Introduction
בלוטת הערמונית היא רקמה הטרוגנית מורכבת מאפיתל ההפרשה מסודר בacini בלוטות מוקפים stroma fibromuscular מורכב בעיקר של שריר חלק 1. תא אפיתל מורכב מחמישה סוגי תאים שונים, אך מאורגנים: תאי בסיס, תאי הפרשה, תאים נוירואנדוקריניים, תאי הגברת מעבר ותאי גזע 2. בסרטן הערמונית (PCA), הנובע מתאי אפיתל luminal, הצמיחה של אדנוקרצינומה גורמת ירידה הדרגתית מאליי של תא סטרומה 3. מסיבות אלה, יהיו דגימות רקמת הבדלים ברורים בשיעור של סטרומה וסוג תא אפיתל המבוסס על היקף PCA. הבדלים אלה יכולים להוביל להנחות מגמתיות של נתונים ביטוי גנים שנרכשו מכל רקמות ללא קשר לmicrodissection של סוג התא הרצוי. לכן, כדי להסיר הטיה זו היא חיוני על מנת להפריד בין סוגי תאים לפני מיצוי RNA וניתוח ביטוי גנים.
Macrodissection או microdissection ניתן להשתמש כדי להפריד פיזי אזורי אפיתל מאופיינים היטב מסטרומה סביב 4 -6. Macrodissection נעשה בדרך כלל בסכין גילוח תחת מיקרוסקופ לנתח ועובד היטב להפרדת PCA הגדולה גושים מסטרומה, אבל הוא לא מסוגל להסיר אפיתל השפיר מסביב סטרומה (ראה דוגמא של היסטולוגיה ערמונית שפירה באיור 1). Microdissection עם לייזר (LCM) הוא באופן משמעותי יותר מאשר עבודה אינטנסיבי macrodissection, אבל מאוד מדויק יכול לנתח אפיתל השפיר 4.
הפרסומים אחרונים מהמעבדה שלנו הראו כי RNA ניתן לחלץ בהצלחה על ידי LCM משתי ביופסיות-קבוע פורמלין מוטבע פרפין (FFPE) או רקמה קפוא 4,7-9. האתגרים המרכזיים בחילוץ LCM-רנ"א הם 1) לנתח במדויק את האזורים הרצויים של הרקמה, ו- 2) לשמר Rשלמות NA במהלך 4,10 תהליך LCM והבידוד. RNA מבודד מאוכלוסיות תאים טהורות יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים על ידי מספר שיטות כולל הפוך-שעתוק PCR כמותי (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, ו-sequencing העמוק 12-14.
המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד RNA הכולל מהאפיתל של הערמונית LCM מהרקמה קפוא לביטוי גנים במורד הזרם מנתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הרקמות האנושיות המשמשות לניסויים אלה נרכשו באמצעות פרוטוקול הסקירה מוסדי אישר דירקטוריון ו / או פטור באוניברסיטת אילינוי בשיקגו.
1. סעיף קפואים ערמונית על PEN-שקופיות ועל שקופיות זכוכית טעונות
- היום לפני או כמה שעות לפני חתך המדגם, כלים נקיים (כלומר, מברשת, מלקחיים, coplins, להבים, שקופיות ממוסגרות-PEN (אם לא כבר RNase חינם), סמן ETOH בטוח ועיפרון) ואת החלק הפנימי של cryostat RT עם RNase-decontaminating פתרון באמצעות בקבוק תרסיס ומעבדת מגבונים.
- לאפשר פתרון decontaminating-RNase לשבת במשך 5 דקות לפני מוחה, לשטוף עם depcH 2 0 להסיר נשאר RNase-decontaminating פתרון ושטיפה סופית עם EtOH 70% (שהוכנה עם depcH 2 0).
הערה: זה חיוני כדי לשמור על סביבת עבודה נטול RNase. כל coplins, כלים, הרכבה בינונית קפוא, להבים ושקופיות בשימוש יש להשתמש אך ורק לעבודה חופשית RNaseומעולם לא השתמש בסביבה חופשית שאינו RNase סטנדרטית. יש להתייחס אל כל המכשירים עם פתרון טיהור RNase לפני כל ניסוי.
