定量分析は、より多くのサイクリングのNSCを示したときに、N-CADherinレベルは、NSCを自分自身のみ上衣細胞では15に減少しました。スケール：10ミクロン。
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Discussion
LVSは大人のNSC 16,18の遺伝的改変のための他のウイルスシステムに比べて重要な利点を提供します。 V-SVZニッチへのレンチウイルスの定位配信は、ラベルを付け、そのような複数の細胞分裂後に希釈されたBrdU、またはレトロウイルスなどの他の一般的に使用される方法の限界を克服B1-のNSCを分割まれにトレースし、細胞のみを標的とするための効率的な方法を表し、それは、アプリケーションの瞬間に増殖しています。 LVSは、一緒にアデノウイルスで、独立して自分のサイクリング状態の細胞に感染することができ、これは大人のNSC 16,18のように、このような上衣細胞としてではなく、サイクルを行う、又は比較的静止状態であるので、めったに分裂しない細胞に特に関連しています。導入遺伝子は安定して高効率形質導入された細胞およびその子孫の形態学的特徴を可能と統合し、表現になります。
NSCは、隣接細胞と専門性の高いニッチに抱いていますこのような上衣または血管細胞、ならびに独自の細胞の子孫は、このように厳密に調節された環境2を作成します 。多くの胎児のNSCと同様に、B1細胞は、次の心室への嘘と心室は、心室CSF 1（ 図2a）に浸漬し、単一の非運動性一次繊毛で終わる小さな、頂端のプロセスを通じて流体にお問い合わせください。この詳細な組織は、具体的には、ウイルス力価および配信エリアの制御を介して上衣細胞またはニッチ内のすべての細胞を標的化するために利用することができます。偏上皮におけるアドヘレンとタイトジャンクションは時々による接合部複合体中のウイルス侵入受容体（ すなわち CAR受容体）の制限された場所に、細胞や組織への外国のウイルスの侵入を妨げることが示されています。細胞間接着の破壊は、従って、レンチウイルス（LV）を含むウイルスの異なるタイプによる感染を好みます。興味深いことに、LVSは使用時に接合部複合体を破壊することが示されています肺上皮20-23で高濃度で。これは、側脳室24内に注入するLVによってB1-NSCの感染症の以前の報告を説明することができます。
B1-NSCのは、前方および背側移行子孫を生成するので、GFP陽性細胞はそれぞれ、RMSのすべてのレベルでだけでなく、彼らは末端神経細胞とオリゴデンドロサイトに分化OBと脳梁で見つけることができます。しかし、我々は、神経発生またはoligodendrogenesisの速度に対する遺伝的改変の影響を決定するために、レポーター発現を使用しないでください。一方、脳梁は針トラックの経路であり、従って、標識現れるいくつかの細胞は、注入プロセスの間に直接の感染の結果であり得ます。 V-SVZ内のセルの全てのタイプを感染させることができるので、一方、標識されたOBニューロンがB1細胞またはそれらのPROGの遺伝的改変の結果であるかを区別することは不可能ですenitor誘導体。唯一の上衣が感染している実験の場合は、B1細胞およびその子孫は、レポーターで標識されていないため、神経発生またはoligodendrogenesisをトレースすることはできません。しかし、人は脳梁と同様に感染したマウスのV-SVZでゆっくり分割NSCの増殖活性にOBやoligodendrogenesisにB1-NSC依存神経新生を分析するためのBrdU保持の利点を取ることができます。例えば、マウスにBrdUを17から10日のLV感染後以前に公開されたプロトコルに従い、21日間生存させて注入することができます。 V-SVZにおけるBrdUを保持が活性化B1、 セル 13の数の推定値とすることができるのに対し、OB /脳梁中のBrdU検出は、その後、神経新生/ oligodendrogenesisの速度を決定するために使用することができます。
ここで説明する手順は、機能獲得型EXのための目的の遺伝子の発現のために使用することができますperimentsもRNA干渉またはCreリコンビナーゼの送達のためのベースのサイレンシング構築物の送達に使用することができるが、V-SVZ細胞中の生殖系列伝達さフロックスの対立遺伝子を不活性化するために構築します。レンチウイルス単ガイドRNAの注入は、Cre依存Rosa26遺伝子Cas9ノックインマウス25と組み合わせて使用される場合に加えて、この技術は、CRISPR媒介ゲノム編集のために使用することができます。
重要なステップ1：レンチウイルスの生産及び操作のLVとのインビボ遺伝子移入アプリケーション特定の脳領域への非常に少量が脳組織を損傷することなく定位注入することができるので、高い力価のベクター調製物を必要とします。レンチウイルス調製物を精製し、効率的に起因したLVが一過性同時トランスフェクションシステムで生成されるという事実のために、脳への注入の前に濃縮される必要があります。本明細書に記載された手順は、バイオセーフティーレベル2、したがって、すべての手続きでありますウイルスの操作がBSL2施設で行われている必要があります。研究担当者は、適切にすべてのプロシージャの資格と訓練を受ける必要があります。また、手術は動物福祉のために地元当局によって承認されたルーチン、次の完全に訓練を受けた研究者によって行われなければならない、とバイオセーフティーレベル2の分野で適切に滅菌器具を用いて無菌条件下で行うべきです。動物の術前、適切かつ術後ケアを行わなければならないと確立獣医学医療と看護実践に従うべきです。具体的には、すべての予防措置は、麻酔や鎮痛の投与を含む動物に与えた苦痛やストレスを最小限に抑えるように注意しなければなりません。動物でのウイルスの使用に関するすべてのステップは、機関当局によって承認され、地域の規制に従って行われなければなりません。個人用保護具はまた、ガウン、二重手袋と適切な眼の保護を含め、着用しなければなりません。フィン同盟国、ウイルスに接触していたかもしれないすべてのツールと表面が完全に（70％エタノール、10％の漂白剤および/またはオートクレーブ処理で拭いて）消毒プラクティスを承認facility'sに応じて除染されなければなりません。
我々の経験では、リン酸カルシウムトランスフェクション法は、293T細胞にDNAを導入する非常に効率的かつ安価な技術です。しかし、市販のDNAトランスフェクション試薬もまた、この段階で、製造業者のプロトコールに従って使用することができます。このプロトコルは293T細胞の培地交換後30時間でウイルス上清の収集のために最適化されています。レンチウイルス上清は、メディア交換後24および48時間に収集することができます。しかし、私たちの経験では30時間で1つのコレクションに高力価レンチウイルスベクターを生成します。
