Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إعداد وتحليل الضوئي المركبات الخلوية تحتوي على الذهب نانواعواد

Published: May 2, 2016 doi: 10.3791/53328
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 4, 1, 1
1Institute of Applied Physics, Italian National Research Council, 2Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences, University of Florence, Firenze, 3Department of Physics and Astronomy, University of Florence, Sesto Fiorentino, 4Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna

Abstract

نانواعواد الذهب جذابة لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية، مثل الاجتثاث ضوئي؛ ضوحراري والتصوير الضوئي من السرطان، وذلك بفضل الامتصاصية الضوئية المكثفة في نافذة الأشعة تحت الحمراء القريبة، وانخفاض السمية الخلوية والقدرة على منزل في الأورام. ومع ذلك، إيصالها إلى أورام لا يزال يمثل مشكلة. ويتكون هذا النهج المبتكر للاستغلال مع الأجسام الضامة المرتبطة الورم التي قد تكون محملة نانواعواد الذهب في المختبر. هنا، نحن تصف إعداد والتفتيش الضوئي المركبات الخلوية تحتوي على نانواعواد الذهب. يتم تعديل نانواعواد الذهب مضاد للفيروسات مع مركبات الأمونيوم الرباعية، من أجل تحقيق الشخصية الموجبة. في اتصال مع الضامة الفئران في أطباق بتري العادية، وتوجد هذه الجسيمات على الخضوع لامتصاص ضخمة إلى الحويصلات التقامي. ثم هي جزء لا يتجزأ هذه الخلايا في الهلاميات المائية biopolymeric، والتي تستخدم للتحقق من استقرار تحويل الضوئيمن الجزيئات يتم الاحتفاظ في إدماجهم في المركبات الخلوية. ونحن واثقون من أن هذه النتائج قد توفر إلهام جديد لتطوير استراتيجيات جديدة لتقديم الجسيمات plasmonic إلى أورام.

Introduction

على مدى العقد الماضي، وتلقى العديد من الأجسام plasmonic مثل نانواعواد الذهب، القذائف النانوية وقفص نانوي، اهتماما كبيرا للتطبيقات في مجال البصريات الطبية 1، 2، 3، 4. تتعارض مع nanospheres الذهب القياسية، هذه الجسيمات أحدث صدى في نافذة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد) ينص على أعمق اختراق البصرية من خلال الجسم وأعلى معدل تباين ضوئي على المكونات الذاتية 1. وقد أثارت هذه الميزة الفائدة للتطبيقات مبتكرة، مثل (PA) التصوير الضوئي والاجتثاث ضوئي؛ ضوحراري من السرطان. ومع ذلك، العديد من القضايا كبح اختراق السريري لهذه الجسيمات. على سبيل المثال، تفعيلها البصري يميل للحث على ارتفاع درجة الحرارة، وتعديل الأشكال الوظيفية نحو المزيد من التشكيلات كروية، مما يدفع photoinstability 5، 6، 7، 8 سوب>، 9. والمشكلة الأخرى التي تهيمن على النقاش العلمي هو تسليم النظامية الخاصة إلى أورام. على وجه الخصوص، نانواعواد الذهب الجمع بين الأحجام التي هي مثالية لتعم الأورام التي تعرض تعزيز النفاذية والاحتفاظ بهم وسهولة الاقتران مع تحقيقات محددة من علامات الخبيثة. لذلك، لا ينظر إعدادها لحقن مباشر في مجرى الدم كمشروع ممكنا 10، 11، 12، 13. ومع ذلك، لا يزال هذا الطريق إشكالية، مع معظم الجزيئات تصبح استولى عليها النظام وحيدات النوى بلعمية 10 و 11 و 12. وبالإضافة إلى ذلك، قلق آخر هو استقرار البصرية والبيوكيميائية للجسيمات بعد التداول خلال الجسم 14. عندما تفقد الجسيمات استقرارها الغروية والكلي، وخصائصها plasmonic وديناميات نقل الحرارة قد تعاني من اقتران plasmonic 15، 16 و 17 و 18 عبر المحموم.

