Laser-capture mikrodissektion for Human prostata epitel til RNA analyse

Introduction

Prostata er en heterogen væv sammensat af sekretorisk epitel anbragt i glandulær acini omgivet af fibromuskulær stroma består primært af glat muskulatur ^1. Epitel rum består af fem forskellige, men organiserede celletyper: basale celler, sekretoriske celler, neuroendokrine celler, transit forstærkende celler og stamceller ^2. I prostatakræft (PCA), der opstår fra luminale epitelceller, væksten af adenocarcinom forårsager en tydelig gradvist tab af stromale rum ^3. Af disse grunde vil vævsprøver have tydelige forskelle i andelen af ​​stromale og epitelial celletype baseret på omfanget af PSA. Disse forskelle kan føre til tendentiøse antagelser af genekspression data indhentet fra hele væv uden hensyn til mikrodissektion af den ønskede celletype. Derfor, for at fjerne denne skævhed er det vigtigt at adskille celletyper før RNA-ekstraktion oggenekspression analyse.

Macrodissection eller mikrodissektion kan anvendes til fysisk adskilt velkarakteriserede epitel områder fra det omgivende stroma ^{4 -6.} Macrodissection sker typisk med et barberblad under et dissektionsmikroskop og fungerer godt til adskillelse af store PCa knuder fra stroma, men ikke er i stand til at fjerne godartede epitel fra omgivende stroma (se eksempel på benign prostata histologi i figur 1). Mikrodissektion med en laser (LCM) er betydeligt mere arbejdskrævende end macrodissection, men kan meget præcist dissekere godartet epitel ^4.

Nylige publikationer fra vores laboratorium har vist, at RNA kan med held udvindes af LCM fra enten formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) biopsier eller frosne væv ^4,7-9. De store udfordringer i LCM-RNA-ekstraktion er 1) til nøjagtigt at dissekere de ønskede områder af vævet, og 2) at bevare RNA integritet under LCM og isolation proces ^4,10. RNA isoleret fra rene cellepopulationer kan anvendes til genekspression analyse af flere metoder, herunder revers-transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) ^7,8, microarray ^11, og dyb -sequencing ^12-14.

Målet med denne protokol er at isolere total RNA fra LCM prostata epitel fra frosne væv til nedstrøms genekspression analyser.

Protocol

Alle humane væv anvendes til disse forsøg blev erhvervet via en Institutional Review Board godkendt protokol og / eller fritagelse ved University of Illinois i Chicago.