- לאפשר פתרון decontaminating-RNase לשבת במשך 5 דקות לפני מוחה, לשטוף עם depcH 2 0 להסיר נשאר RNase-decontaminating פתרון ושטיפה סופית עם EtOH 70% (שהוכנה עם depcH 2 0).
- cryostat מגניב -24 מעלות צלזיוס.
- הנח את מכשירי RNase ניקו הבאים בחינם בתוך cryostat להתקרר לפחות 30 דקות לפני חתך: עם 100% אתנול, כלים, קלטות רקמה קפוא קטנות וצ'אק הרכבה מלא coplin שקופיות.
- אחזר רקמת ערמונית קפוא מcryostorage והמקום לדלי קצף יבש מלא קרח לתחבורה. הנח רקמה לתוך cryostat לאזן לטמפרטורת cryostat לפחות 30 דקות.
הערה: רקמות ערמונית אדם למייקרו לנתיחה לייזר לכידה יכולות להיות טריים קפוא או פורמלין-קבוע מוטבע פרפין (FFPE). אילוצי הזמן והכנת שקופיות שונים במקצת בין מקורות רקמות. כאן אנו מתארים את השלבים לסעיפים קפוא. - לעבוד עם רקמה אחת בכל פעם, ולהשפריץ הרכבה בינונית קפוא לbottoמ 'של הקלטת ובמהירות הר רקמת הערמונית הקפואה להרכבה בינונית הקפואה באמצעות המלקחיים המצוננים.
- מניחים את הקלטת עם רקמה על ילר בcryostat למשך 5 דקות כדי להגדיר הרכבה בינונית קפוא.
- להשפריץ כמות קטנה של מדיום גובר קפוא על צ'אק ולחץ בזהירות בצד תחתון רקמה רכובה על גבי ההרכבה בינונית הקפואה. תן להגדיר בcryostat במשך 5 דקות, כדי לאפשר הרכבה בינונית הקפואה כדי לחזק לחלוטין.
- הנח צ'אק לבעל ולהדק.
- לנעול את הידית במצב נעול ולמקם את הלהב חדש על cryostat. עבור נקודות קצה מולקולריות במורד הזרם הכוללים צעד הגברה (כלומר, qPCR) רצוי להשתמש בלהב חדש לכל מטופל על מנת למנוע זיהום (או להזיז את הלהב על להשתמש שטח של הלהב לדוגמא הבאה).
- לפתוח את הידית ולקדם בזהירות את הרקמה ביד או עם דוושת רגל לאבן ולחשוף את הרקמה עם 50 μחלקים מ 'עד לחשיפת הרקמה הרצויה הוא הגיע.
- התאם cryostat עד 5 מיקרומטר, לחתוך חלק אחד או שניים ומניח אותם על גבי טעונות שקופיות זכוכית לhematoxylin ו eosin (H & E) מכתים (ראה שלב 2).
- מייד במקום להחליק לתוך אתנול 100% הקרים למשך 2 דקות.
- הסר את שקופיות זכוכית טעונות מאתנול ולתת לו להתייבש בRT לפני שתמשיך לצביעת H & E (שלב 2).
- מניחים שקופית PEN-מסגרת RT על תומך מסגרת.
- התאם cryostat 10 סעיפי מיקרומטר ומקום על גבי שקופיות מסגרת RT PEN. אחת לארבעה חלקים יכולים להיות מקום על כל שקופית בהתאם לגודל הרקמה.
- מייד לצלול לתוך שקופיות אתנול 100% הקרים למשך 2 דקות.
- הסר את שקופיות PEN-מסגרת מאתנול ולאחסן את השקופיות בתיבת שקופיות בתיבת ייבוש בהקפאה -80 ° C עד מוכן לLCM. שלושה ימים הוא זמן האחסון המרבי להתאוששות אופטימלית RNA.
- להמשיך עם שלב 2 רק הזכוכית הטעונה החליקהדואר. להמשיך בשלב 3 לשקופית PEN-מסגרת.
