Abstract
Accidente cerebrovascular que afecta a las cuentas de la materia blanca de hasta el 25% de los accidentes cerebrovasculares presentaciones clínicas, se produce en silencio a velocidades que pueden ser 5-10 veces mayor, y contribuye de manera significativa al desarrollo de la demencia vascular. Pocos modelos de derrame cerebral focal materia blanca existen y esta falta de modelos apropiados ha dificultado la comprensión de los mecanismos neurobiológicos implicados en la respuesta lesión y reparación después de este tipo de accidente cerebrovascular. La principal limitación de otros modelos de accidente cerebrovascular subcortical es que no restrinjan de manera focal del infarto de la sustancia blanca o principalmente han sido validados en las especies no murinos. Esto limita la capacidad de aplicar la amplia variedad de herramientas de investigación murinos para estudiar la neurobiología de la carrera de la materia blanca. Aquí presentamos una metodología para la producción fiable de un derrame cerebral focal en la sustancia blanca murino mediante una inyección local de un inhibidor de eNOS irreversible. También presentamos algunas variaciones en el protocolo general entre ellos dos estereotáctica únicovariaciones, la localización neuronal retrógrada, así como el etiquetado de disección de tejido fresco y que en gran medida ampliar las posibles aplicaciones de esta técnica. Estas variaciones permiten múltiples enfoques para analizar los efectos neurobiológicos de esta forma común y poco estudiada de accidente cerebrovascular.
Protocol
El uso de animales en este protocolo se ha realizado de acuerdo con los procedimientos aprobados por la Universidad de California en Los Ángeles Cuidado de Animales y el empleo.
Nota: Comience por identificar la población objetivo murino. En estudios anteriores, de tipo salvaje ratones C57 / Bl6 solamente masculinas se han utilizado, sin embargo varios ratones transgénicos o knockout también se pueden utilizar. Tenga en cuenta que las coordenadas estereotácticas se basan en C57 / Bl6 anatomía. Se recomienda que cada usuario verificar inicialmente la localización de la carrera a la sustancia blanca.
1. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua medial
- Comience por la preparación de una pipeta de vidrio tirado usando tubo capilar 0,5 mm de tal manera que el diámetro distal es de entre 15 a 25 micras 11.
- Preparar una alícuota de 10 l estéril de L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27,4 mg / ml (130 mM) en solución salina normal estéril al 0,9%.
- Pre-llenar la pipeta de vidrio tiradocon un pequeño volumen de L-Nio (2-5 l) fijando el pipeta de vidrio a un tubo conectado a una línea de vacío. Acostar a la pipeta sobre la mesa de trabajo e introduzca el extremo tirado en la solución de L-Nio.
- Aplicar el vacío hasta que al menos 2 mm de la porción de 0,5 mm de la pipeta se llena. Apague el vacío y retirar la pipeta. Coloca a un lado hasta Paso 1.12.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción e inducir anestesia del ratón usando estándar de 32% de isoflurano fluía a través de un vaporizador (5 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N 2) durante 1 min o hasta que profundamente anestesiados. Transferir el ratón para un aparato estereotáxico equipado con un microscopio estereotáctica. Proporcionar anestesia de mantenimiento utilizando 32% de isoflurano fluido a través de un vaporizador (2 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N 2) y un cono de nariz. Comprobar la profundidad de la anestesia con una pizca dedo del pie.
- Ajuste el brazo de la inyección de 36 °.
- Affixa sacó titular de la pipeta de vidrio al extremo distal de un sistema de inyección a presión de bajo volumen y adjuntarlo al brazo de la inyección de la configuración estereotáctica.
- Escudo bigotes del animal anestesiado con vaselina y lugar artificial ungüento de lágrimas sobre ambos ojos. Preparar un campo quirúrgico estéril mediante la colocación de un campo estéril sobre la cabeza del animal con una abertura de 5 a 10 cm sobre la cabeza. Preparar una superficie quirúrgica aspetic por el afeitado de la piel que recubre el cráneo. Limpiar el cuero cabelludo con la alternancia de betadine y el 70% algodones con alcohol.