重要なステップ2：数式を使用して、ベクター力価の計算の具体例：X希釈FAを感染した細胞の％GFP + / 100 x個CTOR（DF）=形質導入単位（TU）/ mlです。この例では、5×10 4細胞（293T）を、10 5個の細胞の形質導入を可能にする前日に播種されます。プロトコールに記載されているように、フローサイトメトリーを用いて形質導入した細胞の％を取得した後、形質導入した細胞の2つの値は、形質導入は、飽和でも低すぎもないれる希釈液に対応したもの、そのうちの計算のために選択されています。たとえば、次のように希釈ファクター10 -6利回り8.08パーセント細胞に感染、および希釈倍率10 -5は、感染した61.78パーセントの細胞が得られます。力価は、形質導入された細胞とその対応する希釈係数の値を用いて、式を適用することからレンダリングの値の平均です。この例では：
希釈係数10 -6ための力価=（8.08 / 100）は、10万×10 6 = 8.08をX・10 9 TU / mlの
希釈率10 -5 =（61.78 / 100）のための力価は×10 5 100,000 xは= 6.178・10 9 TU / mlの
平均= [（8.08 + 6.178）/ 2]・10 9 = 7.1・10 9 TU / mlの
重要なステップ3：定位注入。ここで説明する方法は、特定の場所へのLV定位導かれた配達の高力価の低いボリュームの使用に依存しています。このプロトコルで指定された定位座標は、C57 / BL6マウスのために確立されており、他のマウス系統には適さない場合があります。定位座標は、実験前に速いグリーンのような染料を使用して各株と年齢のために決定されるべきです。これを行うには、染料が注入され、マウスが犠牲にされた後、脳を抽出し、1 hrat -20℃のために凍結されています。脳が硬化されると、それは、注射部位の刃でスライスし、注射部位は、特定の実験の目的のために最適化されているかどうかを決定するために解剖顕微鏡下で観察することができます。
重要なステップ4：後生存時間。ポスト生存時間は、注射部位に応じて異なるであろう。長期生存時間は、脳組織が、より重要なのは、60日後に、RMSとOBで観察された細胞は、相対静止B1-NSCの誘導体である射出病変から回復することができます。側脳室への注射は、物理的にV-SVZに悪影響を及ぼすことはありません。したがって、15日の期間は、上衣細胞による導入遺伝子の発現を確実にするのに十分です。
重要なステップ5：ポスト固定倍。脳組織の過度の後固定は、パラホルムアルデヒドのような試薬の架橋活性に起因するいくつかの抗原のマスクを生成することができます。これらは、細胞構造を維持において優れているが、架橋がエピトープへの抗体結合を妨害することができるように、いくつかのタンパク質の抗原性を減少させることができます。抗原回復技術は、特に長い固定インキュベーション時間がある場合、又は架橋Fの割合が高い場合には、必要とされ得ますixativeが使用されます。代わりに、1時間の後固定の短い期間は、組織の構造を維持するだけでなく、抗原の検索手順を使用することなく、細胞内の良好な抗原性を確保するために私たちの経験で十分なことが証明されています。
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Disclosures
すべての操作はバイオセーフティーレベル2部屋で行われました。動物プロトコルは、バレンシア大学の倫理委員会によって承認され、すべての欧州指令63分の2010 / EUに準拠してありました。
Acknowledgments
私たちは、MJパロップと大学・デ・バレンシアのSCSIEの技術支援の助けを認めます。我々はまた、有用なコメントや原稿の議論のためアントニアFollenziに感謝します。フンダシオンBotinのによってサポートされている場合は、そのサンタンデール大学グローバル部門を通じてバンコ・サンタンデールによると、Generalitatのバレンシア（PROGRAMAプロメテオ、ACOMP、およびISIC）とMINISTERIOデエコノミアのy Competitividad（：SAF2011-23331、CIBERNED及びRETICターセルMINECO）からの助成金によって、 。この作品は、また、（260511- MINECO と欧州研究評議会（ERC）2012-STGからBFU2010-21823とRETICターセル助成金によってサポートされていました AC BM-P へのPD-HUMMODEL）。 MINECOのスペインFPIの交わりの受信者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-55 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 358126 | 25 mm x 89 mm |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | 13 mm x 51 mm |
| Ultracentrifuge adapters | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6-well plate | SPL | PLC-30006 | |
| 24-well plate | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm dish | SPL | PLC-20101 | 100 x 20 style |
| FACS tubes | Afora | DE400800 | 12 mm x 75 mm, 5 ml |
| Cup sterile FACS filter | BD | 340626 | 30 µm |
| Nitrocellulose filter | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm |
| Flow cytometer | BD | LSR Fortessa | Blue laser 488 nm |
| Steritop filter | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 µm |
| Reagents: | |||
| pMDLg/pRRE plasmid | Addgene | #12251 | Core packaging plasmid |
| pRSV.REV plasmid | Addgene | #12253 | Core packaging plasmid |
| pMD2G plasmid | Addgene | #12259 | Envelope plasmid |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid | Addgene | #12252 | Transfer vector plasmid |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | For HeLa cell culture |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | For 293T cell culture |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered | ||
