Abstract
金纳米棒是为一系列的生物医学应用，如光热消融和癌症的光声成像的吸引力，这要归功于在近红外窗口，低细胞毒性和潜在的对置成肿瘤其强烈的光学吸光度。然而，他们交付的肿瘤仍然是一个问题。一种创新的方法包括可装在体外金纳米棒肿瘤相关巨噬细胞的向性的开采。在这里，我们描述的制备方法和含有金纳米棒的细胞车辆的光声检查。 PEG化的金纳米棒被修改与季铵化合物，以实现一种阳离子轮廓。与普通培养皿小鼠巨噬细胞的接触，这些粒子被发现发生巨大摄取进入内吞囊泡。然后将这些细胞被包埋在生物聚合物水凝胶，这是用来验证光声转换的稳定性的颗粒被保持在其纳入蜂窝车辆。我们相信，这些结果可能为新型的发展战略提供等离子粒子肿瘤新的灵感。
Introduction
在过去十年中，各种电浆颗粒如金纳米棒，纳米壳和纳米笼，在生物医学光学1，2，3，4已受到相当关注的应用。在与标准的金纳米球方差，这些较新的粒子共振在于提供用于通过主体最深光学穿透并用内源性组分1最高光学对比度的近红外（NIR）窗口。这个特性已引起对创新应用，例如光声（PA）的成像和癌症的光热消融的兴趣。然而，有几个问题限制这些颗粒的临床渗透。例如，它们的光学活性趋于诱导它们过热和修改他们的功能性形状朝向多个球形轮廓，其驱动一个光稳定性5，6，7，8 SUP> 9。占主导地位的科学辩论的另一个问题是他们的全身输送到肿瘤。尤其是金纳米棒相结合，是理想渗透了该显示增强通透性和保留和易用性恶性肿瘤标志物的特异性探针结合的肿瘤大小。因此，他们对直接注射到血流中制备被认为是一个可行的方案10，11，12，13。然而，这条路线仍然是个问题，其中大部分粒子变得由单核吞噬细胞系统10，11，12捕获。此外，另一个问题是，通过主体14循环后的粒子的光学和生化稳定性。当颗粒失去胶体稳定性和聚集，其等离子的特点和传热动态可能从电浆子耦合15受苦， 16，17和交叉过热18。
最近，利用肿瘤相关巨噬细胞的趋性的概念已经成为一个聪明的替代19，20，21。这些细胞持有检测和高特异性的肿瘤普遍存在一种与生俱来的能力。因此，一个角度看可能是这些细胞从病人隔离， 与体外金纳米棒装载它们，然后注入回到患者，以意向使用它们作为负责递送的细胞的车辆。另一个优点是获得对颗粒的光学和生化稳定性更多的控制，因为它们的生物界面将在体外构建。尽管如此，这些细胞汽车作为光造影剂的性能需要一个批判性的分析。
在这项工作中，我们描述了准备和cellul的关键问题含有金纳米棒为癌症的PA的成像芳车辆。 PEG化的金纳米棒被修改与季铵化合物22，以实现该预期以促进与血浆膜23,24及其相互作用的阳离子分布。这些颗粒进行有效和非特异性摄取大部分细胞种类，希望不受外界干扰太多与他们的生物学功能。小鼠巨噬细胞装载有高达每细胞多达200，000阳离子金纳米棒，这成为紧内吞囊泡内密闭。这种配置应该出现的问题，因为这些囊泡内电浆耦合和交叉过热的威胁。因此，巨噬细胞被嵌入模仿生物组织生物聚合物水凝胶，以验证大多数颗粒PA转化的稳定性被保持在从生长培养基转移到内吞囊泡。有效实现了È测量标准，以便测量的PA转化为PA的成像直接兴趣的条件下的稳定性制定。一个重塑阈值设置在光不稳定性的非常发病50的激光脉冲10赫兹的典型重复率一个序列后。
我们相信，这些结果可能为新的发展战略，以实现等离子粒子肿瘤提供动力。
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Protocol
注：金纳米棒的全部浓度是名义上金摩尔浓度表示。为与其它工作相比较，注意，1M的金大致相当于20μM的金纳米棒，在我们的情况。
1.阳离子金纳米棒的制备
注意：该方法开始于西曲溴铵（CTAB）加帽的金纳米棒通过用抗坏血酸自催化还原氯金酸4的合成，根据根据Ratto 等人 26通过Nikoobakht 等 25介绍，并适于协议。然后这些金纳米棒是为了获得更多的生物相容性和亲和性血浆膜，由聚乙二醇的组合改性导线束10，11，27，28和季铵化合物22。
- 净化24毫升CTAB皑皑的金纳米棒在concentratio通过离心的两个周期（12,000 xg离心，30分钟）和倾析450微米的Au的n个。确保死体积至初始体积的比例大约是1/200或更低在这一协议的所有的离心步骤。使用500μM的水溶液CTAB作为洗涤溶液，并在含有500μM的CTAB和0.005％（体积/体积）聚山梨酯20的pH 5的颗粒最后转移到6毫升的100mM乙酸盐缓冲液。