2. Hematoxylin ו Eosin-Y (H & E) כתמים להיסטולוגית Mark-up
הערה: אם זה לרקמה בשקופית הזכוכית הטעונה ולא את שקופית PEN-המסגרת לLCM.
- מימה הסעיפים בשקופית הזכוכית הטעונה טבילת החלק דרך אתנול מדורג כדלקמן: לטבול את השקופיות פעמיים ב 100% אתנול 3 דקות, פעמיים באתנול 95% במשך 3 דקות, פעם באתנול 70% במשך 3 דקות ושני פעמים בH 2 O מזוקק במשך 3 דקות.
- הכן פתרון אלכוהול חומצה: 99 מיליליטר אתנול 70% + 1 מיליליטר 1% HCl 0.1% ופתרון סודה לשתייה: H סודיום ביקרבונט 0.1 גרם ב 100 מיליליטר מזוקק 2 O
- טובלים את השקופיות בHematoxylin גיל השני (0.4%) במשך 5 דקות.
- לשטוף את הכתם עודף בH רז ריצה היציב 2 O 3 דקות.
- טובלים את השקופית 10 פעמים באלכוהול חומצה
- לשטוף את השקופית בריצה ברז H 2 O 3 דקות.
- טובלים את השקופיותב 0.1% פתרון סודיום ביקרבונט במשך 30-60 שניות כדי להפוך את הצבע הסגלגל לכחול.
- לשטוף את השקופית בריצה ברז H 2 O 3 דקות.
- יש לשטוף את השקופית באתנול 95% עם 10 מטבלים.
- טובלים את השקופיות בזמני Eosin-Y 2-3 לסך 15 שניות.
- מייבש את השקופית באמצעות אתנול מדורג כדלקמן: לטבול את השקופית שתי פעמים באתנול 95%, פי שתיים ב 100% אתנול, ושתי פעמים בקסילן (לוודא הרקמה מופיעה ברורה המצביעה על התייבשות יסודית).
- הר השקופיות עם תלוש בלתי מימי קבוע קשה הרכבה בינונית וכיסוי.
- בואו יבשות שקופיות למשך 30 דקות.
- שקופיות סריקה עם כל סורק שקופיות שלם ולהדפיס תמונה גדולה, ברזולוציה גבוהה על גבי 8 "x 11" נייר.
- אזורי מתאר של עניין (נעשו בדרך כלל על ידי פתולוג מוסמך לוח) עם סמן. סימון זה הוא המדריך להליך LCM.
3. toluidine הכחול הכתמה של שקופיות PEN-מסגרת
הערה: Thהוא נעשה באותו היום כLCM. השתמש depcH 2 O מים לכל הפתרונות. השלם את כל השלבים באזור RNase ללא. כל coplins יש לנקות עם פתרון RNase-decontaminating.
- היום של LCM להסיר את שקופיות PEN-מסגרת מהמקפיא -80 ° C ומימה בשקופיות בעדינות טובלות 90% EtOH 2 דקות לאחר מכן 75% EtOH 2 דקות.
- הכן 0.5% toluidine כחולים על ידי ההמסה במי כיתה ביולוגיה מולקולריות אז לסנן לעקר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר וחנות ב RT. פתרון זה עשוי להיות שימוש חוזר לתקופה של עד 6 חודשים. הערה: מומלץ מאוד להכין את הפתרון לפני כסינון יכול לקחת כמה שעות.
- להכתים את רקמת הערמונית בעדינות על ידי טבילת שקופיות לתוך 0.5% toluidine כחול ל5-30 שניות. Destain הרקמה על ידי שטיפת שקופיות 2 פעמים בdepcH 2 O במשך 15 שניות ואחריו 75% EtOH למשך 30 שניות עד 3 דקות. הערה: ניתן להתאים פעמים כתם וdestain כדי להבטיח צביעה טובה. ערמונית נוטה על כתם.
4. בלייזר ללכוד מיקרו-נתיחה (LCM)
- מייד לפני LCM, שקופיות יבשות בשקופית חמה על 42 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. יבש רק את השקופית שתעובד ולאחסן את שאר על קרח עד מוכן עבורם.
- הפעל LCM ומחשב בצו זה, כוח מיקרוסקופ, מפתח הלייזר, מתג הלייזר ולאחר מכן למחשב. הפעל את תוכנת Microdissection הלייזר.
- להשתמש בתוכנה כדי לשלוט במיקרוסקופ כדי לטעון את השקופיות וצינורות איסוף. לחץ על "בעל מדגם לפרוק", טען את השקופיות עם החלקים על מחזיק שקופיות מיקרוסקופ עם הרקמה פונה כלפי מטה והכנס את מחזיק השקופיות בחריץ המתאים במיקרוסקופ, לאחר מכן לחץ על "המשך".
- לחץ על "צינורות אוסף לפרוק", תווית ולטעון 0.5 מיליליטר צינורות על בעל צינור ולהכניס אותו לחריץ המתאים במכשיר. פַּעַםכובעים מובטחים, להוסיף 35 μl של תמוגה חיץ לכובעי האוסף ולנסות למנוע בועות. לאחר מכן לחץ על "אישור".
הערה: אם אידוי הוא נושא, לדלל את החיץ כדלקמן: מאגר תמוגה 25 μl עם 10 μl depcH2O.
- לחץ על "צינורות אוסף לפרוק", תווית ולטעון 0.5 מיליליטר צינורות על בעל צינור ולהכניס אותו לחריץ המתאים במכשיר. פַּעַםכובעים מובטחים, להוסיף 35 μl של תמוגה חיץ לכובעי האוסף ולנסות למנוע בועות. לאחר מכן לחץ על "אישור".
- בתוכנה, לבחור את המיקום שבו השקופיות הושמה בהחזיק השקופיות. בחר את כובע האוסף לאסוף דגימת LCM.
- דמיינו ולמקד את החלק דרך המחשב ב10X. להשתמש בתוכנה כדי לכייל את הלייזר על ידי בחירה "לייזר" ואז "לכייל". התאם את הכח, צמצם ומהירות של הלייזר, בחירה "לייזר" ואז "שליטה" כדי לאפשר את קרן הלייזר לחתוך את האזור שנבחר לחלוטין וביעילות. חזור על התאמות עד קיצוצי הלייזר דרך הרקמה לחלוטין.
- שימוש בסימן-עד פתולוג 8 "x 11" כמדריך, להשתמש בכלי "לצייר צורה" להותיר את האזורים הרצויים של epitheאיליום בתצוגה ולהימנע מאיסוף כל סטרומה.
הערה: ניתן לבחור אזורים מרובים בתצוגה אחת, אבל לא לעבור לתצוגה אחרת ללא חיתוך ראשון על ידי לחיצה על האפשרות "לחתוך צורה".- אם אזור אינו מקבל לחתוך לחלוטין על ידי הלייזר להשתמש באפשרות "להזיז ולחתוך" לעבור עליו באופן ידני. להמשיך לנוע האובייקטיבי לדעות חדשות ולחזור על חיתוך לייזר עד שקופית גזור או את הכמות הרצויה של רקמה נאספה לחלוטין (בדרך כלל 100 בלוטות שפירות להניב 150-500 ng של RNA). (ראה דוגמא באיור 1 א).
- מוציא בזהירות צינורות מבעל האוסף ולסגור את הכובעים, להיות ערים למאגר תמוגה והרקמות בכמוסות. בקצרה צנטריפוגות למשך 30 שניות כדי לאסוף נוזלים ורקמות בחלק התחתון של הצינור. דגירה הדגימות על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לבידוד RNA.
5. בידוד RNA סה"כ עם Filקיט מבוסס ter וניתוח איכות
- להפשיר את הצינורות על קרח ולהביא את הנפח של הפתרון לμl 100.
- טרום להרטיב את מסנן מיקרו של ערכת בידוד RNA על ידי יישום 30 μl ofLysis פתרון למרכז של המסנן ולאפשר לו לספוג whileperforming שני השלבים הבאים (לפחות 5 דקות).
- הוסף 3 μl של פתרון LCM תוסף (מסופק בערכה) לlysate ומערבבים ידי vortexing למשך 5 שניות. צנטריפוגה למשך 30 שניות כדי לאסוף את הנוזלים בחלק התחתון של הצינור.
- צנטריפוגה המסנן רטוב מראש ל~ 30 שניות במהירות שיא כדי להסיר נוזל.
- הוסף 1.25 כרכים (במקרה μl 129 זה) של 100% אתנול לתערובת lysate, בעדינות מערבולת או פיפטה למעלה ולמטה. ** שיטה זו תתאושש שני מיני RNA קטנים וגדולים.
- טען את המדגם על מסנן מיקרו רטוב מראש, וצנטריפוגות ב 10,000 XG ל1 דקות כדי לאגד את הרנ"א למסנן. לאחר מכן לשטוף מסנן מיקרו עם 180 μl של "פתרון לשטוף 1, R21; צנטריפוגות ב 10,000 XG דקות 1.
הערה: מכאן ואילך כל centrifugations זה צריך להיעשות ב13,000 XG, או מהירות המרבית. - לשטוף לסנן פעמיים עם 180 μl של "פתרונות לשטוף 2 ו -3", בהתאמה לפי הוראות פרוטוקול הערכה. צנטריפוגה למשך 30 שניות, ואז זורקת את הזרימה דרך, ולסובב את מסנן דקות 1 כדי להסיר נוזל שייר ולייבש את המסנן.
- העבר את המסנן לצינור אוסף חדש.
- פתרון חם elution ל-95 מעלות צלזיוס (מסופק עם הערכה).
- החל 10 μl של פתרון elution שחומם מראש למרכז של המסנן, לסגור את המכסה ולאחסן למשך 5 דקות על RT. אז צנטריפוגות דקות 1 לelute RNA, ולחזור על פעולה זו פעם אחת כדי להניב ~ 20 μl של רנ"א.
- לבצע את טיפול DNase אני במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- לכמת את הרנ"א על ידי ספקטרופוטומטר עם הספיגה ב 260 ננומטר. היחס של צפיפות אופטית באורכי גל של 260 ננומטר ו -280 ננומטר משמש כדי להעריך את טוהרRNA (ראה טבלה 1) 15.
ניתוח ביטוי גנים 6.
הערה: ביטוי גנים של מיני RNA ארוכים (כמו mRNAs וlncRNAs) מוצג בשלב 6.1 ומיני RNA קצרים (כמו רנ"א) מוצג בשלב 6.2. ערכות שונות זמינות עבור RT-qPCR והסכום של RNA הנדרש משתנה בהתאם לערכה (קטן כמו 10 ng). ניתוח רצף RNA מתואר ב6.3.
- לתמלל הפוך (RT) RNA לcDNA ערבוב 5 μl של 20 ng / μl מדגם RNA עם 5 μl של מיקס מאסטר RT (חיץ RT, dNTP של, פריימרים אקראיים, אנזים RT, מעכב RNase). דגירה התגובה במשך 25 דקות ב -25 מעלות צלזיוס, אז 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5 דק 'על 85 מעלות צלזיוס.
- לדלל את תגובת RT 1:10 עם מים RNase ללא ולהשתמש 2.5 μl לכל תגובת qPCR 10 μl עם פריימרים או קבוצות פריימר / בדיקה לגנים של עניין.
הערה: כדי להקל על ניתוח של RNA המושפל חלקית מומלץ להשתמש פריימרים FOr amplicons קצרה (פחות מ -100 נ"ב) 16. (טבלת 2 ב)- לניתוח ביטוי microRNA להפעיל את תגובת RT על ידי ערבוב 5 μl של 2-10 ng / μl מדגם RNA עם 5 μl של מיקס מאסטר RT.
הערה: כל טכנולוגיית זיהוי מיקרו-רנ"א PCR מבוסס מסחרי-זמינה מחייבת השימוש בפריימרים RT קניינית וספציפיים.
- לניתוח ביטוי microRNA להפעיל את תגובת RT על ידי ערבוב 5 μl של 2-10 ng / μl מדגם RNA עם 5 μl של מיקס מאסטר RT.
- לחלופין או בנוסף לRT-PCR, להשתמש רצף הדור הבא (RNA-seq או קטן-רנ"א-seq) לכמת מינים שונים של RNAs. בדרך כלל, להשתמש 500 ננוגרם של רנ"א להליך זה (לוח 3) ולבצע את השיטה כפי שצוין על ידי יצרן המכשיר וזיהוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר קודם שהראינו את השימוש של LCM לאסוף רקמות אפיתל וסטרומה להשוות פרופיל ביטוי על ידי RT-qPCR של mRNA ומייקרו RNA מרקמות ערמונית קפוא וFFPE מאותו החולה 4. LCM זמן רב, במיוחד אם כמות גדולה של RNA היא שתיגבה עבור ניתוח רצף של הדור הבא. לכן, חשוב לשמור על מרחב העבודה והכלים RNase חופשיים. מומלץ לבחון בקרות איכות ותא-סגוליות בRNA שנאסף (דן בפירוט רב יותר בסעיף הבא). איור 1 מציג קטע ערמונית מוכתם בשקופית PEN-מסגרת מתחת למיקרוסקופ לפני ואחרי אפיתל השפיר לכידה-הלייזר .
לאחר המדגם נאסף וRNA מופק בקפידה, חשוב להעריך את האיכות וכמות RNA כפי שמוצג בטבלה 1. אין זה נדיר להתבונן 260/280 יחסי ננומטר נמוכים. ריכוז RNA יהיהלשפר את יחסי 260/280 ננומטר, אבל זה יכול גם לגרום לאובדן של מיני RNA קטנים. בנוסף לבקרת איכות, חשוב לבחון בקרות סוג ספציפי תא כדי לאשר את הספציפיות של האזור-נתפס הלייזר של הרקמה (איור 1 ב - C). לדוגמא, באיור 1 הביטוי של גן AMACR נמדד כדי לאשר רקמת האפיתל בסרטן הערמונית בהשוואה לרקמת האפיתל נורמלית ,. באיור 1C הביטוי של NKX3.1 אישר העדר סטרומה במדגם-נאסף LCM. האיכות של RNA בדגימה גם יכולה להיות compareed לRNA של ידוע, RNA באיכות טובה. ערכי RT-qPCR Ct לRNAs מבודד מרקמת LCM-collected- נמצאים באותו הטווח כמו RNA שנאסף מתאי האפיתל עיקריים תרבותיים, המאשר את איכות של RNA הארוך וקטן שחולץ (טבלה 2). לבסוף, הטבלה 3 מראה כי RNA זה הוא באיכות מספיק לsequenci RNA של הדור הבאng.
איור 1: אוסף של האפיתל שפיר, האפיתל סרטן הערמונית וסטרומה מערמונית אנושית על ידי מיקרו לנתיחה לייזר ללכוד ביופסיה של ערמונית () מוכתמת בtoluidine הכחול לפני ואחרי LCM-אוסף של האפיתל השפיר.. (ב - ג) רקמות שנאספו על ידי LCM מ -45 חולים להביע סמנים גנטיים מתאימים של זהות סלולרית 7. AMACR (B) הוא סמן של סרטן הערמונית וניתן לזהות רק ברקמות סרטן. NKX3.1 (ג) הוא סמן של האפיתל ולא להבחין ברקמות סטרומה. נתון זה הוא שונה מGiangreco et al., JSBMB 2,015 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1: איכות וכמות RNA מרקמת ערמונית שנאסף LCM.
טבלה 2: RT-qPCR מאפיתל השפיר LCM נאסף הערמונית.
טבלה 3: RNAseq מרקמת ערמונית שנאסף LCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביטוי גני פרופיל מדגימות אנושיות יכול להיות מאתגר, לא רק לאיכות או כמות הרקמה זמינה, אלא גם לגופים היסטולוגית השונים קיימים בדגימת רקמה נתון. זה מאתגר במיוחד בערמונית שבו רקמות שפירות הן במידה רבה רקמות ואזורים של סרטן סטרומה הן נטולי סטרומה. LCM מאפשר הפרדה פיזית של סטרומה הערמונית ו- RNA האפיתל לחתימה מדויקת יותר של שני סוגי התאים השונים (איור 1 א). בהשוואה לmacrodissection או עיבוד רקמות שלם, LCM יכול להפריד תאי תאים ברקמות שפירות, אך באופן משמעותי יותר יקר ועבודה אינטנסיבית.
כמו בכל טכניקה יש מלכודות אפשריות. לדוגמא, איכות RNA יכולה להיות חלקית מושפלת במהלך רכש דגימה ראשוני או במהלך הליך LCM וחילוץ. במקרה הראשון, ביטוי גנים יכולים להיות מושגת על מדידת ampl הקצר שונהסמלים על ידי qPCR. במקרה השני, טיפול חינם קפדן RNase של כל הכלים והחומרים יש לנקוט כדי למנוע השפלה RNA, כמו גם טיפול ועיבוד מדוקדק של סעיפי רקמות. יתר על כן, הגבלת הזמן בילה על שקופית אחת פחות מ 90 דק 'שומרת על איכות RNA בתהליך האיסוף. המגבלה הגדולה ביותר של טכניקת LCM היא הגישה למכשיר LCM והיא העבודה הנדרשת כדי לעשות LCM.
ישנם מספר סוגים של מיקרוסקופי microdissection לייזר ללכוד זמינים. פרוטוקול זה מתאר שימוש בLCM המשתמש בליזר כדי להותיר את האזורים, שאז נופל לכובע אוסף להלן. סוג זה של LCM הוא אידיאלי להפרדה של האפיתל וסטרומה ברקמת ערמונית אשר מכילה אזורים רב-תאיים בדידים לאסוף, אבל זה סוג של LCM אינו מתאים לתאים בודדים בודדים בידוד מרקמה. לדוגמא, לא אמור לשמש בפרוטוקול זה כדי לאסוף מקרופאג התושב ים, תאים נוירואנדוקריניים או לימפוציטים הסתננות, אשר לעתים קרובות נוכחי כתאים בודדים. יש מכשירים אחרים LCM ושיטות לנצל לייזר ל" לירות "תאים בודדים מהרקמה על כובע קרום, המאפשר בידוד של סוגי תאים אחרים אלה.
לא ניתן להתעלם בקרת איכות יסודית ואפיון של RNA. הספיגה ב 260 ננומטר מתאימה לכמת RNA ללימודי RT-qPCR (טבלה 1), אבל לשיטה מבוססת-צבע בצורה מדויקת יותר רצף-רנ"א מכמתת את RNA. נושא חשוב נוסף בניתוח RT-qPCR הוא כדי למנוע הטיה פוטנציאלית מזיהום הדנ"א שייר. זה יכול להיות מושלם על ידי שימוש בצבעי יסוד כי היקף אינטרונים. יש גם ההטרוגניות מטופל גבוהה בביטוי גני סוכנת בית, ולכן שימוש בגני סוכנת בית מרובים הוא הציע ואנחנו משתמשים בדרך כלל 04:57 4,7-9 (איור 1 ב - C וטבלה 2).
s = "jove_content"> הבחירה של שיטת פרופיל ביטוי גנים אינו מבוסס רק על הכמות של RNA שנאסף, אלא גם על הסוג של נתונים שהאדם רוצה לרכוש ולהשוות. RT-qPCR הרגיל הוא רגיש יותר מרצף העמוק של הדור הבא, ודורש כמות קטנה יחסית של RNA וכך להקטין את זמן הליך LCM 4. רצף RNA של הדור הבא הוא טכניקה יעילה לכמת את הביטוי הן למיני RNA קצרים וארוכים. רצף של הדור הבא גם מאפשר גילוי של מיני RNA רומן 13. למרבה המזל, את העלות של רצף הדור הבא נמצאת במגמת ירידה.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר בידוד RNA של אוכלוסיות הומוגניות של תאי האפיתל או סטרומה מרקמת ערמונית קפוא. RNA יכול לשמש לטכניקות ניתוח במורד הזרם רבות כדי לספק כלי לביטוי גנים ספציפי לסוג תא מדויק בערמונית שפירה וחולה. סוג זה של נתונים תורם לידיעההבנה של איך ד ביטוי RNA שונה בפתולוגיה מחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