وفي الآونة الأخيرة، برزت فكرة لاستغلال مع الأجسام الضامة المرتبطة ورم كما الذكية بديل 19، 20، 21. هذه الخلايا تحمل قدرة فطرية لكشف وتسود الأورام مع خصوصية عالية. لذلك، قد يكون منظور واحد لعزل هذه الخلايا من المريض، وتحميلها مع نانواعواد الذهبية في المختبر ثم ضخها مرة أخرى إلى المريض، بقصد استخدامها كوسائل الخلوية المسؤول عن التسليم. وتتمثل ميزة أخرى تتمثل في كسب مزيد من السيطرة على الاستقرار البصرية والبيوكيميائية للجسيمات، لأن واجهة البيولوجية من شأنه أن يتم بناؤها في المختبر. ومع ذلك، فإن أداء هذه المركبات الخلوية وكلاء النقيض البصرية في حاجة إلى تحليل نقدي.

في هذا العمل، ونحن تصف إعداد والقضايا الحرجة من cellulالمركبات AR تحتوي على نانواعواد الذهبية للتصوير السلطة الفلسطينية من السرطان. يتم تعديل نانواعواد الذهب مضاد للفيروسات مع مركبات الأمونيوم الرباعية 22، من أجل تحقيق الشخصية الموجبة التي من المتوقع أن تعزيز تفاعلها مع أغشية بلازمية 23 و 24. هذه الجسيمات تخضع لامتصاص فعال وغير محدد من معظم أنواع الخلوية، ونأمل دون التدخل من ذلك بكثير مع وظائف البيولوجية. يتم تحميل الضامة الفئران مع ما يصل إلى ما يصل إلى 200، 000 نانواعواد الذهب الموجبة في الخلية، والتي أصبحت محصورة داخل الحويصلات التقامي ضيقة. يجب أن تنشأ هذا التكوين القلق، بسبب التهديد من اقتران plasmonic وعبر المحموم داخل هذه الحويصلات. لذلك، هي جزء لا يتجزأ الضامة في الهلاميات المائية biopolymeric التي تحاكي الأنسجة البيولوجية، من أجل التحقق من أن معظم استقرار تحويل السلطة الفلسطينية من الجزيئات يتم الاحتفاظ في نقل من متوسط ​​النمو إلى الحويصلات التقامي. فعاليهوعملت معايير قياس البريد من أجل قياس استقرار تحويل السلطة الفلسطينية في ظل الظروف التي تهم فورية للتصوير السلطة الفلسطينية. يتم تعيين عتبة إعادة تشكيل في بداية جدا من عدم الاستقرار البصري بعد قطار من 50 نبضات الليزر مع معدل تكرار نموذجي من 10 هرتز.

ونحن واثقون من أن هذه النتائج قد توفر الزخم لتطوير استراتيجيات جديدة لتقديم الجسيمات plasmonic إلى أورام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم التعبير عن جميع تركيزات نانواعواد الذهب من حيث molarities الاتحاد الافريقي الاسمية. للمقارنة مع غيرها من الأعمال، لاحظ أن 1 M الاتحاد الافريقي يعادل تقريبا 20 ميكرومتر نانواعواد الذهب، في حالتنا.

1. إعداد الموجبة الذهب نانواعواد

ملاحظة: يبدأ الأسلوب مع تركيب بروميد سيتريمونيوم (CTAB) نانواعواد الذهب -capped من تخفيض بالحفز من HAuCl 4 مع حمض الأسكوربيك، وفقا لقدمه Nikoobakht وآخرون 25 وتكييفها وفقا لراتو وآخرون 26 من البروتوكول.. ثم يتم تعديل هذه نانواعواد الذهبية من أجل كسب المزيد من توافق مع الحياة وتقارب للأغشية بلازمية، من خلال مزيج من البولي ايثيلين جلايكول جدائل 10 و 11 و 27 و 28 و 22 مركبات الأمونيوم الرباعية.

  1. تنقية 24 مل نانواعواد الذهبية توج CTAB-في concentratioن من 450 ميكرومتر الاتحاد الافريقي قبل دورتين من الطرد المركزي (12000 x ج، 30 دقيقة)، والصفق. تأكد من أن نسبة من حجم القتلى إلى حجم الأولي حوالي 1/200 أو أقل لجميع الخطوات الطرد المركزي في هذا البروتوكول. استخدام 500 ميكرومتر مائي CTAB كحل الغسيل وأخيرا نقل الجسيمات إلى 6 مل 100 ملي العازلة خلات في درجة الحموضة 5 تحتوي على 500 ميكرومتر CTAB و 0.005٪ (ت / ت) بوليسوربات 20.
  2. إضافة 30 ميكرولتر 10 ملي مائي ألفا ميثوكسي-أوميغا-mercapto بولي (جلايكول الإثيلين) (MW ~ 5000) وتترك لتتفاعل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 30 ميكرولتر 100 ملم (11 Mercaptoundecyl) - N، N، N بروميد -trimethylammonium في سلفوكسيد ثنائي ميثيل وترك في راحة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية.
  4. المقبل، إضافة 18 مل 0.005٪ (ت / ت) بوليسوربات 20 في المياه وتنقية هذه الجسيمات من قبل أربع دورات من الطرد المركزي (12000 x ج، 30 دقيقة)، والصفق. استخدام 0.005٪ (ت / ت) بوليسوربات 20 في المياه كحل الغسيل وأخيرا نقل الجسيمات إلى 2.4 مل العقيمة برنامج تلفزيوني في درجة الحموضة7.4. تركيز الاسمي النهائي من الذهب 4.5 ملم.