- 添加30微升10毫摩尔含水的α-甲氧基ω-巯基聚（乙二醇）（MW〜5000），并离开在37℃下30分钟以发生反应。
- 添加30微升100mM（11-Mercaptoundecyl） - N，N，N-三甲基溴化物在二甲基亚砜和静止在37℃下放置24小时。
- 接着，通过离心分离的四个周期（12,000 xg离心，30分钟）和倾析的水加18毫升0.005％（体积/体积）聚山梨醇酯20和纯化这些颗粒。在水使用0.005％（体积/体积）聚山梨醇酯20作为洗涤溶液并在pH颗粒最后转移到2.4毫升无菌PBS7.4。黄金最终标称浓度为4.5毫米。
2.小鼠巨噬细胞的装载与金纳米棒
- 使用单核细胞/巨噬细胞细胞系J774A.1和DMEM补充有10％胎牛血清，1 2mM谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素的培养基。板5×10 5个细胞在60mm直径四个培养皿中，并允许他们生长24小时，以便在分离的时间被亚汇合（见步骤2.2）。
- 整个协议，保持标准培养条件下（37℃，5％CO 2，95％空气和100％相对湿度）下的细胞。使用层流柜和适当的个人防护装备操纵细胞。
- 24小时后，装入阳离子金纳米棒的细胞，并准备他们被嵌入到壳聚糖膜：
- 为了让由细胞吸收的颗粒中，添加4.5等分试样毫凹阳离子金纳米棒在PBS到每个培养皿，从而达到100μM的Au中的最终浓度。留在孵化培养皿24小时。
- 接着，观察在光学显微镜下的细胞以确认其良好的条件和上载。细胞应表现出自己的正常形态和一些深色的细胞内囊泡。用刮刀分离细胞，合并那些来自两个培养皿中，以实现细胞的合适量为以下步骤（至少2×10 6个细胞），并离心它们（120 XG，6分钟），以消除任何多余的阳离子金纳米棒。该细胞团看起来应该几乎是黑色的。
- 暂停于2ml PBS中沉淀并通过使用Bürker室的细胞计数。离心机含有2×10 6个细胞（120 XG，6分钟），并固定其沉淀在2ml 3.6％（重量/体积）在PBS中的甲醛在室温下十分钟悬浮液。最后，通过centrifugat洗此沉淀三次离子（120 XG，6分钟）以除去固定液。用PBS洗涤液。
3.埋入巨噬细胞的成壳聚糖膜
注：壳聚糖26，27，28的特殊属性，29用来生产含阳离子金纳米棒染色的巨噬细胞仿生幻影。相对于其它的水凝胶诸如琼脂糖，壳聚糖使薄膜是强得多和更薄，这是用于PA显微镜6的关键。这些体模的制造是按照以前的协议29，30，31与作为规定在以下30一些修改进行。
- 制备酸化（pH 4.5，通过加入乙酸获得）和粘性3％（重量/体积）的低分子量脱乙酰壳多糖（平均分子量120 kDa）的溶液，充分混合，并让它在40℃均化24小时。
- 接着，混合含阳离子金纳米棒（2×10 6个细胞）用500μl壳聚糖溶液的鼠巨噬细胞。
- 为了获得〜50微米厚的幻影，倒入250毫克混合物的成1.91厘米2聚苯乙烯模具和离开他们在氮气流下24小时。此后，将这些样品与500微升的1M NaOH，以诱导交联，并用10ml超纯水的冲洗。
4.光声转换的稳定性测试
注：PA转化的稳定性由在参考文献6中描述的PA实验用自制的设置装置的影响。
- 通过使用塑料夹持器浸渍在培养皿的暂停含有在DI水中的巨噬细胞壳聚糖薄膜，例如，以保持从板的底面〜5mm的距离。将这个盘到微米级的XY工作台为了控制样本位置。
- 聚焦用〜5纳秒脉冲持续时间的激光束在共振与金纳米棒（ 例如纵向电浆频带，从通过Q开关Nd的三次谐波泵浦光参量振荡器：YAG激光波长为400 - 2500 5纳秒的纳米和脉冲持续时间）垂直于与〜300微米的光斑直径在膜表面。
- 放置在激光出射前方的衰减器来调谐激光能量密度，并使用分束器来聚焦激光束的一部分，以能量计（ 例如 ，热电检测器）和监测注量的波动。保持对准期间低于〜光能量密度1兆焦耳/ 平方厘米每脉冲。每当激光是使用合适的激光护目镜。
- 浸超声换能器（1频率范围 - 20兆赫）到培养皿〜2毫米离膜表面的，并通过使用测微翻译调节其位置和旋转阶段最大限度地从电影发出的声信号。
- 确定的探针通量楼罗不会损坏样品6：