1. Afsnit Frisk Frosset Prostata på PEN-dias og på Charged Glas Slide

1. Dagen før eller et par timer før sektionering af prøven, rene værktøjer (dvs. børste, tang, coplins, knive, PEN-indrammede dias (hvis det ikke allerede RNase gratis), en ETOH sikker markør og en blyant), og indersiden af en RT kryostat med RNase-dekontaminerende opløsning under anvendelse af en sprayflaske og lab-klude.
   1. Tillad RNase-dekontaminering løsning til at sidde i 5 min før aftørring væk, skyl med depcH _{2 0} at fjerne tilovers RNase-dekontaminering løsning og en sidste skylning med 70% EtOH (udarbejdet med depcH _{2 0).}
      Bemærk: Det er vigtigt at opretholde en RNase-fri arbejdsplads. Alle coplins, værktøj, frosne montering medium, klinger og dias anvendes, bør kun anvendes til RNase gratis arbejdeog aldrig brugt i en standard ikke-RNase frit miljø. Alle instrumenter skal behandles med en RNase dekontaminering løsning, før hvert forsøg.
2. Cool kryostat til -24 ° C.
3. Placer følgende rengjorte RNase gratis instrumenter inde cryostat køle af i mindst 30 minutter før sektionering: slide Coplin fyldt med 100% ethanol, værktøj, små frosne væv kassetter og montering chuck.
4. Hent frosne prostata væv fra cryostorage og sted i en tør-is-fyldt skum spand til transport. Placer væv ind kryostat at ækvilibrere til kryostat temperatur i mindst 30 minutter.
   Bemærk: Menneske prostata væv til laser-capture mikro-dissektion kan enten være frisk frosne eller formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE). De tidsmæssige begrænsninger og slide forberedelse er lidt anderledes mellem væv kilder. Her beskriver vi trinene til frosne snit.
5. Arbejde med et væv på et tidspunkt, og sprøjte frosset monteringsmedium i Bottom af kassetten og hurtigt at montere frosne prostatavæv i den frosne monteringsmedium hjælp af kølede pincet.
6. Placer kassetten med vævet ind chiller i kryostat i 5 minutter at sætte frosne montering medium.
7. Squirt en lille mængde af frosne montering medium på patronen og omhyggeligt trykke monteret væv bunden op på den frosne montering medium. Lad fastsat i kryostaten for 5 minutter for at tillade den frosne monteringsmedium til helt at størkne.
8. Placer Chuck ind i holderen og spænd.
9. Lås håndtaget i låst position og placere en ny klinge på kryostaten. For downstream molekylære endpoints, der omfatter et amplifikationstrinnet (dvs. qPCR) er det tilrådeligt at bruge en ny klinge til hver patient for at forhindre forurening (eller flytte kniven over til at bruge areal af bladet til den næste prøve).
10. Låse holderen og omhyggeligt fremme vævet med hånden eller med en fodpedal at udjævne og udsætte vævet med 50 μm sektioner, indtil det ønskede væv eksponering er nået.
11. Juster kryostat til 5 um, sender en eller to sektioner og placere dem på ladet glasplade til hematoxylin og eosin (H & E) farvning (se trin 2).
12. Umiddelbart placere glide ind i kold 100% ethanol i 2 min.
13. Fjern det opladede objektglas fra ethanol og lad det tørre ved RT før du fortsætter til H & E farvning (trin 2).
14. Placer RT PEN-frame slide på en ramme supporter.
15. Juster kryostat til 10 um og sted sektioner onto RT PEN ramme dias. En til fire sektioner kan være plads på hvert objektglas afhængigt af vævsstørrelse.
16. Umiddelbart kaste slide i det kolde 100% ethanol i 2 min.
17. Fjern de PEN-frame slides fra ethanol og opbevar dias i et dias kasse i en ekssikkator kasse i en -80 ° C fryser indtil den er klar til LCM. Tre dage er den maksimale opbevaringstid for optimal RNA opsving.
18. Fortsæt med trin 2 for kun den ladede glas glede. Fortsæt med trin 3 til PEN-frame dias.

2. Hematoxylin og Eosin Y (H & E) Stain til histologisk Mark-up

Bemærk: Denne hvis for væv på ladede objektglas og IKKE PEN-frame slide for LCM.

1. Hydrat afsnittene om den ladede objektglas dyppe glide gennem gradueret ethanol som følger: dyppe slide to gange i 100% ethanol i 3 minutter, to gange i 95% ethanol i 3 minutter, en gang i 70% ethanol i 3 minutter og to gange i destilleret _H2O i 3 minutter.
   1. Forbered acid alkoholopløsning: 99 ml 70% ethanol + 1 ml 1% HCI og 0,1% natriumhydrogencarbonatopløsning: 0,1 g natriumbicarbonat i 100 ml destilleret _H2O
2. Dyp dias i Hæmatoxylin Gill II (0,4%) i 5 min.
3. Vask overskydende pletten i steady kører hanen _H2O i 3 min.
4. Dyp dias 10 gange i sur alkohol
5. Vask dias i rindende _H2O i 3 min.
6. Dyp diasi 0,1% natriumhydrogencarbonatopløsning for 30-60 sek at tænde lilla farve til blå.
7. Vask dias i rindende _H2O i 3 min.
8. Skyl dias i 95% ethanol med 10 dips.
9. Dyp dias i eosin Y 2-3 gange i 15 sek alt.
10. Dehydrere glide gennem gradueret ethanol som følger: dyppe slide to gange i 95% ethanol, to gange i 100% ethanol, og to gange i xylen (sørg vævet synes klart, hvilke indikerer grundig dehydrering).
11. Monter slide med ikke-vandige permanente hårdt montering mellemstore og dækglasset.
12. Lad slæden tørre i 30 min.
13. Scan dias med nogen hele dias scanner og udskrive en stor, høj opløsning billede på 8 "x 11" papir.
14. Outline områder af interesse (typisk udført af en bestyrelse certificeret patolog) med en markør. Dette markup er guide for LCM procedure.