2. تحميل الفئران الضامة مع نانواعواد الذهب

  1. استخدام الوحيدات خط الخلية البلعمي / تستكمل J774a.1 وDMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني، 1 ملم الجلوتامين، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين كما مستنبت. لوحة 5 × 10 5 خلايا في أربعة أطباق بتري قطرها 60 ملم والسماح لها أن تنمو لمدة 24 ساعة، وذلك ليتم subconfluent في وقت مفرزة (راجع الخطوة 2.2).
    1. في جميع أنحاء بروتوكول، والحفاظ على الخلايا تحت ظروف التربية القياسية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، 95٪ الهواء والرطوبة النسبية 100٪). استخدام مجلس الوزراء تدفق الصفحي ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة لمعالجة الخلايا.
  2. بعد 24 ساعة، تحميل الخلايا مع نانواعواد الذهب الموجبة وإعدادهم لتكون جزءا لا يتجزأ في الأفلام الشيتوزان:
    1. من أجل السماح للجسيمات التي سيتم تناولها من قبل الخلايا، إضافة قسامة من 4.5ملي الاتحاد الافريقي نانواعواد الذهب الموجبة في برنامج تلفزيوني في كل طبق بيتري، وذلك لتحقيق تركيز النهائي من 100 ميكرومتر الاتحاد الافريقي. ترك أطباق بتري في الحضانة لمدة 24 ساعة.
    2. التالي، ومراقبة الخلايا تحت المجهر الضوئي لتأكيد أوضاعهم جيدة والتحميل. يجب أن الخلايا تظهر مورفولوجية وضعها الطبيعي وعدد من الحويصلات الخلايا المظلمة. فصل الخلايا عن طريق مكشطة، دمج تلك من اثنين من أطباق بتري، من أجل تحقيق قدر مناسب من الخلايا للخطوات التالية (على الأقل 2 × 10 6 خلايا)، وأجهزة الطرد المركزي منهم (120 x ج، 6 دقيقة) للقضاء على أي يزيد من نانواعواد الذهب الموجبة. بيليه الخلوية ينبغي أن ننظر أسود تقريبا.
    3. تعليق بيليه في 2 مل برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا عن طريق استخدام غرفة Bürker. الطرد المركزي تعليق يحتوي على 2 × 10 6 خلايا (120 x ج، 6 دقيقة)، وإصلاح بيليه في 2 مل 3.6٪ (ث / ت) الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، وغسل هذا بيليه ثلاث مرات من قبل centrifugatأيون (120 x ج، 6 دقيقة) من أجل إزالة تثبيتي. استخدام برنامج تلفزيوني كحل الغسيل.

3. الغرز من الضامة في الشيتوزان الأفلام

ملاحظة: خصائص غريبة من الشيتوزان 26، 27، 28، تستغل 29 إلى إنتاج الخيالات الجزيئية الحيوية التي تحتوي على الضامة ملطخة نانواعواد الذهب الموجبة. وفيما يتعلق الهلاميات المائية الأخرى مثل الاغاروز، الشيتوزان تمكن الأفلام التي هي أقوى بكثير وأرق، وهو أمر حاسم بالنسبة للسلطة الفلسطينية المجهر 6. ويتم تصنيع هذه الخيالات وفقا للبروتوكولات السابقة 29 و 30 و 31 مع بعض التعديلات على النحو المنصوص عليه في ما يلي 30.

