Abstract
ストローク臨床ストロークプレゼンテーションの最大25％を白質アカウントに影響を与え、5〜10倍大きくすることができる速度で静かに発生し、血管性認知症の発展に大きく貢献しています。焦点白質ストロークのいくつかのモデルが存在し、適切なモデルの欠如は、脳卒中のこのタイプの後に損傷応答と修復に関与する神経生物学のメカニズムの理解を妨げています。他の皮質下脳卒中モデルの主な制限は、彼らが限局的に白質に梗塞を制限しないか、主に非マウス種で確認されていることです。これは、白質ストロークの神経生物学を研究するために、マウス研究ツールを幅広く適用する能力を制限します。ここでは、不可逆的なeNOSの阻害剤の局所注射を使用して、マウスの白質における焦点脳卒中の信頼性の高い生産のための方法論を提示します。また、2つのユニークな定位を含む一般的なプロトコルにいくつかのバリエーションを提示しますバリエーション、大幅にこの技術の潜在的な用途を拡大する逆行性神経のトレースだけでなく、新鮮な組織標識および解剖。これらの変化は、脳卒中のこの共通とunderstudied形の神経生物学的効果を分析するための複数のアプローチを可能にします。
Protocol
このプロトコルでの動物の使用は、カリフォルニア州ロサンゼルス動物実験委員会の大学によって承認された手順に従って行われています。
注：ターゲットマウスの人口を識別することによって開始します。以前の研究では、唯一の雄の野生型C57 / BL6マウスが使用されている、しかし、様々なトランスジェニックまたはノックアウトマウスを使用することもできます。定位座標はC57 / BL6の解剖学に基づいていることに注意してください。各ユーザーが最初に白質へのストロークの局在を確認することをお勧めします。
1.白質ストロークの誘導 - 内側側斜めのアプローチ
- 先端径が15~25ミクロン11との間にあるようには0.5mmのキャピラリーチューブを用いて引っ張らガラスピペットを調製することによって開始します。
- 0.9％滅菌生理食塩水中27.4 mg / mlで（130μM）で - L-仁王の滅菌10μlのアリコート（（1）-iminoethyl-L-オルニチン塩酸N（5））を準備します。
- 引っ張られたガラスピペットをプレフィルガラスピペットを固定することによりL-仁王（2-5μL）の小容量の真空ラインに接続されたチューブにします。作業台の上に平らにピペットを置き、L-仁王溶液中に引き込まの端を挿入します。
- ピペットの0.5ミリメートル部の少なくとも2ミリメートルが満たされるまで真空を適用します。真空の電源をオフにし、ピペットを撤回。ステップ1.12になるまでそれを脇に置きます。
- 誘導チャンバー内にマウスを置き、標準の32％イソフルランを用いてマウスの麻酔を誘導し、1分間または深く麻酔されるまで（5 L /分5リットル/分の酸素と0.5 L / minのN 2と吸入）気化器を通って流れます。定位顕微鏡を備えた定位装置にマウスを転送します。気化器を通って流れ32％イソフルランを使用して、メンテナンス麻酔を提供し、ノーズコーン（2 L /分5リットル/分の酸素と0.5 L / minのN 2と吸入しました）。つま先のピンチで麻酔の深さを確認してください。
- 36°に注入アームを調整します。
- アッフィXAは、低容量の圧力噴射システムの先端にガラスピペットホルダーを引っ張り、定位セットアップの射出アームに取り付けます。
- コート両目の上にワセリンと場所人工涙軟膏で麻酔動物のウィスカー。頭の上に5〜10センチメートル開口部と、動物の頭の上に滅菌ドレープを配置することにより、無菌手術野を準備します。頭蓋骨を覆う毛を剃ることによってaspetic手術用表面を準備します。ベタジンおよび70％アルコール綿棒を交互に頭皮をきれいにしてください。
- 頭蓋骨の表面を露出させる滅菌細かいハサミ1.5センチ正中頭皮切開を行います。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥さ1-3X倍率で定位顕微鏡を用いて、滅菌マイクロポイントツールを使用して、任意の上に重なる骨膜組織を除去します。
- 細かい点マーカーを使用して、基準点としてマークブレグマ。
- 滅菌細かいSTIP手術用ドリルビットを使用して、2ミリメートルellipitical開頭術をドリル0;ブレグマで後方に始まり、ちょうど正中線の左前方に延びています。骨片を取り外し、大脳皮質を可視化することができるように、軟組織の上に重なります。
- 断続的に滅菌生理食塩水の滴を適用することによって、手術野と湿った皮質表面を保管してください。
- 定位装置のインジェクタアームに引っ張らガラスピペットを貼り付けます。ブレグマとピペットの先端の位置を合わせ、定位座標をゼロ。