- 在约1毫焦/厘米2每脉冲，至少500次脉冲的注量照射样品的随机点。对于每一个脉冲，收购超声换能器和激光能量密度从示波器电能表相应的声信号。命名平均能量密度为F LO 的审判 。
- 计算PA的信号作为其峰 - 峰振幅为脉冲数的函数的强度。为了配重的激光强度的波动，正常化每个声信号自身注量至F LO 试验的比率的幅度。分析的归一化的PA的强度作为脉冲数的函数的趋势并验证其随时间的稳定性。
- 在不稳定的情况下，重复步骤4.4.1具有F LO的较低值至4.4.3
- 衡量一个重塑的阈值能量密度：
- 选择样本的另一随机点以上以F LO 500的脉冲探测的平均PA强度（I LO 一个 ）。
- 设置名义通量除了F LO更大，并提供50个脉冲。命名他们的平均能量密度为F EXC。
- 再次探测，平均PA的强度（I LO 二 ）在以F LO 500脉冲。计算比R = I LO B / I LO 一个 。下面统一为R的值给出了样品的光学性质的不可逆的变化的证据。
- 使用测微XY工作台移动薄膜，改变POIN随机样本吨。重复步骤4.5.1使用F EXC不同的值4.5.4，以便采取几个值的R的下方，左右及以上的统一。 15分是合理的。
- 情节ř为F EXC的函数，并确定第作为该值的整形阈通量˚F当R开始从一个超越统计不确定性不同。6
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Representative Results
这里，含有金纳米棒为癌症的PA的成像蜂窝车辆的可行性与协议的典型的结果一起示出。
图1中的TEM图像显示步骤1之后的颗粒和它们的细胞车辆步骤2.颗粒和细胞的TEM成像的制备别处17描述后的通常外观。阳离子金纳米棒进行巨噬细胞中一个巨大的积累，维持其正常形态。被发现的粒子被严密囊泡内吞局限内。
图2a显示含阳离子金纳米棒的巨噬细胞的光传输图像和分散在壳聚糖幻象步骤3后作为证明该显微照片，将包含在壳聚糖水凝胶不会一ffect细胞形态。细胞被很好地分散在整个样本。含有金纳米棒无细胞壳聚糖膜的控制是均匀的。 图2b表明，当采取颗粒了由巨噬细胞，与我们以前的工作14,32一致的金纳米棒的电浆典型带保留。因此，效果，如在吞囊泡偏析和具有不同的尺寸和形状，在一个多分散胶体28共存粒子的差分吸收电浆耦合，33不打在这些协议的实质性的作用。 图2b中也证明壳聚糖的可行性作为光学幻象。
图3示出的R如根据步骤4测定˚FEXC的函数的趋势，并给出所需要的所述determ的数据和分析的想法第 f的萌发的按照步骤4.5.5。 第 f被认为是（11±1）毫焦/厘米2在本实施例。当在几个毫焦/厘米2，这适用于PA转化从蜂窝车辆稳定性的调查提供了高精确度的平均值500个脉冲该样本PA量测得到的信号与信号噪声比（SNR）大于20。
图 1. 阳离子金纳米棒和巨噬细胞表征 ：合成的金纳米棒（650×500）纳米2的TEM图像; b，c和D：分别（13×8.6）μm2以下，（2.3×1.7）μm2的和（870×650）纳米2与阳离子金纳米棒处理的巨噬细胞的TEM图像。的外观在D组的颗粒是由他们在细胞倾向的影响。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 壳聚糖膜表征 ：含阳离子金纳米棒的巨噬细胞的光传输图像和分散在壳聚糖虚线B：含有金纳米棒没有细胞壳聚糖幻影（黑实线，对照样品）和含金的巨噬细胞的消光光谱纳米棒（破红线）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图 3. 细胞车辆耐光。之后并且在每个F EXC与˚FEXC照射之前采取I LO的强度比R.误差条从楼罗信号波动产生。为R低于统一的重塑阈从这些数据中提取。红色实线作为引导的眼球。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
靶向肿瘤相关巨噬细胞的概念正在成为一个强大的概念，以打击癌症34，35，36。在这里，而不是销毁，这些细胞被招募为移动车辆，使金纳米棒成肿瘤，其取向的剥削。这个角度看，需要颗粒的贴心设计，融入细胞及其鉴定。我们已发现，装载有阳离子金纳米棒的鼠巨噬细胞的耐光不会从颗粒的内吞囊泡内的限制，这意味着他们的电浆耦合和交叉过热不是关键受到影响。我们假设所述PEG链和形状是偏共振，如金纳米球的发生率，防止颗粒进入太紧密接触，这是一个关于它们的直径17（约10纳米）和一个热扩散长度（左右30纳米在5纳秒）分别为电浆耦合和交叉过热。