  1. إعداد المحمضة (الرقم الهيدروجيني 4.5، التي تم الحصول عليها عن طريق إضافة حمض الخليك) ولزج 3٪ (ث / ت) منخفض الوزن الجزيئي الشيتوزان (متوسط ​​MW 120 كيلو دالتون) حل، ومزجها جيدا والسماح لها التجانس لمدة 24 ساعة على 40 درجة مئوية.
  2. بعد ذلك، مزيج الضامة الفئران التي تحتوي على نانواعواد الذهب الموجبة (2 × 10 6 خلايا) مع 500 ميكرولتر من حل الشيتوزان.
  3. من أجل الحصول على ~ 50 ميكرون الأشباح سميكة، صب 250 ملغ من الخليط في قوالب 1.91 البوليسترين سم 2 وتركهم تحت تيار النيتروجين لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، وعلاج هذه العينات مع 500 ميكرولتر 1 م هيدروكسيد الصوديوم، من أجل حمل عبر ربط، وشطف لهم مع 10 مل من الماء عالى النقاء.

4. اختبار للاستقرار الضوئي التحويل

ملاحظة: يتم التحقيق في استقرار تحويل السلطة الفلسطينية عن طريق التجارب السلطة الفلسطينية مع الإعداد الصنع الموضحة في المرجع 6.

  1. تعليق فيلم الشيتوزان تحتوي على الضامة في الماء DI، على سبيل المثال عن طريق استخدام حامل البلاستيك مغمورة في طبق بيتري، وذلك للحفاظ على مسافة ~ 5 ملم من الجزء السفلي من لوحة. وضع هذه اللوحة على مرحلة XY المصغرمن أجل السيطرة على الموقف العينة.
  2. تركيز شعاع الليزر مع 5 ~ مدة NSEC النبض في الرنين مع الفرقة plasmonic طولية من الأقطاب النانوية الذهب (على سبيل المثال، من المذبذب حدودي البصرية التي تضخها التوافقي الثالث من بدون تاريخ، تحولت س: YAG ليزر مع نطاق الطول الموجي من 400 - 2500 مدة نانومتر والنبض من 5 NSEC) عمودي على سطح الفيلم مع بقعة قطرها ~ 300 ميكرون.
    1. وضع المخفف أمام خروج الليزر لضبط فلوينس الليزر واستخدام الخائن شعاع للتركيز جزء من شعاع الليزر إلى متر الطاقة (على سبيل المثال، للكشف عن كهربي حراري)، ورصد تقلبات فلوينس. الحفاظ على فلوينس البصرية أدناه ~ 1 ميغا جول / سم 2 في النبض خلال المحاذاة. استخدام المناسبة نظارات السلامة الليزر كلما الليزر على.
  3. وهو تراجع محول بالموجات فوق الصوتية (نطاق الترددات من 1 - 20 ميغاهيرتز) في طبق بيتري ~ 2 مم من على سطح الفيلم، وضبط الموقف من خلال استخدام الترجمات المصغرومراحل التناوب لتعظيم إشارة السلطة الفلسطينية المنبعثة من الفيلم.
  4. تحديد فلوينس التحقيق F LO أن لا ضرر من عينة 6:
    1. أشرق نقطة عشوائية من العينة في فلوينس حوالي 1 ميغا جول / سم 2 في النبض للا يقل عن 500 البقول. لكل نبضة، والحصول على إشارة السلطة الفلسطينية المقابلة من محول بالموجات فوق الصوتية والليزر فلوينس من الطاقة متر مع الذبذبات. تسمية متوسط ​​فلوينس كما محاكمة F LO.
    2. حساب شدة إشارة السلطة الفلسطينية ليصل إلى السعة من الذروة إلى الذروة بوصفها وظيفة من عدد النبض. من أجل موازنة التقلبات كثافة الليزر، وتطبيع سعة كل إشارة السلطة الفلسطينية لنسبة فلوينس الخاصة لمحاكمة F LO. تحليل اتجاه من شدة السلطة الفلسطينية تطبيع بوصفها وظيفة من عدد النبض وتحقق الاستقرار على مر الزمن.
    3. في حالة من عدم الاستقرار، كرر الخطوات من 4.4.1 إلى 4.4.3 مع انخفاض قيمة من F LO محاكمة F LO ارتفاع بنسبة ~ 10٪، حتى تنشأ فقدان الاستقرار. تعيين التحقيق فلوينس F LO كثاني أعلى قيمة للمحاكمة F LO أن يضمن الاستقرار.
  5. قياس إعادة تشكيل فلوينس عتبة:
    1. اختيار نقطة عشوائية آخر من العينة وتحقيق متوسط ​​كثافة السلطة الفلسطينية (I LO أ) أكثر من 500 نبضة في F LO.
    2. تعيين فلوينس الاسمي أكبر من F LO وتقديم 50 البقول. تسمية متوسط ​​فلوينس على أنها غير شامل F.
    3. تحقيق متوسط ​​السلطة الفلسطينية الكثافة (I LO ب) أكثر من 500 نبضة في F LO مرة أخرى. حساب نسبة R = I LO ب / I LO أ. قيمة R تحت الوحدة يعطي دليلا على التغيير لا رجعة فيه من الخصائص البصرية للعينة.
    4. استخدم مرحلة XY المصغر لتحريك الفيلم وتغيير بوينطن من العينة عشوائيا. كرر الخطوات من 4.5.1 إلى 4.5.4 مع قيم مختلفة من F غير شامل، وذلك لاتخاذ بعض قيم R أدناه، حول وفوق وحدة وطنية. 15 نقطة معقولة.
    5. مؤامرة R بوصفها وظيفة من غير شامل F وتحديد عتبة إعادة تشكيل فلوينس F عشر كما أن قيمة عندما يبدأ R تختلف من واحد وراء عدم اليقين الإحصائي. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، يظهر جدوى المركبات الخلوية تحتوي على نانواعواد الذهبية للتصوير السلطة الفلسطينية من سرطان جنبا إلى جنب مع نتائج نموذجية من البروتوكول.