- Hacer una incisión media de 1,5 cm del cuero cabelludo con unas tijeras finas estériles para exponer la superficie del cráneo. Se seca el cráneo con un hisopo de algodón estéril y usando un microscopio estereotáctica en 1-3x magnificación, retirar cualquier tejido del periostio que recubre el uso de una herramienta de punto de micro estéril.
- Marcar el bregma como punto de referencia con un marcador de punta fina.
- Perforar una craneotomía ellipitical 2 mm con una broca quirúrgica estéril fina stip0; comenzando posterior al bregma y que se extiende hacia delante justo a la izquierda de la línea media. Eliminar fragmentos de hueso y el tejido superior de blando, de manera que la corteza cerebral puede ser visualizado.
- Mantenga el campo quirúrgico y la superficie cortical húmedo aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril.
- Colocar una pipeta de vidrio tirado al brazo inyector del aparato estereotáxico. Alinear el extremo distal de la pipeta con la Bregma y poner a cero las coordenadas estereotácticas.
- Avanzar en la pipeta a la primera anterior / posterior (A / P) y medial / lateral (M / L) coordenadas proporcionadas en la Tabla 1.
- Avanzar en la pipeta a la superficie cortical y cero el ventral (V D /) medición dorsal /.
- Pasar lentamente la pipeta en el cerebro hasta llegar a la primera D / V de coordenadas en la Tabla 1.
- El uso de un sistema de inyección de baja presión de volumen ajustado a 20 psi durante 20 ms pulsos, inyectar 100 nl de L-Nio en el cerebro y esperar 5 minutos para prevenir el reflujohasta la pista de la pipeta.
- Utilizar una retícula calibrada en el ocular del microscopio estereotáctica y un aumento de 3 veces.
- Por consiguiente, desplazar a un total de 0,100 mm 3 (0,5 mm de longitud en una pipeta 0,5 mm de diámetro, que corresponde a 100 nl) de la pipeta de vidrio tirado para cada conjunto de coordenadas. Mediante el uso de una retícula, medir y estandarizar ya que cada organizadas varía según la ampliación y las escalas utilizadas.
- Para la medición exacta del volumen durante cada inyección, el enfoque de la pipeta en ángulo con el microscopio de un lado para que el menisco aire-líquido tiene una vista sagital. El menisco debe aparecer en el mismo plano focal, tanto de la pared interior y exterior de la pipeta.
- Retire lentamente la pipeta y repita los pasos 1.13-1.16.3 en el segundo y tercer conjunto de coordenadas que figuran en la Tabla 1.
- Después de la inyección final, retire la pipeta y colocar la cera suficiente hueso para llenar el sitio de la craneotomía. UNpproximate los bordes de la herida del cuero cabelludo y se unen con adhesivo dérmico.
- Inyectar 0,1 ml de 0,5% bupivacaína en los márgenes de la herida utilizando un 30 G aguja estéril para evitar para prevenir el dolor local asociado con la incisión del cuero cabelludo.
- Devolver el animal a la vivienda y suministro de antibióticos postoperatorios (0,48 mg / ml de trimetoprim-sulfametoxazol, o 0,5 mg / ml levofloxacino) en el agua de bebida durante 5 días.
2. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua posterior
- Realice los pasos 1.1 a 1.12 como en el protocolo de enfoque en ángulo medial, excepto ajustar el brazo de la inyección de la configuración estereotáctica a 45 grados orientados anterior a la posterior.
- Avanzar en la pipeta a la primera A / P y M / L de coordenadas que figuran en la Tabla 2.
- pasos restantes completos 1.14-1.20 como en el protocolo de enfoque en ángulo lateral.