该协议是创新的相对于颗粒的设计和它们的耐光性进行调查的现有的方法。根据步骤1金纳米棒的设计结合了Vigderman 等的季铵化合物能够推动金纳米棒到内吞小泡的大规模吸收和细胞渗透剂用阳离子轮廓24概念22，37，观察可能被嵌入的PEG内壳38和保持工作，同时获得胶体稳定性和生物相容性28。确实步骤1类似于由Yuan等 38的方法中，用替换用更小和更便宜的季铵化合物的细胞穿透肽。有了这些修改，阳离子金纳米棒是多功能性和可持续性。由于这些的粒子ES旨在为PA成像造影剂，在PA探头是理想的，以测试其功能特点。 PA转化通过在步骤4中一个重塑阈的定义的稳定性的测定是定量的和可再现的，它们是在科学文献中的帧独特功能。此外，我们注意到，该方法不要求广播设备的校准。
该协议中的关键步骤包括壳聚糖膜的制造检查细胞的车辆在他们为PA成像造影剂效率方面。壳聚糖是一种直链生物聚合物，包括葡萄糖胺和N-乙酰葡糖胺残基1,4-糖苷键连接在一起。脱乙酰壳多糖的一些生理化学特征，诸如其孔径，孔隙率和机械性能，以及其多功能性和轻便，使其成为水凝胶的薄膜或多孔膜2的形式制造一个理想的选择9，39，40。此外，脱乙酰壳多糖的多糖主链在结构上类似于糖胺聚糖，结缔组织的细胞外基质，促进了其工程仿生和细胞支持支架41使用的主要成分。总体而言，壳聚糖水凝胶具有热稳定性和弹性模量是代表结缔组织29，41，42，这是理想的PA测试。应注意，实现了与适当的厚度（50微米），低光浊度和良好的均匀性的薄膜。需要注意的是，在步骤3中给出的剂量都得到了优化。小鼠巨噬细胞的壳聚糖粘性混悬液应勤勉混合根据步骤3.2。这些指示，这些膜已经被用于比较不同大小6的金纳米棒的PA转化的稳定性。
Possi该协议的BLE修饰包括阳离子金纳米棒和蜂窝车辆步骤1和2中步骤1的方法，可能会受到增量改进， 例如 ：的制备中，通过细胞渗透剂的取代或PEG的长度股线等 ，以尽量减少与肿瘤相关的巨噬细胞的生理机能的任何干扰。特异于巨噬细胞中使用的配体可能是一种选择43。影响颗粒的摄取其他参数包括它们的尺寸和形状33和它们的无机涂料。例如，二氧化硅的壳可以得到高内在44，对聚合17和PA稳定性7光学稳定性的组合，在更复杂和更异物的费用。我们猜想，内化的内涵体通路可能是一个共同的影响33，43，44
该协议的限制包括需要使用固定的细胞，而不是活细胞，因为在步骤3中的处方与CEL的保存不相容细胞性生存能力。其他限制涉及在步骤4.4的需求中的探针注量的确定充分的SNR，换算成光吸收和膜的光稳定性的充分结合。
总之，我们已经描述了一种创新的协议来准备和执行是作为用于光声成像的造影剂可行蜂窝车辆的功能表征。我们发现，引进金纳米棒到巨噬细胞不其光稳定性产生负面影响。我们目前工作的重点是对这些细胞的生理学，为他们的生存力和趋化活性的特别关注。在将来，这种方法应当进行测试，以研究含有光学造影剂的不同的解决方案不同的细胞车辆的制备。 PA的探针也可用于光学造影剂的靶向性测试，以恶性细胞在体外 ，不使用移动车辆。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是部分由托斯卡纳大区和欧洲共同体的ERANET +项目LUS泡沫和BI-TRE的框架内支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | H6269 | To synthesize gold nanorods |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 | To synthesize gold nanorods |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | To synthesize gold nanorods |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | To synthesize gold nanorods |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | To synthesize gold nanoseeds | |