الصور تيم في الشكل رقم 1 تظهر مظهر المعتاد للجسيمات بعد الخطوة 1 و المركبات الخلوية بعد الخطوة 2. يوصف إعداد الجزيئات والخلايا للتصوير تيم مكان آخر (17). نانواعواد الذهب الموجبة تخضع لتراكم هائل في الضامة، التي تحافظ على التشكل وضعها الطبيعي. تم العثور على جزيئات محصورا داخل الحويصلات التقامي ضيقة.

الشكل 2A يعرض صورة انتقال البصرية الضامة التي تحتوي على نانواعواد الذهب الموجبة وتفرقوا في شبحا الشيتوزان بعد الخطوة 3. كما ثبت من خلال هذه صورة مجهرية، وإدراجها في هيدروجيل الشيتوزان لا لffect التشكل الخلوي. وخلايا متناثرة جيدا في جميع أنحاء العينة. ضوابط الأفلام الشيتوزان تحتوي على نانواعواد الذهب دون الخلايا متجانسة. ويوضح الشكل 2B أن الفرقة plasmonic نموذجية من نانواعواد الذهب يتم الاحتفاظ عندما يتم أخذ جزيئات من قبل الضامة، بما يتفق مع الأعمال السابقة لدينا 14، 32. لذلك، والآثار مثل اقتران plasmonic على الفصل في الحويصلات التقامي وامتصاص التفاضلية من الجسيمات مع حجم وشكل مختلف المتعايشة في الغروانية polydisperse 28، 33 لا تلعب دورا كبيرا في هذه البروتوكولات. الشكل 2B يثبت أيضا جدوى من الشيتوزان باعتبارها الوهمية البصرية.

ويبين الشكل 3 اتجاه R بوصفها وظيفة من غير شامل F قياسها وفقا للخطوة 4 و يعطي فكرة عن البيانات والتحليل المطلوبة لdetermination من ال F كما في الخطوة 4.5.5. تم العثور على عشر F لتكون (11 ± 1) ميغا جول / سم 2 في هذا المثال. أعطت قياسات السلطة الفلسطينية على هذه العينة إشارات مع إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) أكبر من 20 عندما بمعدل متوسط ​​أعلى من 500 نبضة في عدد قليل من ميغا جول / سم 2، والتي توفر دقة عالية لتحقيق الاستقرار لتحويل السلطة الفلسطينية من المركبات الخلوية.