| 2x HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530). | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x. |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100 | Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM. |
| Sodium pyruvate | Life technologies | 11360-039 | Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%. |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water. |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | H9268 | Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dH |
| Paraformaldehyde EM grade 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle. | |||
| Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | http://www.leicabiosystems.com/ |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| Syringe holder | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33 gauge syringe | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| Electric drill | Fine Science Tool | 98096 | |
| Thermal blanket | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, type C_AL01 |
| Shaver | Jata | MP373N | Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03. |
| Reagents: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | Comercial solution at 1 mg/ml. |
| Ketamine | Merial | Imalgene 500 | Comercial solution at 50 mg/ml |
| Medetomidina/ketamine mixture | Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia. |
| 0.9% saline solution | Braun | 13465412 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | Topical skin adhesive |
| HydroGel | Clear H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11 cm x 21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | Permanent lumocolor |
| Ophthalmic lubricant | SICCAFLUID | 0.5 g/dosis, carbomer 974P | |
| Povidone-iodine | Betadine | 694109.6 | 10% povidone-iodine |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| Equipment: | |||
| Automatic peristaltic pump | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V |
| Pump head | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor |
| Silicone tube | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | Platinum L/S 16 |
| Scalp vein set | Vygon V-green | 70246.05T | 25 G, 30 cm tube length |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Confocal microscope | Olympus | FluoView FV10i | |
| Hot plate | Tehtnica | SHP-10 | |
| Reagents: | |||
| Phosphate buffer (PB) | 0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4 | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Panreac | 141451.1211 | Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB. |
| Saline solution | 0.9% NaCl in dH2O | ||
| Superglue | LOCTITE | 767547 | |
| Sodium azide | Panreac | 122712.1608 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100 | |
| Normal goat serum | Millipore | S30-100 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Detergent |
| Anti-GFP rabbit antibody | ROCKLAND | 600-401-215 | Use at a 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular probes | A-21206 | Use at a 1:750 dilution |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | Mounting medium for fluorescent preparations |
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