| MeO-PEG-SH | Iris Biotech | PEG1171 | To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da. |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | To PEGylate gold nanorods |
| (11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide | Sigma-Aldrich | 733305 | To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | To centrifuge PEGylated gold nanorods |
| PBS | Lonza | BE17-516F | To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells |
| J774a.1 | ATCC | TIB-67 | Monocyte/macrophage murine cell line |
| DMEM | Lonza | BE12-707F | Cell culture medium |
| FBS | Lonza | DE14-801F | To be added to cell culture medium |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | To be added to cell culture medium |
| Penicillin/streptomycin | Lonza | DE17-602E | To be added to cell culture medium |
| Petri dish | NEST | 705001 | Cell culture dish |
| Cell scraper | EuroClone | ES7018 | To detach cells |
| Formaldehyde | Fluka | 47630 | To fix cells |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma-Aldrich | 448869 | 75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da. |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 306576 | To insolubilize chitosan and generate the hydrogel |
| Polystyrene cell culture plates | NEST | 702011 | Used as molds to fabricate chitosan hydrogels |
| Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser | Continuum, Santa Clara, USA | Surelite OPO plus | Source of optical excitation for photoacoustic tests |
| Pyroelectric detector | Gentec, Quebec, Canada | QE8SP | To monitor optical fluence for photoacoustic tests |
| Pre amplified needle hydrophone | Precision Acoustic, Dorset, UK | Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range | To measure photoacoustic signals |
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