الشكل 1
الشكل 1. الموجبة نانواعواد الذهب والضامة توصيف الطبيب: (650 × 500) نانومتر 2 صورة تيم من نانواعواد الذهب وتصنيعه؛ ب، ج، د: على التوالي (13 × 8.6) ميكرون 2، (2.3 × 1.7) ميكرون 2 و(870 × 650) نانومتر 2 صورة تيم الضامة تعامل مع نانواعواد الذهب الموجبة. مظهرالجسيمات في لوحة د يتأثر ميلهم في الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الشيتوزان الفيلم توصيف الطبيب: نقل صورة بصرية الضامة التي تحتوي على نانواعواد الذهب الموجبة وتفرقوا في شبحا الشيتوزان ب: الأطياف الانقراض البصرية الأشباح الشيتوزان تحتوي على نانواعواد الذهب دون الخلايا (خط أسود خالص، عينة السيطرة) والضامة التي تحتوي على الذهب نانواعواد (كسر خط أحمر). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

<IMG بديل = "الشكل 3" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53328 / 53328fig3highres.jpg" العرض = "350" />
الشكل 3. الخلوي المركبات صمود. نسبة R من شدة أنا LO التي اتخذت بعد وقبل التشعيع في كل F مريض بالحب مقابل F مريض بالحب. أشرطة الخطأ تنشأ من تقلبات إشارة إلى F LO. يتم استخراج عتبة إعادة تشكيل من هذه البيانات كما يقع R تحت الوحدة. يخدم خط أحمر الصلبة كدليل للعين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فكرة لاستهداف الضامة المرتبطة ورم يبرز بوصفه مفهوم قوي لمكافحة السرطان 34، 35، 36. هنا، بدلا من تدميرها، يتم تجنيد هذه الخلايا كما المركبات الخلوية لجلب نانواعواد الذهب في الورم، من خلال استغلال مع الأجسام بهم. هذا المنظور يتطلب تصميم مدروس من الجسيمات، اندماجها في الخلايا وتوصيف بهم. لقد وجدنا أن صمود الضامة الفئران محملة نانواعواد الذهب الموجبة لا تعاني من الحبس الجسيمات داخل الحويصلات التقامي، مما يعني أن اقترانها plasmonic وعبر المحموم ليست حرجة. نحن نفترض أن خيوط الربط والإصابة من الأشكال التي هي خارج الرنين، مثل nanospheres الذهب، تمنع الجزيئات للحصول على اتصال ضيقة جدا، وهي عبارة عن بأقطار من 17 (حوالي 10 نانومتر) واحد طول نشر الحرارية (حوالي 30 نانومترفي 5 NSEC) لاقتران plasmonic وعبر المحموم، على التوالي.

بروتوكول مبتكرة فيما يتعلق بأساليب القائمة في تصميم الجزيئات والتحقيق في صمود بهم. تصميم نانواعواد الذهب وفقا لالخطوة 1 يجمع بين المراقبة التي يقوم بها Vigderman وآخرون. 22 أن الرباعية مركبات الأمونيوم قادرة على قيادة امتصاص ضخمة من نانواعواد الذهب إلى الحويصلات التقامي ومفهوم تلك الخلية اختراق وكلاء مع لمحة الموجبة 24 و 37 مايو تكون جزءا لا يتجزأ ضمن PEG قصف 38 وتبقى وظيفية، في حين كسب الاستقرار الغروية وتوافق مع الحياة 28. في الواقع خطوة 1 تشبه الطريقة التي يوان وآخرون. 38، مع استبدال الخلايا اختراق الببتيدات مع مركبات الأمونيوم الرباعية أصغر وأرخص. مع هذه التعديلات، نانواعواد الذهب الموجبة هي متعددة الوظائف ومستدامة. وبما أن هذه particlوتهدف وفاق وكلاء النقيض للتصوير السلطة الفلسطينية، تحقيقا للسلطة الفلسطينية هو المثالي لاختبار الميزات الوظيفية. قياس استقرار تحويل السلطة الفلسطينية في تعريف عتبة إعادة تشكيل في الخطوة 4 كمي وقابلة للتكرار، والتي هي ميزات فريدة من نوعها في إطار الأدبيات العلمية. الى جانب ذلك، نلاحظ أن هذا الأسلوب لا يتطلب معايرة المعدات السلطة الفلسطينية.

وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تلفيق الأفلام الشيتوزان لفحص المركبات الخلوية من حيث كفاءتها وعوامل التباين لتصوير السلطة الفلسطينية. الشيتوزان هو البوليمر الحيوي سلسلة خطية تضم الجلوكوزامين وN -acetyl الجلوكوزامين بقايا انضمت معا عن طريق السندات 1،4-غليكوزيدية. بعض الملامح الفيزيائية من الشيتوزان، مثل حجمها المسام والمسامية والخواص الميكانيكية، فضلا عن تنوعها والبراعة، وجعلها خيارا مثاليا لتصنيع الهلاميات المائية في شكل أفلام رقيقة أو أغشية مسامية 29، 39، 40. وعلاوة على ذلك، العمود الفقري السكاريد الشيتوزان مشابه هيكليا لالجليكوسامينوجليكان، وعنصرا رئيسيا من عناصر المصفوفة خارج الخلوي من الأنسجة الضامة، الذي شجع على استخدامه لالمحاكاة البيولوجية الهندسة والسقالات الداعمة للخلية 41. وعموما، الهلاميات المائية الشيتوزان يحمل الرجوعية الحرارية ومرنة أن تكون ممثلة من النسيج الضام 29، 41، 42، والذي يعتبر مثاليا للاختبارات السلطة الفلسطينية. وينبغي الحرص على تحقيق أفلام مع سمك مناسب (50 ميكرون)، وانخفاض تعكر البصرية والتجانس جيدة. لاحظ أن جرعات تعطى في الخطوة 3 تم الأمثل. تعليق لزج الضامة الفئران في الشيتوزان ينبغي أن تكون مختلطة مع الاجتهاد وفقا للخطوة 3.2. مع هذه التعليمات، وقد تم بالفعل استخدام هذه الأفلام لمقارنة استقرار تحويل السلطة الفلسطينية من نانواعواد الذهب من مختلف حجم 6.

Possiوتشمل التعديلات بلي من بروتوكول إعداد الأقطاب النانوية الذهب الموجبة والمركبات الخلوية في الخطوات 1 و 2. الأسلوب في الخطوة 1 قد تكون عرضة للتحسينات تدريجية، على سبيل المثال، عن طريق استبدال الخلية اختراق وكيل أو طول PEG خيوط الخ، وذلك للحد من أي تدخل في علم وظائف الأعضاء من الضامة المرتبطة الورم. قد يكون استخدام بروابط التي هي محددة لالضامة خيار 43. غيرها من المعالم التي تؤثر على امتصاص جزيئات تشمل الحجم والشكل 33 وطلاء من غير العضوية. على سبيل المثال، قذيفة من السيليكا قد يعطي مزيج من استيعاب ارتفاع 44 واستقرار بصري ضد التجميع 17 والسلطة الفلسطينية الاستقرار 7، على حساب المزيد من التطور والمزيد من المواد الأجنبية. نظن أن مسار endosomal من استيعاب قد يكون لها تأثير مشترك 33، 43، 44 45. فحص نقدي للخلايا من الخطوة 2 يجري وأفضل ترتيب النقيض البصرية، والسلامة والنشاط الكيميائي في المختبر والمجراة قد لا تزال بحاجة إلى تعديل جرعة من الجسيمات plasmonic من حيث التركيز ومدة الحضانة. على الرغم من أن مورفولوجيا الخلايا والأدلة الأولية في أيدينا تشير إلى السمسة منخفضة، والتحقيق في هذه المعايير هو خارج نطاق هذا العمل. سوف منظور آخر يتمثل في إعادة إنتاج الخطوة 2 مع خلايا أخرى من الجهاز المناعي 46 و الخلايا الأولية، والتي قد يتم اختياره على أساس كل حالة على حدة. في الواقع، نحن التكهن بأن فكرة أن تعدل من امتصاص الجزيئات مع إمكاناتهم حركي كهربي هو الأكثر تنوعا.

وتشمل القيود المفروضة على بروتوكول الحاجة إلى استخدام خلايا ثابتة بدلا من الخلايا الحية، لأن الوصفات الطبية في الخطوة 3 تتعارض مع الحفاظ على سلالجدوى lular. وتتعلق قيود أخرى على الحاجة إلى وجود SNR كاف في تقرير لجنة التحقيق فلوينس في الخطوة 4.4، وهو ما يترجم إلى مزيج كافية لإمتصاص البصرية وصمود للفيلم.