3. toluidinblåt Farvning af PEN-frame Slides

Bemærk: Ther sker samme dag som LCM. Brug depcH _{2 O} vand til alle løsninger. Gennemfør alle trin i RNase-frit område. Alle coplins skal rengøres med RNase-dekontaminerende opløsning.

1. Dagen for LCM fjerne PEN-frame slides fra -80 ° C fryser og hydrat ved forsigtigt dyppe glider ind 90% EtOH i 2 min og derefter 75% EtOH i 2 min.
   1. Forbered 0,5% toluidinblåt ved opløsning i molekylær biologi klasse vand derefter filtreres sterilisere gennem et 0,2 um filter og opbevar ved stuetemperatur. Denne opløsning kan genbruges i op til 6 måneder. Bemærk: Det er meget anbefales at fremstille opløsningen før som filtreringen kan tage et par timer.
2. Farv prostata væv ved forsigtigt at dyppe slides i 0,5% toluidinblåt for 5-30 sek. Affarvning vævet ved vask glider 2 gange i depcH ₂ O i 15 sekunder efterfulgt af 75% EtOH i 30 sek til 3 min. Bemærk: bejdse og affarvning gange kan justeres for at sikre god farvning. Prostata tendens til over pletten.

4. Laser-capture Micro-dissektion (LCM)

1. Umiddelbart før LCM, tør slide på en objektglasvarmer ved 42 ° C i 15 minutter. Tør kun det dias, der vil blive behandlet og opbevare resten på is indtil klar til dem.
2. Tænd LCM og computeren i denne rækkefølge, mikroskop strøm, laser-tasten, laser kontakten og derefter computeren. Start Laser mikrodissektion softwaren.
3. Bruge softwaren til at styre mikroskop for at indlæse dias og indsamling rør. Klik på "losse prøveholder", indlæse slide med afsnittene på objektglas holderen med vævet nedad og indsæt diasholderen i den relevante holder i mikroskopet, og klik derefter på "fortsæt".
   1. Klik på "losse indsamling rør", etiket og indlæse 0,5 ml rør på rør holder, og sæt den i den korrekte holder på instrumentet. Enganghætter er sikret, tilsættes 35 ul Lysis buffer til hætterne indsamling og forsøge at undgå bobler. Klik derefter på "OK".
      Bemærk: Hvis inddampning er et problem, fortynde buffer som følger: 25 ul lysepuffer med 10 pi depcH2O.
4. I softwaren, skal du vælge den position, hvor slæden er blevet placeret i diasholderen. Vælg indsamlingen hætten til at indsamle LCM prøven.
5. Visualisere og fokusere glide gennem computeren på 10X. Bruge softwaren til at kalibrere laseren ved at vælge "Laser" og derefter "kalibrere". Justere effekten, blænde og hastighed af laseren, vælge "laser" og derefter "kontrol" for at tillade laserstrålen at skære det valgte fuldstændigt og effektivt område. Gentag justeringer, indtil de lasersnit helt igennem vævet.
6. Brug patolog mark-up på 8 "x 11" som en guide, skal du bruge "tegne formen" værktøj til at afgrænse de ønskede områder epitheTrifolium i visningen og undgå at indsamle enhver stroma.
   Bemærk: Flere områder kan vælges inden for en visning, men ikke flytte til en anden visning uden først skæring ved at klikke på "cut form" værktøj.
   1. Hvis et område ikke bliver helt skåret af laseren bruge "flytte og skæres" værktøj til at gå over det manuelt. Fortsæt med at flytte målet til nye synspunkter og gentag laserskæring indtil slide er helt dissekeret eller den ønskede mængde væv er indsamlet (typisk 100 godartede kirtler giver 150-500 ng RNA). (se eksempel i figur 1A).
7. Fjern forsigtigt rør fra holderen indsamling og lukke hætterne, være opmærksomme på lysisbuffer og væv i hætterne. Kort fortalt centrifugeres i 30 sek for at indsamle væske og væv i bunden af ​​røret. Inkuber prøverne ved 42 ° C i 30 minutter og opbevares ved -80 ° C, indtil klar til RNA-isolering.