3. El etiquetado neuronal retrógrada
- Preparar una estéril 10alícuota l de L-Nio a 54,8 mg / ml en solución salina normal al 0,9%.
- Preparar una alícuota estéril de 20% Fluororuby (o 20% de amina de dextrano biotinilado o 2% Fluorogold) en solución salina normal al 0,9%.
- Diluir juntos 1: 1 para concentraciones finales de 27,4 mg / ml L-Nio y 10% Fluororuby.
- Realizar el protocolo de ACV como anteriormente en las etapas 1.3-1.23.
- Visualizar el trazador fluorescente de forma nativa en la sección de tejido mediante fijación por perfusión, cryosectioning y microscopía como se ha descrito previamente 8.
4. Procesamiento de tejidos para la inmunofluorescencia
- En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia a los ratones a través de la sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento.
- Abrir la cavidad torácica con unas tijeras en ángulo e insertar una aguja 23 G de la mariposa en el ventrículo izquierdo.
- Coloque una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras finas para permitir una vía de salida para el líquido de perfusión.
- Transcardially perfundir con 30-40 ml de solución salina tamponada con fosfato fría, seguido de 30 a 40 ml de paraformaldehído al 4% frío a una velocidad de 10 ml / min a TA.
- Decapitar al ratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo por detrás y luego retire con cuidado el cráneo recubre con una espátula, colocar el cerebro en frío PFA al 4% durante 24 horas, y luego se transfieren a un 30% de sacarosa en PBS durante 48 horas .
- Preparar cuarenta secciones micras flotantes usando un criostato y realizar el procesamiento de anticuerpo como se describe anteriormente 6-8. En este estudio, utilice los siguientes anticuerpos: (: 500 dilución 1); de conejo anti-neurofilamentos 200 conejo anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); conejo anti-Iba-1 (1: 1.000).
5. Procesamiento de tejidos para la proteína o el análisis de ARN
- En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia mediante sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento.
- decapitar alratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo posterior y retire suavemente el cráneo recubre con una espátula.
- Insertar un 4 mm espátula estéril en la parte delantera del cerebro para cortar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Levante suavemente el cerebro fuera de la bóveda craneal y el lugar en tampón de disección enfriado con hielo (solución salina equilibrada de 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, glucosa 35 mM, bicarbonato de sodio 4 mM, y 0,01 mg / ml ciclohexamida).
- El uso de un bloque de cerebro y cuchillas de afeitar estériles nuevas, preparar losas 2-3 mm que contienen la carrera y el lugar en el tampón de disección fría.
- Bajo un microscopio de disección, identificar la materia blanca de la corteza motora subyacente en el hemisferio inyectado. A intervalos post-carrera más larga, la región puede ser identificado visualmente por necrosis focal y la palidez de la mielina.
Nota: A intervalos post-ictus anteriores, la inyección de L-Nio mezcla con 1 l de 10% Fast Green puede permitir la identificación visual de la carrera (- Bajo la guía de un microscopio de disección y el uso de un bisturí fresca, diseccionar cuidadosamente la región de la sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular, identificado por cualquiera de etiquetado verde rápida o pérdida de tejido. Retirar la corteza suprayacente y el cuerpo estriado subyacente si lo deseas.
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Representative Results
Usando el modelo presentado, la sustancia blanca subyacente extremidad anterior corteza sensoriomotora fiable puede ser objetivo. Este modelo accidente cerebrovascular inducida químicamente produce axonal focal y la pérdida de mielina, astrocitosis y microgliosis (Figura 1), como se ve típicamente en infartos lacunares humanos. Mediante el uso de tres inyecciones, un modelo de utilidad clínica se establece con deterioro temprano en las tareas motoras miembro delantero 7 y una parte pequeña pero significativa de las experiencias de tejido cerebral que la isquemia de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, y bioquímicos técnicas son factibles y fiable a nivel cuantitativo. En los puntos de tiempo tempranos (h) después de la inducción del movimiento, los cambios en la organización molecular axonal pueden ser detectados (Figura 2). A los 7 días, la carrera completa su maduración a un área circunscrita de la pérdida axonal (Figura 1a). En nuestras manos, este método produce una lesión approxima materia blanca focaltely 800 micras de diámetro horizontal y que se extiende aproximadamente 1 mm a lo largo del eje anterior-posterior del cuerpo calloso. Por 7 días, el tamaño del infarto total medio es aproximadamente 0,200 mm 3 y tendrá una forma elíptica. Hemos observado aproximadamente el 10% de la variabilidad en el tamaño del trazo tanto entre animales y entre secciones, dependiendo de en qué parte de la elipse de la sección se produce. Un mayor crecimiento en el tamaño del infarto rara vez se ve más allá de 7 días.
La adición de una inyección simultánea de los resultados de amina de dextrano en el etiquetado neuronal significativa en la capa 5 y la capa 6 cuerpos celulares neuronales que tienen axones se proyectan a través de la región de accidente cerebrovascular (Figura 3). neuronas corticales superpuestas que no son dañados por los aspectos simulada del procedimiento (paso de aguja fina), se someten a daño axonal distal y pueden ser identificados por la inclusión de un trazador con la preparación de L-Nio. Este enfoque fue el uso d para demostrar los cambios dinámicos en el segmento inicial del axón después del accidente cerebrovascular 8.
Mientras que el pequeño tamaño de la región de tejido afectado por el derrame cerebral limita el uso de otras técnicas comunes tales como la tinción de 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro de (TTC), la región de carrera de la materia blanca puede ser identificado en el tejido fresco. La adición de un colorante común tal como Fast Green produce una región de identificación de tejido que puede ser diseccionado bajo un microscopio de disección (Figura 4). Una vez diseccionada este tejido se puede utilizar para el análisis de proteínas con transferencia de Western o la inmunoprecipitación, o para el aislamiento y el análisis (Figura 4C) RNA. A través del uso de diferentes líneas de ratones transgénicos, una variedad de enfoques innovadores se puede utilizar para estudiar la neurobiología después de accidente cerebrovascular focal de la materia blanca incluyendo estudios de mapeo de destino celular y la microdisección de captura por láser (Figura 4C).
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Figura 1:. Focal Stroke materia blanca Usando Tanto medial y posterior Enfoques en ángulo etiquetado de inmunofluorescencia para neurofilamentos (A, rojo) demuestra el grado de pérdida axonal siete días después del accidente cerebrovascular usando el enfoque medial. Utilizando el enfoque en ángulo posterior, la lesión accidente cerebrovascular materia blanca está dirigido justo por encima del ventrículo lateral (B, C) y muestra microglial intensa (B) y la reactividad de los astrocitos (C). Dos de astrocitos marcadores intermedios de filamento, vimentina (rojo) y la proteína ácida glial fibrilar (GFAP, verde), ambos revelan cambios en la morfología de la materia blanca (astrocitos fibrosos) después del accidente cerebrovascular (C). Las barras de escala = 500 micras. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 2:. Materia blanca Stroke Altera axonal Organización microdominio Dentro de 3 hr de la materia blanca de la inducción del movimiento, organización microdominio axonal en el nodo, marcado por la espectrina beta-IV (rojo) y en el paranode, marcado por la proteína contactina-asociado (caspr, verde), se interrumpe (flechas, B). Contralateral axones de la sustancia blanca muestran ganglionar normal, paranodal, y la organización juxtaparanodal (A y C), mientras que la materia blanca ipsilateral muestra el alargamiento nodal y paranodal que es típico de los axones con contacto axoglial perdido (B y D). Barra de escala = 5 micras.