في الختام، التي وصفناها بروتوكول مبتكرة لإعداد وإجراء توصيف وظيفي المركبات الخلوية التي الإمكان عوامل التباين للتصوير الضوئي. لقد وجدنا أن إدخال الذهب نانواعواد في الضامة الفئران لا يؤثر سلبا على صمود بهم. محور عملنا الحالي هو على علم وظائف الأعضاء من هذه الخلايا، مع إيلاء اهتمام خاص لحيويتها والنشاط الكيميائي. في المستقبل، يجب اختبار هذه الطريقة للتحقيق في إعداد المركبات الخلوية المختلفة التي تحتوي على حلول مختلفة من عوامل التباين الضوئي. التحقيق السلطة الفلسطينية قد يخدم أيضا لاختبار targetability من عوامل التباين الضوئي للخلايا الخبيثة في المختبر،دون استخدام المركبات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل جزئيا REGIONE توسكانا والجماعة الأوروبية في إطار فقاعة ERANET مشاريع + LUS وBI-تري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexadecyltrimethylammonium bromide Sigma-Aldrich H6269 To synthesize gold nanorods
Gold(III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918 To synthesize gold nanorods
Silver nitrate Sigma-Aldrich S6506 To synthesize gold nanorods
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960 To synthesize gold nanorods
Sodium borohydride Sigma-Aldrich To synthesize gold nanoseeds
MeO-PEG-SH Iris Biotech PEG1171 To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da.
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750 To PEGylate gold nanorods
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide Sigma-Aldrich 733305 To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855 To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P2287 To centrifuge PEGylated gold nanorods
PBS Lonza BE17-516F To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells
J774a.1 ATCC TIB-67 Monocyte/macrophage murine cell line
DMEM Lonza BE12-707F Cell culture medium
FBS Lonza DE14-801F To be added to cell culture medium
L-glutamine Lonza BE17-605E To be added to cell culture medium
Penicillin/streptomycin Lonza DE17-602E To be added to cell culture medium
Petri dish NEST 705001 Cell culture dish
Cell scraper EuroClone ES7018 To detach cells
Formaldehyde Fluka 47630 To fix cells
Chitosan, low molecular weight Sigma-Aldrich 448869 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da.
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 306576 To insolubilize chitosan and generate the hydrogel
Polystyrene cell culture plates NEST 702011 Used as molds to fabricate chitosan hydrogels
Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser Continuum, Santa Clara, USA Surelite OPO plus Source of optical excitation for photoacoustic tests
Pyroelectric detector  Gentec, Quebec, Canada QE8SP To monitor optical fluence for photoacoustic tests
Pre amplified needle hydrophone Precision Acoustic, Dorset, UK Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range To measure photoacoustic signals

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies. J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).
  2. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).
  3. Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).
  4. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
  5. Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats. Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).
  6. Cavigli, L., et al. Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).
  7. Chen, L. -C., et al. Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010 (2010).
  8. Ratto, F., et al. CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films. J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).
  9. Mercatelli, R., et al. Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope. Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).
  10. Von Maltzahn, G., et al. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas. Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).
  11. Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice. ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).
  12. Huang, X., et al. A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands. ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).
  13. Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).
  14. Centi, S., et al. In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections. J. Nanobiotechnology. 12, 55 (2014).
  15. Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model. J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).
  16. Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries. Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).
  17. Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods. J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).
  18. Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles. Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).
  19. Choi, M. R., et al. A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors. Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).
  20. Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells. Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).
  21. Yang, T. D., et al. Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells. J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003 (2012).
  22. Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).
  23. Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).
  24. Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery. Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).
  25. Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method. Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).
  26. Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods. J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).
  27. Niidome, T., et al. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications. J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).
  28. Tatini, F., et al. Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods. J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).
  29. Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives. Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).
  30. Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding. J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).
  31. Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. Graphene as a photothermal switch for controlled drug release. Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).
  32. Ratto, F., Witort, E., et al. Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells. Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).
  33. Chithrani, D. B. Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures. Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).
  34. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).
  35. Mantovani, A., Allavena, P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).
  36. Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer. Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).
  37. Oh, E., et al. Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size. ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).
  38. Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance. J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).
  39. Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. Multi-membrane hydrogels. Nature. 452, 76-79 (2008).
  40. Matteini, P., et al. Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species. Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).
  41. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  42. Kennedy, L. C., et al. T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo. Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283 (2011).
  43. Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).
  44. Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).
  45. Ding, H., et al. Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging. J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).
  46. Esposito, G., et al. et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study. Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 111، والجسيمات Plasmonic، نانواعواد الذهب، الشيتوزان والمركبات الخلوية، الضامة، المجهر الضوئي، صمود
إعداد وتحليل الضوئي المركبات الخلوية تحتوي على الذهب نانواعواد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cavigli, L., Tatini, F., Borri, C.,… More

Cavigli, L., Tatini, F., Borri, C., Ratto, F., Centi, S., Cini, A., Lelli, B., Matteini, P., Pini, R. Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods. J. Vis. Exp. (111), e53328, doi:10.3791/53328 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter