Laser-fangst mikrodisseksjon of Human prostata Epitel for RNA-analyse

Introduction

Prostatakjertelen er en heterogen vev består av sekretorisk epitel arrangert i kjertel acini omgitt av fibromuscular stroma består hovedsakelig av glatt muskulatur ^en. Epithelial rommet består av fem forskjellige men organiserte celletyper: basal celler, sekretoriske celler, nevroendokrine celler, transitt forsterke celler og stamceller ^2. I prostata cancer (PCA), som oppstår fra den luminale epitelceller, fører til vekst av adenokarsinom en tydelig progressive reduksjonen av stromal kammeret ^3. Av disse grunner, vil vevsprøver har distinkte forskjeller i andelen av stromal og epitelial celletype basert på omfanget av PCa. Disse forskjellene kan føre til forutinntatte antagelser om genuttrykk data innhentet fra hele vev uten hensyn til mikrodisseksjon av den ønskede celletype. Derfor, for å fjerne denne skjevheten er det viktig å skille celletyper før RNA ekstraksjon oggenekspresjonsanalyser.

Macrodissection eller microdissection kan brukes til å fysisk separere velkarakteriserte epitel områder fra den omkringliggende stroma ^{4 -6.} Macrodissection gjøres typisk med et barberblad under et disseksjonsmikroskop og fungerer godt for separasjon av store PCa knuter fra stroma, men er ikke i stand til å fjerne benign epitel fra omkringliggende stroma (se eksempel benign prostata histologi i figur 1). Mikrodisseksjon med en laser (LCM) er vesentlig mer arbeidskrevende enn macrodissection, men kan svært nøyaktig dissekere godartet epitel ^fire.

Nye publikasjoner fra vårt laboratorium har vist at RNA kan med hell hentet av LCM fra enten formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) biopsier eller frosset vev ^4,7-9. De store utfordringene i LCM-RNA ekstraksjon er 1) å nøyaktig dissekere de ønskede områder av vev, og 2) å bevare RNA integritet under LCM og isolasjonsprosess ^4,10. RNA isolert fra rene cellepopulasjoner kan brukes genuttrykk analyse for ved flere metoder inkludert revers-transkripsjon kvantitativ PCR ^(RT-qPCR) 7,8, mikromatriser ^11, og dype -sequencing ^12-14.

Målet med denne protokollen er å isolere total RNA fra LCM prostatahyperplasi epitel fra frosset vev for nedstrøms genekspresjon analyser.

Protocol

Alle menneskelige vev som brukes for disse eksperimentene ble kjøpt via en Institutional Review Board godkjent protokoll og / eller fritak ved University of Illinois i Chicago.

1. § Fresh Frozen Prostata på PEN-lysbilde og på Charged Glass Slide

1. Dagen før, eller noen timer før seksjonering prøven, rent verktøy (dvs. pensel, tang, coplins, blader, PEN-innrammede lysbilder (hvis det ikke allerede RNase gratis), en ETOH trygg markør og en blyant) og innsiden av en RT kryostat med RNase-dekontaminering løsning ved hjelp av en sprayflaske og lab-våtservietter.
   1. Tillat RNase-dekontaminering løsning å sitte i 5 minutter før du tørker bort, skyll med depcH _{2 0} å fjerne overs RNase-dekontaminering løsning og en siste skylling med 70% EtOH (tilberedt med depcH _{2 0).}
      Merk: Det er viktig å opprettholde en RNase-fritt arbeidsområde. Alle coplins, verktøy, frossen monteringsmedium, blader og lysbilder brukes bør bare brukes for RNase gratis arbeidog aldri brukt i en standard ikke-RNase-fritt miljø. Alle instrumenter må behandles med en RNase dekontaminering løsning før hvert forsøk.
2. Cool kryostat til -24 ° C.
3. Plasser følgende renset RNase frie instrumenter inne kryostat avkjøles i minst 30 min før seksjonering: lysbilde Coplin fylt med 100% etanol, verktøy, små frosne vev kassetter og montering chuck.
4. Hente frosne prostata vev fra cryostorage og sted i en tørr-is-fylt skum bøtte for transport. Plasser vevet inn cryostat ekvilibrere til kryostaten temperatur i minst 30 min.
   Merk: Menneske prostata vev for laser-fangst mikro-disseksjon kan være enten fersk frosset eller formalinfiksert parafin-embedded (FFPE). Tidsbegrensninger og lysbilde forberedelse er litt annerledes mellom vevskilder. Her beskriver vi fremgangsmåten for frosne seksjoner.
5. Arbeide med en vev på en gang, og sprute frosset monteringsmedium inn i den.nedrem av kassetten og raskt å montere det frosne prostatavevet inn i den frosne monteringsmedium ved hjelp av de avkjølte tang.
6. Plasser kassetten med vev på chiller i kryostat for 5 min å sette frosne monteringsmedium.
7. Sprute en liten mengde av frosne montering medium på chucken og trykk forsiktig montert vev undersiden opp på den frosne monteringsmedium. La satt i kryostaten i 5 min for å tillate den frosne monteringsmedium for å størkne fullstendig.
8. Plasser chuck i holderen og trekk.
9. Lås håndtaket i låst posisjon og plassere et nytt blad på kryostat. For nedstrøms molekylære punktene som inkluderer en forsterkning trinn (dvs. qPCR) er det lurt å bruke et nytt blad for hver pasient for å hindre forurensning (eller flytte bladet over til å bruke området på bladet for den neste prøven).
10. Lås opp håndtaket og forsiktig avansere vevet for hånd eller med en fot pedal for å jevne og utsette vevet med 50 μm seksjoner inntil ønsket vev eksponering er nådd.
11. Juster kryostat til 5 mikrometer, kuttet en eller to seksjoner og plassere dem på ladet glass slide for hematoxylin og eosin (H & E) flekker (se trinn 2).
12. Umiddelbart plassere lysbilde i kald 100% etanol i 2 min.
13. Fjern belastet glass-slide fra etanol og la det tørke ved romtemperatur før du går videre til H & E farging (trinn 2).
14. Plasser RT PEN-frame sklie på en ramme supporter.
15. Juster kryostat til 10 mikrometer og plassere deler på de RT PEN ramme lysbilder. En til fire seksjoner kan plasseres på hvert bilde, avhengig av vevet størrelse.
16. Umiddelbart stupe lysbilde i kald 100% etanol i 2 min.
17. Fjern de PEN-ramme lysbilder fra etanol og lagre raset i et lysbilde boks i et tørkeboks i en -80 ° C fryser til den er klar for LCM. Tre dager er maksimal lagringstid for optimal RNA utvinning.
18. Fortsett med trinn 2 for KUN ladet glass glede. Fortsett med trinn 3 for PEN-frame lysbilde.

2. Hematoxylin og eosin-Y (H & E) Stain for Histologisk Mark-up

Merk: Dette hvis for vevet på belastes glass-slide og IKKE PEN-frame sklie for LCM.

1. Hydrat avsnittene om den ladede glass-slide dyppe objektglasset ved hjelp av gradert etanol på følgende måte: dyppe objektglasset to ganger i 100% etanol i 3 min, to ganger i 95% etanol i 3 min, en gang i 70% etanol i 3 min og to ganger i destillert H _{2 O} til 3 min.
   1. Forbered syrealkoholløsning: 99 ml 70% etanol + 1 ml 1% HCl og 0,1% natrium-bikarbonat-oppløsning: 0,1 g natriumbikarbonat i 100 ml destillert H _{2 O}
2. Dypp raset i Hematoxylin Gill II (0,4%) i 5 min.
3. Vask av overflødig flekken i jevn rennende vann H _{2 O} for 3 min.
4. Dypp raset 10 ganger i syre alkohol
5. Vask raset i rennende vann H _{2 O} for 3 min.
6. Dypp raseti 0,1% natrium-bikarbonat-oppløsning i 30-60 sekunder for å slå den lilla farge til blått.
7. Vask raset i rennende vann H _{2 O} for 3 min.
8. Skyll raset i 95% etanol med 10 dips.
9. Dypp raset i Eosin Y 2-3 ganger i 15 sekunder totalt.
10. Dehydrerer skyv gjennom gradert etanol som følger: dyppe raset to ganger i 95% etanol, to ganger i 100% etanol, og to ganger i Xylen (pass på at vevet synes klart noe som indikerer grundig dehydrering).
11. Monter lysbilde med ikke-vandig permanent hardt monteringsmedium og dekkglass.
12. La raset tørke i 30 min.
13. Scan lysbilde med noen hele lysbilde scanner og skriver ut et stort, bilde med høy oppløsning på 8 "x 11" papir.
14. Outline områder av interesse (vanligvis gjort av et styre sertifisert patolog) med en markør. Dette markup er guiden for LCM prosedyren.

3. toluidinblått Farging av PEN-ramme Slides

Merk: Ther er gjort samme dag som LCM. Bruk depcH _{2 O} vann for alle løsninger. Fullfør alle trinnene i RNase-fritt område. Alle coplins må rengjøres med RNase-dekontaminering løsning.

1. Dagen for LCM fjerne PEN-ramme lysbilder fra -80 ° C fryser og hydrat ved forsiktig dyppe lysbilder i 90% EtOH i 2 min deretter 75% EtOH i 2 min.
   1. Forbered 0,5% toluidinblått ved oppløsning i molekylærbiologi grade vann deretter filtrere sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevar ved RT. Denne løsningen kan brukes om igjen i opptil 6 måneder. Merk: Det er sterkt anbefalt å forberede løsningen før som filtrering kan ta noen timer.
2. Flekker på prostatavevet ved forsiktig dyppe glir inn 0,5% toluidinblått for 5-30 sek. Destain vevet ved vasking 2 ganger glir i depcH _{2 O} i 15 sekunder etterfulgt av 75% EtOH i 30 sekunder til 3 minutter. Merk: beis og destain tider kan justeres for å sikre god farging. Prostata har en tendens til å over flekken.

4. Laser-fangst Micro-disseksjon (LCM)

1. Umiddelbart før LCM, tørr lysbilde på et lysbilde varmere ved 42 ° C i 15 min. Tørr bare lysbildet vil bli behandlet og lagre resten på is inntil den er klar for dem.
2. Slå på LCM og datamaskinen i denne rekkefølgen, mikroskop kraft, laseren nøkkelen, laseren bryteren og deretter datamaskinen. Start Laser mikrodisseksjon programvare.
3. Bruke programvaren til å kontrollere mikroskop for å laste lysbilder og samling rør. Klikk på "losse prøveholderen", legger raset med seksjonene på objektglass holder med vevet vendt ned og sett lysbildeholderen i det riktige sporet i mikroskopet, klikk deretter på "fortsett".
   1. Klikk på "losse samling rør", etikett og legg 0,5 ml rør på tube holderen og sett den inn i det riktige sporet i instrumentet. En gangcaps er sikret, legger 35 mL av Lysis buffer på oppsamlings caps og prøve å unngå bobler. Klikk deretter på "OK".
      Merk: Hvis fordampning er et problem, fortynne buffer som følger: 25 ul lysisbuffer med 10 mL depcH2O.
4. I programvaren, velger posisjonen hvor raset har blitt plassert i lysbildeholderen. Velg oppsamlingshetten for å samle LCM prøven.
5. Visualisere og fokusere skyv gjennom datamaskinen på 10X. Bruke programvaren til å kalibrere laseren ved å velge "Laser" og deretter "kalibrere". Justere kraften, blenderåpning og hastigheten av laser, velge "laser" og deretter "kontroll" for å tillate at laserstrålen for å kutte det valgte fullstendig og effektivt område. Gjenta justeringer før laser kutt helt gjennom vevet.
6. Bruke patologen mark-up 8 "x 11" som en guide, bruk "tegne formen" verktøy for å omskrive de ønskede områdene epitheLium i visningen, og unngå å samle noen stroma.
   Merk: Flere områder kan velges innen ett syn, men ikke flytte til en annen visning uten først skjæring ved å klikke på "cut form" verktøyet.
   1. Hvis et område ikke blir helt kuttet av laser bruke "flytte og cut" verktøy for å gå over den manuelt. Fortsette å bevege objektivet til nye synspunkter og gjenta laserskjæring inntil glide er fullstendig dissekert eller den ønskede mengden av vev er blitt samlet opp (vanligvis 100 godartet kjertler ga 150-500 ng av RNA). (se eksempel i Figur 1A).
7. Fjern forsiktig rørene fra samlingen holderen og lukke caps, å være oppmerksom på lysisbuffer og vev i caps. I korthet sentrifuger i 30 sekunder for å samle væske og vev i bunnen av røret. Prøvene inkuberes ved 42 ° C i 30 minutter og oppbevares ved -80 ° C inntil de er klare for RNA-isolering.

5. Total RNA Isolation med Filter-baserte Kit og Quality Analyse

1. Tine opp rørene på is, og bringe volumet av oppløsningen til 100 ul.
2. Pre-fukte mikrofilter av en RNA isolering kit ved å bruke 30 mL ofLysis Solution til sentrum av filteret og la den suge whileperforming de neste to trinn (minst 5 min).
3. Tilsett 3 mL av LCM Additiv løsning (i settet) til lysatet og bland ved virvling i 5 sek. Sentrifuger i 30 sekunder for å samle opp væske ved bunnen av røret.
4. Sentrifuger pre-fuktet filter for ~ 30 sek i full fart for å fjerne væske.
5. Legg 1,25 volumer (i dette tilfelle 129 pl) i 100% etanol for å lysatet blanding, forsiktig vortex eller pipette opp og ned. ** Denne metoden vil komme både store og små RNA arter.
6. Laste prøven på pre-fuktet mikrofilter, og sentrifuger ved 10 000 xg i 1 min for å binde RNA til filteret. Deretter vaskes mikrofilter med 180 mL av "Wash løsning 1, R21; sentrifuger ved 10 000 x g i 1 min.
   Merk: Fra nå av alle sentrifugeringer bør gjøres på 13 000 xg, eller maksimal hastighet.
7. Vask filtrere to ganger med 180 ul "Vask løsninger 2 og 3", henholdsvis som anvist av kit-protokollen. Sentrifuger i 30 sek, og deretter kaste strømmen gjennom, og spinne filteret i 1 min for å fjerne resterende væske og for å tørke filter.
8. Overfør filter til en ny samling rør.
9. Varm elueringsoppløsning til -95 ° C (følger med kit).
10. Anvende 10 ul forvarmet elueringsoppløsning til midten av filteret, lukke lokket og oppbevar i 5 minutter ved RT. Deretter sentrifugeres i 1 min for å eluere RNA, og gjenta dette trinnet en tid for å gi ~ 20 ul RNA.
11. Utføre behandlingen DNase I i 15 minutter ved 37 ° C.
12. Kvantifisere RNA ved spektrofotometer med absorbans ved 260 nm. Forholdet av optisk densitet ved bølgelengder på 260 nm og 280 nm blir brukt til å vurdere renhetenRNA (se tabell 1) ^15.

6. Gene Expression Analysis

Merk: Gene ekspresjon av lange RNA-artene (som mRNA og lncRNAs) er vist i trinn 6.1 og korte RNA-arter (som microRNAs) er vist i trinn 6,2. Forskjellige Pakkene er tilgjengelig for RT-qPCR og mengden av RNA som er nødvendig varierer med kit (så lite som 10 ng). RNA-sekvensanalyse er beskrevet i 6.3.

1. Omvendt transkriberer (RT) RNA til cDNA blande 5 pl av 20 ng / mL RNA prøve med 5 mL av RT mester mix (RT buffer, dNTP, tilfeldige primere, RT enzym, RNase hemmer). Inkuber reaksjonsblandingen i 25 minutter ved 25 ° C, deretter 120 minutter ved 37 ° C og 5 minutter ved 85 ° C.
2. Fortynne RT reaksjon 1:10 med RNase fritt vann og bruke 2,5 mL per 10 mL qPCR reaksjon med primere eller primer / probe sett for genene av interesse.
   Merk: For å legge til rette for analyse av delvis degradert RNA Det anbefales å bruke primere for kortere amplikonene (mindre enn 100 bp) ^16. (Tabell 2B)
   1. MikroRNA uttrykk analyse for kjøre RT reaksjon ved å blande 5 mL av 2-10 ng / mL RNA prøve med 5 mL av RT mester mix.
      Merk: hver kommersielt tilgjengelige PCR-basert mikroRNA oppdagelsen teknologien krever bruk av proprietære og spesifikke RT primere.
3. Alternativt eller i tillegg til RT-PCR ved å bruke neste generasjon sekvensering (RNA-seq eller små-RNA-seq) for å kvantifisere forskjellige arter av RNA. Vanligvis bruker 500 ng av RNA for denne prosedyren (tabell 3), og utføre fremgangsmåten som angitt av produsenten og detektor.

Representative Results

I en tidligere studie vi demonstrerte bruken av LCM å samle epitel og stromal vev for å sammenligne uttrykk profilering av RT-qPCR av mRNA og microRNAs fra frosne og FFPE- prostata vev fra samme pasient ^fire. LCM er tidkrevende, særlig hvis stor mengde RNA som skal samles inn for neste generasjon sekvensanalyse. Derfor er det viktig å holde arbeidsrommet og verktøy RNase gratis. Det anbefales å undersøke kvaliteten og celle-spesifisitetskontroller i RNA samlet opp (diskutert i nærmere detalj i det neste avsnitt). Figur 1 viser et farget prostata seksjon på en PEN-ramme glide under mikroskopet før og etter laser-oppfangende benign epitel .

Når prøven blir samlet og RNA er omhyggelig ekstraheres, er det viktig å vurdere RNA kvalitet og mengde som vist i tabell 1. Det er ikke uvanlig å observere lave 260/280 nm forhold. Konsentrere RNA vilforbedre 260/280 nm prosenter, men det kan også føre til tap av små RNA arter. I tillegg til kvalitetskontroller, er det viktig å undersøke celletypespesifikke kontroller for å bekrefte spesifisiteten av den laser fanget område av vev (figur 1 B - C). For eksempel, i figur 1B ekspresjon av AMACR genet ble målt for å bekrefte prostatakreft epitelvev i forhold til det normale epitelvev ,. I figur 1C ekspresjonen av NKX3.1 bekreftet fravær av stroma i LCM-innsamlet prøven. Kvaliteten av RNA i prøven kan også compareed til RNA med kjent, god kvalitet RNA. RT-qPCR Ct-verdier for RNA isolert fra LCM-collected- vev er i samme størrelsesorden som RNA samlet fra dyrkede primære epitelceller, bekrefter kvaliteten av lange og små RNA ekstraheres (tabell 2). Endelig Tabell 3 viser at dette RNA er av tilstrekkelig kvalitet for neste generasjons RNA sequencing.

Figur 1: Innsamling av godartet epitel, prostatakreft epitel og stroma fra menneskelige prostata med laser-fangst mikro-disseksjon (A) prostatabiopsi farget med toluidinblått før og etter LCM-samling av benign epitel.. (B - C) Vev samlet inn av LCM fra 45 pasienter uttrykke passende genmarkører til mobil identitet ^7. (B) AMACR er en markør for prostatakreft, og er bare påvises i kreftvevet. (C) NKX3.1 er en markør for epitel, og er ikke detekterbar i stromale vev. Dette tallet er endret fra Giangreco et al., JSBMB 2015 ^7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: RNA kvalitet og kvantitet fra LCM-samlet prostatavevet.

Tabell 2: RT-qPCR fra LCM samlet Prostata godartet epitel.

Tabell 3: RNAseq fra LCM-samlet prostatavevet.

Discussion

Genekspresjon profilering fra humane prøvene kan være utfordrende, ikke bare for den kvalitet eller kvantitet av vev er tilgjengelig, men også for de ulike histologiske-enhetene i en gitt vevsprøve. Dette er spesielt utfordrende i prostata hvor godartet vev er i stor grad stromale vev og områder av kreft er blottet for stroma. LCM muliggjør fysisk separasjon av prostatisk stroma og epitel RNA for en mer nøyaktig signatur av de to forskjellige celletyper (figur 1A). I forhold til macrodissection eller hel vev behandling, kan LCM atskilte cellekamre i benigne vev, men er betydelig mer kostbart og arbeidskrevende.

Som i enhver teknikk er det mulige fallgruver. For eksempel kan RNA kvalitet være delvis degradert under innledende prøve anskaffelse eller under LCM og ekstraksjonsfremgangsmåten. I det første tilfellet kan genekspresjon oppnås måling av forskjellige kort amplikoner av qPCR. I det andre tilfellet, bør samvittighetsfull RNase fri behandling av alle de verktøy og materiale tas for å forhindre RNA-nedbrytning, så vel som en forsiktig håndtering og prosessering av vevssnittene. Videre begrenser tiden brukt på ett lysbilde til mindre enn 90 min opprett RNA kvalitet under innsamlingsprosessen. Den største begrensningen av LCM teknikken er det tilgang til en LCM instrument og er det arbeid som kreves for å gjøre LCM.

Det finnes flere typer laser-fangst mikrodisseksjon mikroskoper tilgjengelig. Denne protokollen beskriver bruk av en LCM som bruker laser for å omgi de områder, som så faller inn i en samling cap nedenfor. Denne type LCM er ideell for separasjon av epitel og stroma i prostatavev som inneholder diskrete flercellede områder for å samle inn, men denne type LCM er ikke egnet for isolasjonsenkelt individuelle celler fra et vev. For eksempel bør denne protokollen ikke brukes til å samle resident makrofags, nevroendokrine celler eller den infiltrerende lymfocytter, som ofte er tilstede som enkeltceller. Det finnes andre LCM instrumenter og metoder som benytter en laser for å "skyte" enkle celler fra vev på en membranhetten, noe som letter isolering av disse andre celletyper.

Grundig kvalitetskontroll og karakterisering av RNA kan ikke bli oversett. Absorbans ved 260 nm er egnet for å kvantifisere RNA for RT-qPCR-studier (tabell 1), men for RNA-sekvensering av et fargestoffbasert metode mer nøyaktig kvantifisering av RNA. En annen viktig sak i RT-qPCR analyse er å unngå potensiell skjevhet fra rest DNA forurensning. Dette kan oppnås ved å bruke primere som spenner introner. Det er også høy pasient heterogenitet i husmor genekspresjon, og bruk av multiple gener Hushjelp er foreslått, og vi bruker vanligvis tre til fem ^4,7-9 (figur 1 B - C og tabell 2).

4. Neste generasjons RNA sekvensering er en effektiv teknikk for å kvantifisere uttrykk både for korte og lange RNA arter. Neste generasjons sekvensering gir også oppdagelsen av nye RNA arter ^13. Heldigvis er kostnaden for neste generasjons sekvense avtagende.

I sammendraget, gjør denne protokollen RNA isolering av homogene bestander av epitelceller eller stromale celler fra frossen prostatavevet. RNA kan brukes for en rekke nedstrøms analyseteknikker for å tilveiebringe et verktøy for nøyaktig celletype-spesifikk genekspresjon i benign prostata og syke. Denne type data bidrar til kunnskap end forståelse av hvordan RNA uttrykk skiller seg i sykdom patologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111