Figura 3: retrógrado neuronal Labeling con la sustancia blanca del movimiento Identifica neuronas individuales con daño axonal. Co-inyección de amina dextrano fluorescente (rojo) en el momento de la inducción carrera permite la identificación de las neuronas individuales con los axones lesionados por un accidente cerebrovascular. La mayor parte del etiquetado se produce en los axones dentro de la capa 5 y 6 en las neuronas corticales primarias sensoriomotoras que recubren la carrera. Imagen representa a 7 días después del accidente cerebrovascular. Barra de escala = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Microdisección de lesiones de sustancia blanca Stroke para uso en bioquímica y de la transcripción co-ensayos de inyección de verde rápido en el momento de la inducción carrera permite la identificación temprana de la región lesionada a las 24 horas (A, panel superior). Immunoblotting de proteínas específicas axonal puede llevar a cabo para demostrar reducciones en la región de accidente cerebrovascular solo (A, panel inferior). En los puntos de tiempo más largos, la región de la carrera de la materia blanca (panel izquierdo) puede ser diseccionado focalmente sin etiquetado específico (B). Panel superior derecha muestra la región de la sustancia blanca después de la eliminación de la región diseccionado, mientras que el panel inferior derecho muestra la región diseccionada de la sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular (B). PCR para genes de oligodendrocitos-específica utilizando ARN aislado de las regiones disecadas a partir de la sustancia blanca (C). IL = ipsilateral; CL = contralateral; c = control; s = carrera.
| Inyección | Anterior posterior | Medial / lateral | Dorsal / ventral |
| 0.22 | 0.22 | -2.10 | |
| 2 | 0.70 | 0.15 | -2.16 |
| 3 | 1.21 | 0.15 | -2.18 |
Tabla 1: Coordenadas estereotáctica para Aproximación oblicua lateral (en mm).
| Inyección | Anterior posterior | Medial / lateral | Dorsal / ventral |
| -0.75 | -0.96 | -2.10 | |
| 2 | -1.00 | -0.96 | -2.05 |
| 3 | -1.25 | -0.96 | -2.00 |
Tabla 2: Coordenadas estereotáctica para posterior Aproximación oblicua (en mm).
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Discussion
Un número de modelos anteriores de accidente cerebrovascular subcortical se han descrito incluyendo inyecciones focales de endotelina-1 en la cápsula interna, materia blanca subcortical y el cuerpo estriado en la rata y el ratón 12 a 14 6,15. Los modelos más recientes de pequeños accidentes cerebrovasculares focales han utilizado la inyección microembolias colesterol en la arteria carótida y la oclusión 16 photothrombotic de una sola de las arteriolas penetrantes 17. Cada uno de estos modelos tiene tanto ventajas como desventajas 5. El modelo actualmente descrita produce una lesión que tiene una serie de características que imitan el infarto lacunar humano, incluyendo anomalías axonal y la pérdida, degradación de la mielina, un núcleo necrótico focal y un déficit clínico que demuestra es mínima y bastante rápida recuperación depende de la edad de 7 años. Orientación de la materia blanca murino permite una amplia variedad de manipulaciones genéticas que pueden apoyar estudios sobre el mecanismo.
el críticoetapas del protocolo incluyen la utilización de coordenadas estereotácticas precisas. Debido a que la materia blanca murino es de tamaño pequeño y varía de una cepa a otra, la revisión de las coordenadas estereotácticas puede ser necesaria dependiendo de la edad y raza de ratones utilizados. El control de volumen de inyección también es importante ya que esto se correlaciona directamente con el tamaño del infarto. inyecciones mayores producirán golpes más grandes que invaden la corteza suprayacente y el cuerpo estriado subyacente.