- 最初の前方/後方（A / P）にピペットを進め、（M / L）内側/外側の表1に調整します。
- 皮質表面にピペットを進め、背/腹側（D / V）測定をゼロ。
- ゆっくりと第1のD / V、表1の座標に達するまで脳内にピペットを渡します。
- 20ミリ秒パルスの20 psiで設定された低容量圧力噴射システムを使用して、脳内にL-仁王の100 NLを注入し、逆流を防止するために、5分を待ちますピペットトラックアップ。
- 定位顕微鏡の接眼レンズと3Xの倍率で校正レチクルを使用してください。
- したがって、座標のセットごとに引っ張らガラスピペットから（100 NLに対応し、直径0.5mmのピペットで0.5ミリメートルの長さ）0.100ミリメートル3の合計を変位。レチクルを使用することにより、それぞれが使用倍率とスケールに依存して変化する設定以来測定し、標準化します。
- 空気流体メニスカスがサジタルビューを持っているように、各注入時の正確な体積測定のために、側から顕微鏡で角度の付いたピペットに近づきます。メニスカスは、ピペットの内側と外側の壁の両方の同じ焦点面に表示されます。
- ゆっくりピペットを撤回し、手順を繰り返し1.13-1.16.3 表1に提供された座標の2番目と3番目のセットで。
- 最後の注射の後、ピペットを削除し、開頭術部位を満たすのに十分な骨ワックスを配置します。 A頭皮の傷の縁をpproximateと皮膚接着剤で結合します。
- 頭皮切開に関連した局所疼痛を防止するために予防するために無菌の30 G針を使用して、創傷縁に0.5％マーカインを0.1mlを注入。
- 5日間飲料水中ハウジングと供給術後の抗生物質（0.48 mg / mlでトリメトプリム・スルファメトキサゾール、または0.5 mg / mlとレボフロキサシン）に動物を返します。
2.白質ストロークの誘導 - 後方斜めアプローチ
- 後部に前方を指向45度に定位セットアップの注入アームを調整する以外は、内側斜めのアプローチプロトコルのように、手順1.1から1.12を実行します。
- 第1のA / Pにピペットを進め、M / Lは、 表2に提供さ座標。
- 横方向の角度の付いたアプローチプロトコルのように、残りのステップ1.14から1.20までは完了。
3.逆行性神経ラベリング
- 滅菌10を準備します0.9％の生理食塩水で54.8 mg / mlでのL-仁王μlのアリコート。
- 0.9％の生理食塩水で20％Fluororuby（または20％ビオチン化デキストランアミンまたは2％フルオロゴールド）の無菌アリコートを準備します。
- 27.4 mg / mlでL-NiO及び10％Fluororubyの最終濃度のために1：一緒に1を希釈します。
- ステップ1.3から1.23に上記のようにストロークプロトコルを実行します。
- 以前に8を説明したように灌流固定、凍結切片および顕微鏡により組織切片でネイティブに蛍光トレーサーを可視化します。
免疫蛍光4.組織処理
- 脳卒中後の14日に3時間の範囲の適切な脳卒中後の間隔で、イソフルラン過剰摂取またはローカルIACUC承認手続きを経て、マウスを安楽死させます。
- 角度のついたハサミを使用して胸腔を開き、左心室に23 Gの翼状針を挿入します。
- 灌流液のための流出トラックを可能にするために、微細なハサミを使用して右心房に小さなカットを配置します。
- 経RTで10 ml /分の速度で冷4％パラホルムアルデヒド30〜40 MLにより、その後の冷リン酸緩衝化生理食塩水30〜40 mlの灌流。
- マウスを刎ねると後方頭蓋骨を開くために、滅菌ハサミを使って脳を除去した後、静かに24時間の冷4％PFAに脳を、スパチュラで覆って頭蓋骨を削除置き、その後、48時間、PBS中30％スクロースに転送。
- クライオスタットを用いて、40ミクロンの浮遊切片を作製し、以前6-8に記載されているように 、抗体処理を行います。本研究では、以下の抗体を使用します：ウサギ抗ニューロフィラメント200（1：500希釈）。ウサギ抗ビメンチン（1：500）。ヤギ抗GFAP（1：500）。ウサギ抗伊庭-1（1：1,000）。
タンパク質またはRNA分析5.組織処理
- 脳卒中後の14日に3時間の範囲の適切な脳卒中後の間隔で、イソフルラン過剰摂取またはローカルIACUC承認手続きを経て安楽死させます。
- 首をはねます後方頭蓋骨を開き、静かにスパチュラで上層の頭蓋骨を削除するには、滅菌ハサミを使って脳をマウスおよび削除します。
- 嗅球と視神経を切断するために、脳の前部に滅菌4ミリメートルのへらを挿入します。ゆっくり頭蓋冠から脳を持ち上げ、氷冷解剖バッファー（1×ハンクス液、25mMのHEPES-KOH、pHが7.4、35 mMグルコース、4 mMの重炭酸ナトリウム、および0.01 mg / mlでシクロヘキ）に配置します。