5. Total RNA Isolation med en Filter-baserede Kit og kvalitetsanalyse

1. Tø rørene på is og bringe volumenet af opløsningen til 100 pi.
2. Pre-våd mikrofilteret af et RNA isolation kit ved anvendelse af 30 pi ofLysis løsning til midten af ​​filteret og gør det muligt at suge whileperforming de næste to trin (mindst 5 min).
3. Tilsæt 3 pi LCM Additiv opløsning (leveres med kittet) til lysatet og der vortexes i 5 sek. Centrifuger i 30 sekunder for at opsamle væsken ved bunden af ​​røret.
4. Centrifugeres forvædet filter til ~ 30 sekunder ved tophastighed at fjerne væske.
5. Tilføj 1,25 volumener (i dette tilfælde 129 pi) af 100% ethanol til lysatet blandingen forsigtigt vortex eller pipette op og ned. ** Denne metode vil komme sig både store og små RNA arter.
6. Læg prøven på forvædet mikrofilter, og der centrifugeres ved 10.000 xg i 1 min at binde RNA til filteret. Vask derefter mikrofilter med 180 pi "Vaskeopløsning 1, R21; centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min.
   Bemærk: Fra dette punkt på alle centrifugeringer bør ske ved 13.000 xg, eller maksimal hastighed.
7. Vask filter to gange med 180 ul "Vask løsninger 2 og 3", henholdsvis som anvist af sættet protokollen. Centrifuger i 30 sek, derefter kasseres gennemstrømningen, og spin filteret i 1 min for at fjerne resterende væske og tørre filteret.
8. Overfør filter på en ny kollektion rør.
9. Varm elueringsopløsning til -95 ° C (leveres med sættet).
10. Anvend 10 pi forvarmet elueringsopløsning til centrum af filteret, lukke låget og gemme i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter centrifugeres i 1 minut til eluering af RNA og gentage dette trin én gang for at give ~ 20 pi RNA.
11. Udfør DNase I-behandling i 15 minutter ved 37 ° C.
12. Kvantificere RNA ved spektrofotometer med absorbans ved 260 nm. Forholdet mellem optisk densitet ved bølgelængder på 260 nm og 280 nm anvendes til at vurdere renheden afRNA (se tabel 1) ^15.

6. genekspressionsanalyse

Bemærk: Genekspression af lange RNA-arter (som mRNA'er og lncRNAs) er vist i trin 6.1 og korte RNA-arter (såsom microRNA) er vist i trin 6.2. Forskellige kits er tilgængelige for RT-qPCR og mængden af ​​RNA kræves afhænger af kit (så lidt som 10 ng). RNA-sekvensanalyse er beskrevet i 6.3.

1. Reverse transskribere (RT) RNA til cDNA blande 5 pi 20 ng / pl RNA-prøve med 5 pi RT Master Mix (RT buffer, dNTP'er, vilkårlige primere, RT-enzym, RNase inhibitor). Inkubér reaktionen i 25 minutter ved 25 ° C, derefter 120 minutter ved 37 ° C og 5 minutter ved 85 ° C.
2. RT-reaktionen 1:10 med RNase-frit vand fortynde og anvende 2,5 pi pr 10 pi qPCR reaktion med primere eller primer / probe-sæt til generne af interesse.
   Bemærk: For at lette analysen af ​​delvist nedbrudt RNA Det er tilrådeligt at bruge primere for kortere amplikoner (mindre end 100 bp) ^16. (tabel 2B)
   1. For microRNA ekspressionsanalyse køre RT-reaktionen ved at blande 5 pi 2-10 ng / pl RNA-prøve med 5 pi af RT Master mix.
      Bemærk: hver kommercielt tilgængeligt PCR-baseret microRNA Detection teknologi kræver brug af proprietære og specifikke RT primere.
3. Alternativt eller i tillæg til RT-PCR, bruge næste generation sekventering (RNA-seq eller små RNA-seq) at kvantificere forskellige arter af RNA'er. Typisk bruger 500 ng RNA til denne procedure (tabel 3) og udføre fremgangsmåden som angivet af fabrikanten og påvisning instrument.

Representative Results

I en tidligere undersøgelse viste vi brug af LCM at indsamle epitel og stromale væv til at sammenligne udtryk profilering ved RT-qPCR af mRNA og microRNA fra frosne og FFPE prostata væv fra den samme patient ^4. LCM er tidskrævende, især hvis store mængder RNA skal indsamles for næste generation sekventering analyse. Derfor er det afgørende at holde arbejdsplads og redskaber Rnase gratis. Det anbefales at undersøge kvalitetskontroller og celle-specificitet i RNA opsamlet (diskuteret mere detaljeret i det næste afsnit). Figur 1 viser en farvede prostata snit PEN-frame slide under mikroskop før og efter laser-opfange benign epitel .

Når prøven er opsamlet, og RNA ekstraheres omhyggeligt, er det vigtigt at vurdere RNA kvalitet og mængde som vist i tabel 1. Det er ikke ualmindeligt at observere lave 260/280 nm forhold. Koncentrering af RNAforbedre 260/280 nm forhold, men det kan også forårsage tab af små RNA-arter. Ud over kvalitetskontrol, er det afgørende at undersøge celle typespecifikke kontroller for at bekræfte specificiteten af laser-erobrede område af væv (Figur 1B - C). For eksempel i figur 1B ekspressionen af genet AMACR blev målt for at bekræfte prostatakræft epitelvæv i forhold til normale epitelvæv ,. I figur 1C ekspressionen af NKX3.1 bekræftede fraværet af stroma i LCM-samlet prøve. Kvaliteten af ​​RNA i prøven kan også compareed til RNA med kendt, god kvalitet RNA. RT-qPCR Ct-værdier for RNA'er isoleret fra LCM-collected- væv er i samme størrelsesorden som RNA indsamlet fra dyrkede primære epitelceller, hvilket bekræfter kvaliteten af lange og små RNA ekstraheret (tabel 2). Endelig Tabel 3 viser, at denne RNA er af tilstrækkelig kvalitet til næste generation RNA sequencing.

Figur 1: Indsamling af godartet epitel, prostatakræft epitel og stroma fra humant prostata ved hjælp af laser-capture mikro-dissektion (A) prostata biopsi farvet med toluidinblåt før og efter LCM-samling af den godartede epitel.. (B - C) Væv indsamlet af LCM fra 45 patienter udtrykker passende genmarkører for cellulær identitet ^7. (B) AMACR er en markør for prostatacancer og er kun påvises i cancervæv. (C) NKX3.1 er en markør for epitel og ikke kan detekteres i stromale væv. Dette tal er modificeret fra Giangreco et al., JSBMB 2015 ^7. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: RNA-kvalitet og kvantitet fra LCM-indsamlet prostata væv.

Tabel 2: RT-qPCR fra LCM indsamlet Prostata benign epitel.

Tabel 3: RNAseq fra LCM-samlet prostatavæv.

Discussion

Genekspression profilering fra humane prøver kan være udfordrende, ikke kun for kvaliteten eller kvantiteten af ​​væv til rådighed, men også for de forskellige histologiske enheder til stede i en given vævsprøve. Dette er en særlig udfordring i prostata, hvor godartede væv er stort set stromale væv og områder af kræft er blottet for stroma. LCM letter fysisk adskillelse af prostata stroma og epithel RNA til en mere nøjagtig signatur af to forskellige celletyper (figur 1A). I forhold til macrodissection eller hele vævsbehandling kan LCM adskille celle rum i godartede væv, men er betydeligt dyrere og arbejdskrævende.

Som i enhver teknik der er mulige faldgruber. For eksempel kan RNA kvalitet være delvist nedbrudt under indledende eksemplar indkøb eller under LCM og udvinding procedure. I det første tilfælde kan genekspression opnås måle forskellige korte AMPLIkoner af qPCR. I det andet tilfælde skal nøje RNase-frit behandling af alle de værktøjer og materialer skal træffes for at forhindre RNA-nedbrydning, samt en omhyggelig håndtering og behandling af vævssnit. Endvidere begrænser den tid, der bruges på et dias til mindre end 90 min fastholder RNA kvalitet under indsamlingen. Den største begrænsning af LCM teknik er adgang til et LCM instrument og er på arbejdsmarkedet forpligtet til at gøre LCM.

Der findes flere typer af laser-capture mikrodissektions mikroskoper til rådighed. Denne protokol beskriver anvendelsen af ​​et LCM der bruger laser til at afgrænse de områder, som falder derefter ind på en samling cap nedenfor. Denne type LCM er ideel til separering af epitel og stroma i prostatavæv, som indeholder diskrete flercellede områder til at indsamle, men denne type LCM er ikke egnet til isolation enkelt individuelle celler fra et væv. For eksempel bør denne protokol ikke anvendes til at indsamle resident makrofags, neuroendokrine celler eller lymfocytter, som ofte til stede som enkelte celler. Der er andre LCM instrumenter og metoder, der anvender en laser til at "skyde" enkeltceller fra væv på en membran hætte, hvilket letter isolering af disse andre celletyper.

Grundig kvalitetskontrol og karakterisering af RNA ikke kan overses. Absorbans ved 260 nm er velegnet til at kvantificere RNA til RT-qPCR undersøgelser (tabel 1), men for RNA-sekventering af et farvestof-baserede metode mere præcist kvantificerer RNA. Et andet vigtigt spørgsmål i RT-qPCR analyse er at undgå potentiel bias fra resterende DNA-kontaminering. Dette kan opnås ved anvendelse af primere, der spænder introns. Der er også høj patient heterogenitet i Husholderske genekspression derfor bruges flere Husholderske gener foreslås og vi anvender typisk 3-5 ^4,7-9 (figur 1B - C og tabel 2).

4. Næste generation RNA-sekventering er en effektiv teknik til at kvantificere ekspressionen både korte og lange RNA-arter. Næste generation sekventering tillader også opdagelsen af nye RNA arter ^13. Heldigvis er omkostningerne til næste generation sekventering faldende.

Sammenfattende denne protokol muliggør RNA isolering af homogene populationer af epitel eller stromale celler fra frosne prostata væv. RNA kan anvendes til utallige nedstrøms analyseteknikker at tilvejebringe et værktøj til præcis celletype-specifik genekspression i benigne og syge prostata. Denne type data bidrager til viden etd forståelse af, hvordan RNA-ekspression adskiller sig sygdomspatologien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111