הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

תקציר

פני התא של הצמח הם הממשק שלו לתפיסת רמזים סביבתיים; הוא מגיב בשינויים ביולוגיים של התא כגון סחר בממברנות וסידור מחדש של השלד התא. ניתוח תמונה בזמן אמת וברזולוציה גבוהה של אירועים תוך-תאיים כאלה יגביר את ההבנה של הביולוגיה של תאי הצמח ברמה המולקולרית. מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בזווית משתנה (VAEM) היא טכניקה מתפתחת המספקת תמונות באיכות גבוהה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית על פני תא הצמח. במאמר זה מתוארים נהלים מעשיים להכנת דגימות VAEM, התאמת המערכת האופטית VAEM, לכידת סרטים וניתוח תמונה. כדוגמה לתצפית VAEM, מוצגות תוצאות מייצגות על הדינמיקה של PATROL1. זהו חלבון חיוני לתנועת הפיוניות, שנחשב מעורב בהעברת משאבת פרוטונים לממברנות פלזמה בקומפלקס הפיוניות של Arabidopsis thaliana. תצפית בזמן אמת של VAEM על תאי שמירה ותאי משנה בקוטילדון A. thaliana הראתה כי PATROL1 מתויגים פלואורסצנטיים הופיעו כמבנים דמויי נקודות על ממברנות פלזמה למשך מספר שניות ואז נעלמו. ניתוח קימוגרף של נתוני סרטי VAEM קבע את התפלגות הזמן של הנוכחות (המכונה 'זמן מגורים') של המבנים דמויי הנקודות. השימוש ב-VAEM נדון בהקשר של דוגמה זו.

מבוא

פני השטח של תא הצמח, כולל קרום הפלזמה והציטופלזמה הסמוכה אליו, הוא האזור העיקרי של תפיסת תא הצמח ושילוב של רמזים ביוטיים ואביוטיים מהסביבה החוץ-תאית. בתגובה לרמזים אלה, רכיבי פני התא כולל חלבוני קרום הפלזמה והשלד הציטולוגי בקליפת המוח עוברים שינויים דינמיים, בסולם זמן של שניות עד דקות^1-4. לפיכך, הדמיה בזמן אמת וברזולוציה גבוהה של חלבונים פלואורסצנטיים על פני התא יכולה להאיר את תגובות הצמח לרמזים סביבתיים ברמה המולקולרית.

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הוא כלי רב עוצמה לקביעת לוקליזציה של חלבון מתויג פלואורסצנטי³, עם זאת, לעתים קרובות קשה לנטר את דינמיקת החלבון בזמן אמת בגלל זמני הלכידה הארוכים יחסית שלו. טכניקה מתפתחת ....

פרוטוקול

1. הכנת השתילים

1. לעקר את הזרעים.
   1. הכן את פתרון העיקור על ידי הוספת 500 μl NaClO (כלור זמין: 5.0%) ו1 μl 10% מים סטריליים 500 μl טריטון-100 X.
   2. א 10 המהונדס בערך מקום thaliana זרעי ביצוע GFP-PATROL1 ⁸ לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   3. הוסף 1 מיליליטר 70% אתנול פתרון, ומערבבים היטב על ידי היפוך חמש פעמים. השאר דקות 1.

תוצאות

במאמר זה וידאו, הפרוטוקולים לתצפית VAEM של ה- GFP-PATROL1 בא תאים מורכבים הפיוניות טבורית thaliana מסופקים. הרכבת ירידת שמים היא שיטת הכנה פשוטה שעשויות לעזור להפחית את ההתרחשות של בועות אוויר בהכנות VAEM של א ' פסיגים thaliana (איור 1). Overtilting של לייזר הכניסה ו / או Z-מיצוב של דגימות לVAEM יספק תמונה ברורה. אם זה יקרה, זה מומלץ להתחיל שוב מעמדה מייד מעל המדגם, כמו להישפט על ידי תאורת epifluorescence. לאחר הניסיון של כמ.......

דיון

במאמר זה וידאו, ניתנים פרוטוקולים לניטור ומדידת ההתנהגות הדינמית של נקודות GFP-PATROL1 במתחם הפיוניות של thaliana ארבידופסיס. כפי שניתן לראות כאן, התבוננות VAEM היא כלי רב עוצמה עבור הדמיה חיה של משטחי תאי צמח. תחת תנאי הניסוי משמשים כאן לניטור GFP-PATROL1, היה photobleaching הקרינה קטן מאוד במדגם המשמש ל1 דקות של לכידת וידאו, כי EM-CCD רגיש מאוד מתיר את השימוש בליזר עירור חלש יחסית באופטיקה VAEM. מרכוז לייזר והתמקדות, לפני תחילת כל ניסוי, חשובים לתצפית VAEM מוצלחת. משתמש.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	IX-73
יחידת TIRF	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF עדשה אובייקטיבית	אולימפוס	UAPON 100 ופעמים; אוטירפ	NA = 1.49
תיבת בקרת זווית לייזר	Chuo Seiki	QT-AK
לייזר מוליכים למחצה שאוב אופטית	קוהרנטי	ספירTM LP USB 488-20 CDRH לייזר
510– מסנן פס 550 ננומטר	Olympus	U-FBNA
EM CCD מצלמת	פוטוניקה ImagEM	C9100-13
יחידת שינוי הגדלת מצלמה C	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph	התקנים מולקולריים	MetaMorph גרסה 7.7.11.0
מדריך מיקרוסקופיה TIRF	Olympus	AX7385	הוראות: מערכת תאורת השתקפות פנימית כוללת (הודפס ביפן ב -24 באוגוסט 2012)
שמן טבילה	אולימפוס	שמן טבילה Typr-F	ne = 1.518 (23 מעלות)

תוכנת