- 脳ブロックおよび滅菌新しいかみそりの刃を使用して、冷たい解剖バッファにストロークと場所を含む2〜3ミリメートルのスラブを準備します。
- 解剖顕微鏡下で、注入された半球に運動皮質の基礎となる白質を識別します。長い脳卒中後の間隔で、領域を視覚的巣状壊死およびミエリン蒼白によって同定することができます。
注：以前の脳卒中後の間隔で、10％ファストグリーン1μlのと混合し、L-仁王の注射は、脳卒中の視覚的な識別を可能にすることができます（- 解剖顕微鏡の指導の下、新鮮なメスを使用して、慎重にファストグリーンラベル付けや組織損失のいずれかによって識別さストロークを含む白質領域を解剖。所望のように上に重なる皮質と下にある線条体を削除します。
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Representative Results
提示されたモデルを用いて、白質下地前肢感覚皮質を確実に標的とすることができます。典型的にはヒトラクナ梗塞に見られるように、この化学的に誘発された脳卒中モデルは、焦点軸索およびミエリン損失、星状細胞、および小膠（ 図1）を生成します。 3回の注射を使用することにより、臨床的に有用なモデルは、前肢の運動課題7に早期障害を確立し、脳組織の経験の小さいが重要な部分は、免疫組織化学、免疫蛍光、および生化学的手法を虚血される定量的レベルでの実現可能性と信頼性です。卒中誘導後早期の時点（時間）で、軸索分子の組織の変化は（ 図2）を検出することができます。 7日目に、ストロークが軸索損失（ 図1a）の外接領域に、その成熟を 完了します。私たちの手で、この方法は、焦点白質病変を生成approximately800μmの水平直径と脳梁の前後軸に沿って約1ミリメートルを延長します。 7日までに、平均総梗塞サイズはおよそ0.200ミリメートル3であり、楕円形の形状を持つことになります。私たちは、動物の間やセクション、楕円セクションが発生する場所に依存間の両方のストロークの大きさで約10％の変動を観察しました。梗塞の大きさのさらなる成長はほとんど7日を超えて見られません。
軸索ストロークの領域を通って突出した（ 図3）を持つ層5および層6神経細胞体における重要な神経細胞標識におけるデキストランアミン結果の同時注入の追加。手順（細い針の通過）の偽の側面によって損傷されていない上に重なる皮質ニューロンは、遠位軸索損傷を受け、L-仁王準備とトレーサーを含めることによって同定することができます。このアプローチは、使用しました dは、脳卒中8後に軸索の初期セグメントのダイナミックな変化を実証します。
脳卒中の影響を受けた組織の領域のサイズが小さいことは、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色のような他の一般的な技術の使用を制限しながら、白質ストローク領域は、新鮮な組織において同定され得ます。そのようなファストグリーンなどの一般的な色素の添加は、解剖顕微鏡下で解剖することができます組織の識別可能な領域（ 図4）を生成します。いったん切開この組織を、ウエスタンブロットまたは免疫沈降を有するタンパク質分析のために、またはRNAの単離および分析（ 図4C）のために使用することができます。様々なトランスジェニックマウス系統を使用することにより、革新的なアプローチの様々な細胞運命マッピング研究とレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ 図4C）を含む焦点白質脳梗塞後の神経生物学を研究するために使用することができます。
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図1：内側および後方斜めアプローチの両方を使用して、フォーカル白質ストロークニューロフィラメントのための免疫蛍光標識（A、赤）は内側アプローチを用いて、7日脳卒中後の軸索損失の程度を示しています。後方斜めのアプローチを用いて、白質脳卒中病変がちょうど側脳室（B、C）の上の標的と強烈ミクログリア（B）とアストロサイトの反応性（C）を示しています。二つの星状細胞中間フィラメントマーカー、ビメンチン（赤）とグリア線維性酸性タンパク質（緑GFAPは、）、両方のストローク（C）後の白質（繊維質）アストロサイトの形態の変化を明らかにする。スケールバー=500μmでは、より大きな版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のシオン。
図2：白質ストローク変更する軸索ミクロドメイン組織コンタクチン関連タンパク質によってマークのβ-IVスペクトリン（赤）とparanodeででマークされたノードで白質ストローク誘導、軸索マイクロドメインの組織、の3時間（caspr内では、緑）、破壊された（矢印、B）。同側の白質が失わaxoglial接点（BとD）と軸索の典型的なものである節点とパラノード伸びを示しながら、反対側の白質の軸索は、通常のリンパ節、パラノードを示し、juxtaparanodal組織（AおよびC）。スケールバー=5μmです。
図3：逆行性神経Labelin白質のストロークを持つグラムは、軸索損傷と個々のニューロンを識別します。ストローク誘導時の蛍光デキストランアミン（赤）の同時注射は、脳卒中によって損傷軸索と個々のニューロンの同定を可能にします。標識化のほとんどは、ストロークを覆う一次感覚皮質内のレイヤ5及び6のニューロン内の軸索で発生します。画像は、脳卒中後の7日を表します。スケールバー=500μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：生化学的および転写アッセイにおける使用のための白質脳卒中病変の顕微解剖ファストグリーンの共同注入ストローク誘導の時点では、24時間（A、上パネル）で負傷した地域の早期発見を可能にします。 Immunoblotti特定の軸索タンパク質のngの単独ストローク（A、下パネル）の領域の減少を実証するために実施することができます。より長い時点で、白質ストローク（左パネル）の領域が局所的に特異的な標識（B）なしで切開することができます。右下のパネルは、ストローク（B）を含有する白質の解剖領域を示しながら、右の上のパネルは、解剖部位を除去した後の白質領域を示しています。白質（C）から解剖の領域から単離されたRNAを用いて、オリゴデンドロサイト特異的遺伝子のためのPCR。 ILは、同側を=。 CL =対側; C =コントロール; S =ストローク。
| 注入 | 前方/後方 | 内側/横 | 背/腹側 |
| 0.22 | 0.22 | -2.10 | |
| 2 | 0.70 | 0.15 | -2.16 |
| 3 | 1.21 | 0.15 | -2.18 |
表1：（単位：mm）横、斜めのアプローチのための定位座標。
| 注入 | 前方/後方 | 内側/横 | 背/腹側 |
| -0.75 | -0.96 | -2.10 | |
| 2 | -1.00 | -0.96 | -2.05 |
| 3 | -1.25 | -0.96 | -2.00 |
表2：（単位mm）後方斜めアプローチのための定位座標。
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Discussion
皮質下脳卒中の前モデルの数は、ラット12-14とマウス6,15における内部のカプセルへのエンドセリン-1の焦点注射、皮質下白質と線条体を含む、記載されています。小焦点脳卒中のより最近のモデルは、頸動脈16と、単一の貫通動脈17の光血栓閉塞中のコレステロール微小塞栓注射を利用してきました。これらのモデルのそれぞれが長所と短所5の両方を持っています。現在説明したモデルは、軸索の異常や損失、ミエリン分解、焦点壊死性コアと最小であり、7歳に依存して、かなり急速な回復を示している臨床赤字を含むヒトラクナ梗塞を模倣する多くの特性を持つ病変を生成します。ネズミ白質を標的とすることは機構研究をサポートすることができる遺伝子操作のさまざまなことができます。
クリティカルプロトコルのステップは、正確な定位座標を利用することが含まれます。マウスの白質のサイズが小さく、株からの歪みに変化するので、定位座標の改正は、使用したマウスの年齢および株に依存必要な場合があります。これは直接梗塞の大きさに相関しているとして、注射の量の制御も重要です。より大きな注射は上層皮質と下にある線条体に侵入し、より大きなストロークを生成します。
ここで説明する手法を使用してET-1の焦点注入が報告されているが、エンドセリン-1は、脳卒中後白質の生物学の研究を混乱させるオリゴデンドロサイト分化および成熟10,18に直接的パラクリン効果を有することが示されました。これとは対照的に、L-仁王アプローチ目標内皮細胞だけでは、同一の病変を生成し、傷害応答に関与する細胞上の任意の交絡パラクリン効果を排除しながら。 L-仁王は直接細胞傷害性およびセレクではありませんテッド用量は予備用量漸増実験によって決定した（データは示さず）。後方斜めのアプローチは白質損傷に起因することができ、最大の行動の欠陥を生成する一次運動野からより正確にアンダーカット軸索に開発されました。内側斜めのアプローチも損害賠償の運動皮質軸索が、より横方向に延びており、一次感覚皮質の根底にある軸索を伴います。
脳卒中病変は、最初の24時間にわたって、かなり急速に拡大します。 7日までに、梗塞の大きさが最大であり、我々はその時間を超えて大幅な病変の成長を観察していません。追加の細胞事象および軸索変性は、この初期の段階を超えて発生しますが、壊死性コアによって測定された梗塞サイズは、介入の非存在下では有意な変化はありません。