Inyección focal de ET-1 utilizando el método descrito aquí se ha reportado, pero se muestra la endotelina-1 que tienen efectos paracrinos directos sobre la diferenciación y maduración de los oligodendrocitos 10,18 confundiendo el estudio de post-accidente cerebrovascular materia blanca biología. En contraste, las células endoteliales Objetivos de aproximación-L Nio solo mientras que produce una lesión idénticos y elimina cualquier efecto de confusión paracrinos sobre las células implicadas en la respuesta lesión. L-Nio no es directamente citotóxico y la selecdosis ted se determinó mediante experimentos preliminares escalada de dosis (datos no mostrados). El enfoque en ángulo posterior se desarrolló para más precisamente axones de corte sesgado de la corteza motora primaria producir el déficit conductual máxima que se puede atribuir a las lesiones de la sustancia blanca. El ángulo de aproximación medial también daña axones corteza motora sino que se extiende lateralmente más e implica axones subyacentes corteza sensorial primaria.
La lesión de carrera se expande bastante rápidamente durante las primeras 24 horas. Por siete días, el tamaño del infarto es máxima y no hemos observado un crecimiento significativo de la lesión allá de ese tiempo. eventos celulares adicionales y la degeneración axonal ocurrirán más allá de esta etapa inicial, pero el tamaño del infarto medido por el núcleo necrótico no cambiarán significativamente en la ausencia de cualquier intervención.
Co-inyección de trazadores neuroanatómicos en el momento del accidente cerebrovascular identifica las neuronas que experimentan lesión axonal isquémica. Utilizando el medial o aproximación en ángulo posterior, los cuerpos de las células neuronales con proyecciones axonales dañadas permanecen ilesos. Esto crea un modelo útil para estudiar el efecto de la axotomía isquémica en las neuronas del sistema nervioso central. Hemos utilizado principalmente trazadores retrógrados incluyendo amina dextrano y Fluorogold tanto, que muestran una excelente absorción por los axones dañados por accidente cerebrovascular. Mediante el empleo de la amplia variedad de líneas de transgénicos y knock-out de ratón, los usuarios de este protocolo pueden investigar el papel específico de genes neuronales implicados en blanco accidente cerebrovascular materia respuesta lesión y reparación.
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Disclosures
Ninguna
Acknowledgments
SN y MDD recibieron el apoyo de los NIH K08 NS083740 y el Departamento de Neurología de la UCLA. AJG reconoce el apoyo por el Dr. Miriam y la Fundación de Investigación Sheldon G. Adelson Médica y la Fundación Larry L. Hillblom. KLN agradece el apoyo del Centro de Accidentes Cerebrovasculares Asociación Americana del Corazón 14BFSC17760005 ASA-Bugher. ILL, EGS y STC fueron apoyados por el NIH R01 NS071481. JDH reconoce el apoyo de NIH K08 NS083740.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride | Calbiochem | 400600-20MG | |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical, Inc. | NDC 57319-559-06 | |
| Capillary tubes | World Precision Instruments | 50-821-807 | |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | Picospritzer II | |
| Stereotactic setup | Kent Scientific | KSC51725 | |
| Pipette puller | KOPF | Model 720 | |
| Stereomicroscope SZ51 | Olympus | 88-124 | |
| Fine scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8547 | |
| Curved Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8598 | |
| Blunt dissection tool | Fine Scientific Tools | 10066-15 | |
| Drill | Dremel | 8220-1/28 | |
| Drill bits | Fine Scientific Tools | 19007-05 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Marcaine | HOSPIRA | NDC 0409-1610-50 | |
| Trimethoprim-Sulfamethaxole | STI Pharmacy | NDC 54879-007-16 | |
| Fluororuby | Fluorochrome Inc | 30 mg | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
| Sucrose | Fisher | BP220-10 | |
| Cryostat | Leica CM3050 S | 14047033518 | |
| Glass slides | Fisher | 12-544-7 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| 23 G butterfly needle | Fisher | 14-840-35 | |
| 10x Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14065056 | |
| 1 M HEPES-KOH, pH 7.4 | Affymetrix | 16924 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Cyclohexamide | Sigma | 01810 |
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