ストローク時の神経解剖学的トレーサーの同時注射は、虚血性軸索損傷を経験したニューロンを識別します。 MEDのいずれかを使用して、IALまたは後方斜めのアプローチは、損傷した軸索投射を持つ神経細胞体は無傷のまま。これは、中枢神経系の神経細胞上の虚血性軸索切断の効果を研究するための有用なモデルを作成します。我々は両方のストロークで損傷した軸索によって優れた取り込みを示しデキストランアミンおよびフルオロゴールドを含む、主に逆行性トレーサーを、利用してきました。トランスジェニックおよびノックアウトマウス系統の多種多様を採用することにより、このプロトコルのユーザーは、白質ストローク損傷応答と修復に関与する神経細胞の遺伝子の特定の役割を調べることができます。
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Disclosures
なし
Acknowledgments
SNとMDDは、NIH K08 NS083740と神経のUCLA省から支援を受けました。 AJG博士ミリアムとシェルドン・G・アデルソン医学研究財団とラリーL. Hillblom基金による支援を認めます。 KLNは感謝アメリカ心臓協会14BFSC17760005 ASA-Bugher脳卒中センターから支援を認めています。 ILL、EGSとSTCは、NIH R01 NS071481によってサポートされていました。 JDHは、NIH K08 NS083740からの支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride | Calbiochem | 400600-20MG | |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical, Inc. | NDC 57319-559-06 | |
| Capillary tubes | World Precision Instruments | 50-821-807 | |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | Picospritzer II | |
| Stereotactic setup | Kent Scientific | KSC51725 | |
| Pipette puller | KOPF | Model 720 | |
| Stereomicroscope SZ51 | Olympus | 88-124 | |
| Fine scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8547 | |
| Curved Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8598 | |
| Blunt dissection tool | Fine Scientific Tools | 10066-15 | |
| Drill | Dremel | 8220-1/28 | |
| Drill bits | Fine Scientific Tools | 19007-05 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Marcaine | HOSPIRA | NDC 0409-1610-50 | |
| Trimethoprim-Sulfamethaxole | STI Pharmacy | NDC 54879-007-16 | |
| Fluororuby | Fluorochrome Inc | 30 mg | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
| Sucrose | Fisher | BP220-10 | |
| Cryostat | Leica CM3050 S | 14047033518 | |
| Glass slides | Fisher | 12-544-7 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| 23 G butterfly needle | Fisher | 14-840-35 | |
| 10x Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14065056 | |
| 1 M HEPES-KOH, pH 7.4 | Affymetrix | 16924 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Cyclohexamide | Sigma | 01810 |
References
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